專利名稱：L－表－2－肌醇單酮新的制備方法和表肌醇新的制備方法
技術領域：
本發明涉及L-表-2-肌醇單酮的一步制備法，L-表-2-肌醇單酮本身具有生物活性，并且作為合成藥物和其它物質的原料也具有很高的價值，在該方法中使用便宜的原料化合物內消旋肌醇，并在不涉及任何化學合成方法的微生物作用下轉化為L-表-2-肌醇單酮。本發明還涉及表肌醇的有效制備方法，表肌醇本身具有生物活性，并且適于用作藥物，在該方法中，使L-表-2-肌醇單酮化學還原。
L-表-2-肌醇單酮是已知物質，由下列平面結構式(B)表示 或由下列立體結構式(B′)表示 此外，已知表肌醇是化學合成物質，由下列平面結構式(C)表示 或由下列立體結構式(C′)表示 表肌醇是內消旋肌醇的一種立體異構體。
通常已知，肌醇單酮(也稱作五羥基環己酮或脂環族己酮糖)已經由下列方法合成肌醇的生物氧化[A.J.Kluyver和A.Boezaardt″Rec.Tray.Chim.″58，p.956(1939)]，肌醇的酶促氧化[L.Anderson等″Arch.Biochem.Biophys.″78，p.518(1958)]，在鉑催化劑存在下用空氣氧化肌醇[K.Heyns和H.Paulsen″Chem.Ber.″86，p.833(1953)]，或者用氧化劑例如硝酸氧化肌醇[T.Posternak″Helv.Chim.Acta″19，p.1333(1936)]。
已知的可以通過內消旋肌醇(肌醇中的一種)的生物氧化或酶促氧化制備的肌醇單酮只有一種肌醇單酮，即青蟹肌糖(也稱作內消旋肌單酮-2)[A.J.Kluyver和A.Boezaardt″Rec.Trav.Chim.″58，p.956(1939)；L.Anderson等″Arch.Biochem.Biophys.″78，p.518(1958)]。未見任何有關微生物能使內消旋肌醇氧化成為L-表-2-肌醇單酮的報道。L-表-2-肌醇單酮適于用作合成D-手肌醇(縮寫為DCI)的原料[參見U.S.P No.5,406,005]。DCI適于用作治療胰島素耐藥性糖尿病的藥物(WO 90/10439)，并且預期可以用作改善多囊卵巢綜合征的藥物[J.A.Nestler等″NEW Engl.J.Med.″340，p.1314(1999)]。已知的有關L-表-2-肌醇單酮制備方法的報道有(1)合成L-表-2-肌醇單酮的方法在氧化鉑催化劑存在下，用硝酸將內消旋肌醇氧化形成DL-表-2-肌醇單酮(即(±)-表-2-肌醇單酮)的外消旋混合物，然后在氧化鉑催化劑存在下用氫使所得外消旋混合物還原以生成表肌醇，并用微生物弱氧化醋桿菌(Acetobacter snboxydans)使表肌醇微生物氧化以產生L-表-2-肌醇單酮(T.Posternak″Helv.Chim.Acta″29，p.1991(1946))。還報道了(2)合成L-表-2-肌醇單酮的方法在由D-葡糖醛酸化學合成葡糖二醛糖(glucodialdose)后，通過偶姻-縮合可以制備該化合物中的一種(U.S.5,406,005)。
肌醇是由環己烷衍生的六元醇的通用名，并且肌醇包括九種立體異構體。已經發現，天然存在的肌醇包括五種肌醇，即內消旋肌醇、D-手肌醇(chiro-inositol)、L-手肌醇、粘液肌醇和青蟹肌醇(scyllo-inositol)。其他肌醇包括表肌醇、異肌醇(allo-inositol)、新肌醇(neo-inositol)和順肌醇(cis-inositol)。后四種肌醇是非天然存在的肌醇，它們是通過化學合成制備。在非天然存在的肌醇中，表肌醇預期可用作改善精神抑郁和焦慮綜合征的藥物[R.H.Belmaker等，WO 99/22727(PCT專利申請PCT/IL/00523)；和R.H.Belmaker等，″Int.J.Neuropsychopharmacol.″ Vol.1，p.31(1998)]。
已經報道的已知的表肌醇的制備方法是(1)合成表肌醇的方法，包括用硝酸將內消旋肌醇氧化形成D，L-表-2-肌醇單酮外消旋混合物，然后在氧化鉑催化劑存在下用氫還原[T.Posternak″Helv.Chim.Acta″29.p.1991(1946)]；(2)合成表肌醇的方法，包括用鋨酸將環己二烯的二元醇氧化[T.Tschamber等，″Helv.Chim.Acta″75，p.1052(1992)]；(3)合成表肌醇的方法，包括將四氫苯醌氫化[L.OdierEP專利申請公開524082]；和(4)合成表肌醇的方法，包括適當保護粘液肌醇，然后將其被保護的衍生物聯合氧化與還原[K.E.Espelia等，″Carbohydrate Res.″46，p.53(1976)]。還有一種已知的合成表肌醇的方法，包括用合適的還原劑使葡萄糖或半乳糖聯合進行Ferrier環化反應和還原反應[Takahashi等，″J.Org.Syn.Chem.Soc.，Japan″58，p.120(2000)]。
但是，這些已知的L-表-2-肌醇單酮和表肌醇的合成方法不能令人滿意地用于大規模制備表肌醇，因為已知的方法存在如下問題它們操作復雜，涉及環境污染和/或造價太高。因此，一直需要尋求新的方法，該方法可以以工業規模生產L-表-2-肌醇單酮，容易操作、高效，并且該新的方法可以容易并高效地生產表肌醇。本發明的一個目的是提供這樣新的制備L-表-2-肌醇單酮的方法和制備表肌醇的方法，它們滿足上述要求并且顯示出很多優點，而且它們可以有效地生產L-表-2-肌醇單酮或表肌醇。
此外，我們調查了是否具有將內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮活性或能力的微生物廣泛存在于自然界中。結果發現并證實，具有將內消旋肌醇氧化并轉化為L-表-2-肌醇單酮的高活性或能力的某些微生物菌株存在于下列許多分類學品種中屬于革蘭氏陰性菌的各種革蘭氏陰性菌，例如屬于假單胞菌科的黃單胞菌屬(Xanthomonas)或假單胞菌屬(Pseudomonas)的革蘭氏陰性菌；屬于醋酸桿菌科(Acetobacteraceae)的醋酸桿菌屬(Acetobacter)或葡糖桿菌屬(Gluconobacter)的細菌；屬于根瘤菌科(Rhizobiaceae)的土壤桿菌屬(Agrobacterium)的細菌；屬于腸桿菌科(Enterobacteriacea)的歐文氏菌屬(Erwinia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)和耶爾森氏菌屬(Yersinia)的細菌；以及屬于巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)的巴斯德氏菌屬(Pasteurella)或嗜血桿菌屬(Haemophilus)的細菌。在這些微生物菌株中，尤其可以提及的是上述黃單胞菌(Xanthomonas sp.)AB10119，它是具有將內消旋肌醇氧化并轉化為L-表-2-肌醇單酮的高活性或能力的微生物菌株的一個實例。還可以列舉的是假單胞菌屬菌株(Pseudomonas sp.)AB 10215和歐文氏菌屬菌株(Erwiniasp.)10135，它們均是我們從土壤樣品中新近分離出來的。
根據本發明人的上述發現，我們設計了一種L-表-2-肌醇單酮的新的制備方法，如下所述。因此，我們現在發現，當微生物黃單胞菌(Xanthomonassp.)AB10119或假單胞菌屬菌株(Pseudomonas sp.)AB 10215和歐文氏菌屬菌株(Erwinia sp.)10135或其他合適的菌株在需氧條件下，無論是在含有一定量內消旋肌醇、常用碳源和常用氮源的液體培養基中，或是在含有含有一定量內消旋肌醇(其中一部分可以用作碳源)并含有氮源(根據培養條件，如果所述的所用氮源是有機天然氮源，則一部分氮源也可以用作碳源)、而不含任何常用碳源的液體培養基中進行培養，均可以有效地由內消旋肌醇產生L-表-2-肌醇單酮，并使L-表-2-肌醇單酮積聚在所得培養肉湯中。我們還發現，按照上述L-表-2-肌醇單酮新的制備方法，通過從所述培養肉湯中除去微生物的微生物細胞，可以使在所述培養肉湯中積聚的L-表-2-肌醇單酮保持溶解在培養肉湯上清液中，并且通過下述方法可以以高純度產物的形式、有效地回收L-表-2-肌醇單酮用離子交換樹脂如陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂等處理所述培養肉湯上清液，或者用活性炭處理所述培養肉湯上清液，或者處理所述培養肉湯上清液使L-表-2-肌醇單酮結晶，或者采用這些處理的任何組合方式。
此外，本發明人還進行了另一項研究，結果發現，從上述含有L-表-2-肌醇單酮(該L-表-2-肌醇單酮是在所述培養基中培養微生物產生和積聚的)的培養肉湯中除去微生物細胞，得到培養肉湯上清液，并向含有L-表-2-肌醇單酮的所得培養肉湯上清液中直接加入合適量的還原劑如硼氫化鈉或任何與硼氫化鈉等同的氫化物型還原劑，然后將L-表-2-肌醇單酮與還原劑反應，可以有效地將L-表-2-肌醇單酮還原成表肌醇。換句話說，我們發現，通過在培養肉湯上清液中用所述還原劑使L-表-2-肌醇單酮還原，然后從所述培養肉湯上清液中分離L-表-肌醇單酮，可以將L-表-2-肌醇單酮有效地還原成表肌醇。
我們還進行了以下各種試驗用能夠通過使內消旋肌醇氧化將內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的革蘭氏陰性菌、特別是上述黃單胞菌菌株(Xanthomonas sp.)AB 10119處理內消旋肌醇的方法；以及無需從所述培養肉湯上清液中分離L-表-2-肌醇單酮，直接用合適的還原劑處理存在于培養肉湯上清液中的L-表-2-肌醇單酮，以在所述培養肉湯上清液中產生表肌醇的方法。由這些試驗我們得到許多發現。本發明是基于我們所得到的這些發現完成的。
本發明第一方面提供了L-表-2-肌醇單酮的制備方法，其特征在于該方法包括將內消旋肌醇與能夠使內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的微生物反應，由此將內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮，以產生L-表-2-肌醇單酮。
按照本發明第一方面的L-表-2-肌醇單酮的制備方法可以通過下面所述的兩種方法(A)和(B)之一實施。
方法(A)包括在需氧條件下，在含有一定量內消旋肌醇、碳源和氮源的液體培養基中，培養能夠使內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的微生物，由此使所述微生物與內消旋肌醇反應，并在所得培養肉湯中產生和積聚L-表-2-肌醇單酮，然后收獲所述培養肉湯；以及從所得培養肉湯中除去所述微生物的微生物細胞，由此得到含有在其中產生并積聚的L表-2-肌醇單酮的培養肉湯上清液，然后用離子交換樹脂、或者用活性炭處理所述培養肉湯上清液，或者處理所述培養肉湯上清液使L-表-2-肌醇單酮結晶，或者采用這些處理的任何組合方式，由所得培養肉湯上清液中回收L-表-2-肌醇單酮。
方法(B)包括在液體培養基中培養能夠使內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的微生物，然后從所得培養肉湯中分離所述微生物的微生物細胞；將所分離的微生物細胞加至含有溶解于其中的一定量內消旋肌醇的緩沖液或液體培養基中，并使所加入的微生物細胞與在所述緩沖液或所述液體培養基中的內消旋肌醇反應，在所得反應溶液或在所得培養肉湯中將內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮；以及通過用離子交換樹脂、或者用活性炭處理所述反應溶液或所述培養肉湯，或者處理所述反應溶液或所述培養肉湯使L-表-2-肌醇單酮結晶，或者采用這些處理的任何組合方式，回收在所述反應溶液或所述培養肉湯中產生并積聚的L-表-2-肌醇單酮。
在本發明第一方面的方法中所用的微生物可以是任何微生物菌株，只要其具有使內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的活性或能力。
如上所列舉的，有許多細菌可以由內消旋肌醇產生L-表-2-肌醇單酮，如上文所述。例如如上面所解釋的、我們從土壤樣品中分離得到的菌株AB10119、菌株AB 10215和菌株AB 10135，并且它們是用于本發明方法中最有效的菌株。這三種菌株的微生物學性質示于下面表1a、表1b、表1c和表1d中。
我們順便按照題為Shin Saikin Baichigaku Koza(2nd Edition，published by Kindai Shuppan)、《醫學微生物鑒定指南》(A Guide onIdentification of Medical Bacteria(2nd Edition，published by KindaiShuppan))和《細菌學實驗手冊》(A Manual on Practice of Bacteriology(published by Maruzen Publishing Company))的日本教科書的方法進行了試驗，以鑒別上述三種微生物。另外，參照Bergey′s Manual of SystematicBacteriology Vol.1(1984)的方法，對我們的上述試驗結果進行評價，以識別所分離的細菌菌株。表1a-1


表1a-2


表1b


表1c



表1d


上述AB 10119菌株的形態學特征主要為該菌株是革蘭氏陰性柱狀，形成有黃色色素沉著的、0.4-0.6×0.6-4.0μm大小的菌落。該AB 10119菌株是催化酶陽性和氧化酶陰性的，并且在需氧條件下分解葡萄糖產生酸。該AB 10119菌株在基本培養基中生長不良，但是向基本培養基中加入蛋氨酸則獲得該菌株的良好生長。該AB 10119菌株不具有還原硝酸鹽的能力，并且對0.01％甲基綠和硫堇敏感。在菌株AB 10119細胞中的輔酶Q類型是Q8，并且DNA的GC含量是68％。
總結AB 10119菌株的這些形態學性質，可以判斷該菌株是屬于黃單胞菌屬的微生物菌株。按照Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology Vol.1，pp.119-210(1984)，已知的黃單胞菌屬細菌包括五種，即田野黃單胞菌(Xanthomonas campestris)、草莓黃單胞菌(Xanthomonas frapariae)、甘蔗白紋病黃單胞菌(Xanthomonas albilineans)、地毯草黃單胞菌(Xanthomonas axonopodis)和葡萄酒黃單胞菌(Xanthomonas ampelina)。
將AB 10119菌株與上述五種已知菌株的形態學的性質進行比較，結果表明，菌株AB 10119最類似于已知的田野黃單胞菌菌株。然而，由于該AB 10119菌株的形態學性質與那些田野黃單胞菌菌株不完全一致，因此我們將這種新的菌株指定為黃單胞菌(Xanthomonas sp.)AB 10119，以使其與已知的所述菌株區別開來，并且我們已經將其保藏在經認可的日本保藏機構，國立生命科學和人體技術研究所，(National Institute of Bioscienceand Human Technology，Agency of Industrial Science and Technology，座落于1-3，1-chome，Higashi，Tsukuba-City，Ibaraki Prefecture，Japan)，保藏號為FERMP-17382(保藏日期是1999年5月7日)。然后，根據布達佩斯條約，該AB 10119菌株從2000年5月23日起以保藏號FERM BP-7168再保藏于同一保藏機構。
上述AB 10215菌株的形態學特征主要為該菌株是革蘭氏陰性柱狀，形成有淡黃色色素沉著的、0.3-0.5×0.6-6.5μm大小的菌落。該AB 10215菌株是催化酶陽性和氧化酶陰性的，并且在需氧條件下分解葡萄糖產生酸。該AB 10215菌株在基本培養基中生長良好，具有還原硝酸鹽的能力，并且對0.01％甲基綠和硫堇敏感。在菌株AB 10215細胞中的輔酶Q類型是Q8，并且DNA的GC含量是68％。
總結AB 10215菌株的這些形態學性質，該菌株呈現為最類似于已知的Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology Vol.1，pp.140-199(1984)中所述的嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonas maltophilia)菌株。然而，由于該AB10215菌株的形態學性質與已知的嗜麥芽假單胞菌菌株不完全一致，因此我們將這種新的菌株指定為假單胞菌(Xanthomonas sp.)AB 10215，以使其與已知的所述菌株區別開來，并且我們已經將其保藏在經認可的日本保藏機構，國立生命科學和人體技術研究所(座落于1-3，1-chome，Higashi，Tsukuba-City，Ibaraki Prefecture，Japan)，保藏號為FERM P-17804(保藏日期是2000年3月31日)。然后，根據布達佩斯條約，該AB 10215菌株從2000年5月23日起以保藏號FERM BP-7170再保藏于同一保藏機構。
上述AB 10135菌株的形態學特征主要為該菌株是革蘭氏陰性柱狀，形成有乳白色色素沉著的、0.4-0.6×0.8-2.0μm大小的菌落。該AB 10135菌株在需氧和厭氧條件下均分解葡萄糖，但是與其在需氧條件下生長相比，該AB 10135菌株在厭氧條件下生長非常不好。此外，該AB 10135菌株是催化酶陽性和氧化酶陰性的，并且在需氧條件下分解葡萄糖產生酸。該AB10135菌株在普通營養瓊脂培養基中生長極差，但是在營養瓊脂培養基中加入5％蔗糖可以獲得非常大量的生長。在該菌株細胞中的輔酶Q類型是Q8，并且DNA的GC含量是68％。
總結AB 10135菌株的這些形態學性質，可以判斷該菌株屬于歐文氏菌屬。按照Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology Vol.1，pp.469-476(1984)，已知的歐文氏菌屬細菌菌株分為15種，但是AB 10135菌株與任何一種已知的菌株均不完全一致，因此我們將這種新的菌株指定為歐文氏菌(Erwinia sp.)AB 10135，以使其與已知的歐文氏菌株區別開來，并且我們已經將其保藏在經認可的日本保藏機構，國立生命科學和人體技術研究所，(座落于1-3，1-chome，Higashi，Tsukuba-City，Ibaraki Prefecture，Japan)，保藏號為FERM P-17803(保藏日期是2000年3月31日)。然后，根據布達佩斯條約，該AB 10135菌株從2000年5月23日起以保藏號FERMBP-7169再保藏于同一保藏機構。
下面更詳細地描述本發明第一方面的兩種方法，即方法(A)和方法(B)。
在方法(A)中，第一步是在需氧條件下，在含有一定量內消旋肌醇、碳源和氮源的液體營養培養基中，培養能夠使內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的微生物，以在所得培養肉湯中產生和積聚L-表-2-肌醇單酮。
對于該方法所述第一步中使用的液體培養基的組成沒有特別限制，只要其能夠達到預期的目的。所用液體培養基可以是任何培養基，其中含有一定量的內消旋肌醇作為轉化成L-表-2-肌醇單酮的原料，此外，其中含有碳源、氮源、天然有機營養源、無機鹽及其他成分。既可以使用已知的合成培養基、也可以使用已知的天然培養基。可取的是，該步驟所用液體培養基含有0.1％-40％、優選20％-30％內消旋肌醇，含有0.1％-20％、優選0.5％-5％葡萄糖、蔗糖、麥芽糖或淀粉作為碳源，并且含有0.01％-5.0％，優選0.5％-2.0％酵母提取物、胨、酪蛋氨基酸、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨或尿素作為氮源等。此外，有益的是，如果需要，向該液體培養基中加入能夠產生鈉、鉀、鈣、鎂、鈷、錳、鋅、鐵、銅、鉬、磷酸根、硫酸根或其他離子的無機鹽。當所用微生物在所得培養肉湯中氫離子的濃度調節至pH4-10、優選5-9的條件下進行培養時，可以有效地產生L-表-2-肌醇單酮。
微生物的培養條件可以根據微生物菌株和所用培養基的性質發生變化，但是培養溫度可以是5-40℃、優選20-37℃。還優選在需氧條件下，通過振搖液體培養基或向液體培養基中吹入空氣等方法對微生物進行培養。培養周期可以是內消旋肌醇在所得培養肉湯中完全消耗、并且在所得培養肉湯中所產生和積聚的L-表-2-肌醇單酮的量達到最大的一段時間。培養周期通常為1-14天，優選3-10天。因此，在上述方法的第一步中可以得到含有L-表-2-肌醇單酮的培養肉湯。
然后進行第二步驟，其中從培養肉湯中回收所需的L-表-2-肌醇單酮。為此回收目的，可以采用任何從培養肉湯中分離與純化任何普通水溶性和中性物質的常用方法。因此，首先從含有L-表-2-肌醇單酮的所得培養肉湯中除去本發明所用微生物的微生物細胞，然后用活性炭或者用離子交換樹脂處理所得培養肉湯上清液，由此除了L-表-2-肌醇單酮之外，幾乎可以從培養肉湯上清液中除去所有雜質。但是使用OH-型強堿性陰離子交換樹脂不可能有效地進行離子交換樹脂處理，因為OH-型強堿性陰離子交換樹脂可以使L-表-2-肌醇單酮化學分解。此后，可以從已經用活性炭或離子交換樹脂處理過的培養肉湯上清液中分離所需的L-表-2-肌醇單酮，在經過這種方式處理的所述培養肉湯上清液中，L-表-2-肌醇單酮可以從溶液中結晶出來，并且如果需要，可以進一步重結晶。
為了從所述培養肉湯上清液中有效地回收L-表-2-肌醇單酮，更優選的是采取下列步驟，包括將含有所積聚L-表-2-肌醇單酮的培養肉湯上清液通過強酸性陽離子交換樹脂、例如Duolite(注冊商標)C-20(H+型)柱，以除去不需要的成分，收集柱流出液，用去離子水洗滌該柱，收集所得水洗液，將所述流出液與水洗液合并，將所得合并的溶液過弱堿性陰離子交換樹脂、例如Duolite(注冊商標)A368S(游離堿形式)柱，收集所得后一柱的流出液，用去離子水洗滌后一柱，收集所得水洗液，并將后一流出液與后一水洗液合并，得到含有L-表-2-肌醇單酮、而基本上不含任何雜質的水溶液。然后可以將所得水溶液濃縮，得到L-表-2-肌醇單酮的濃縮溶液，然后向其中加入適當量的乙醇。將含有L-表-2-肌醇單酮和乙醇的所得混合物在室溫或更低溫度下放置過夜，L-表-2-肌醇單酮可以以純的結晶形式結晶出來。在本發明第一方面的上述方法(B)中，進行幾個步驟，包括在培養基中培養具有所需能力的微生物，從所得培養肉湯中分離所述微生物的微生物細胞，并將分離的微生物細胞加至含有內消旋肌醇的緩沖溶液或液體培養基中，然后使所述微生物細胞與內消旋肌醇在所述緩沖溶液或所述液體培養基中反應，以在由所述緩沖溶液或所述液體培養基得到的反應溶液中產生L-表-2-肌醇單酮。
作為內消旋肌醇與微生物細胞反應步驟中所用的微生物細胞，可以使用從方法(A)的第一步驟得到的培養肉湯中分離收集的細胞，或者可以使用在適當的培養條件下、在獨立的步驟中培養所述微生物獲得的細胞。按照分離微生物細胞的已知方法，通過離心、過濾或采用其他方法處理培養肉湯，可以從培養肉湯中有效地收集微生物細胞。
作為內消旋肌醇與微生物細胞反應中所用的反應培養基，既可以使用液體培養基，又可以使用緩沖溶液。作為所述液體培養基，可以使用與前述方法(A)第一步驟中所用的培養基具有類似組成的培養基。還可以使用如下的液體培養基，該培養基由所述培養肉湯上清液組成，所述培養肉湯上清液是通過在分離的步驟中培養所述微生物，然后從所得培養肉湯中除去微生物的微生物細胞獲得的。可以使用濃度為10-500mM、優選20-100mM的磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液或Good′s CHES緩沖液等作為所述的緩沖液。內消旋肌醇在內消旋肌醇溶解于緩沖液或液體培養基中的溶液中的起始濃度優選為0.1-40％(重量)。
內消旋肌醇與微生物細胞有效反應的反應條件可以根據所用微生物菌株和培養基或緩沖液的性質而變化。通常，反應溫度可以是5-60℃、優選10-45℃，反應時間可以是1-50小時，優選3-48小時。液體培養基或緩沖液的pH可以是2-10，優選3-9。
在內消旋肌醇與微生物細胞的反應完成后，可以按照與上述方法(A)第二步驟中所用同樣的方法，從所得反應溶液中分離目的產物L-表-2-肌醇單酮。
本發明第二方面提供了表肌醇的制備方法，其特征在于該方法包括在含水反應介質中，將能夠使內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的微生物與內消旋肌醇反應，以在所述含水反應培養基中生成L-表-2-肌醇單酮，由此得到含有所述微生物的微生物細胞的以及在其中產生的L-表-2-肌醇單酮的所得反應溶液，從所述反應溶液中除去微生物細胞，得到含有L-表-2-肌醇單酮的反應溶液濾液，向含有L-表-2-肌醇單酮的所述反應溶液濾液中直接加入適當的還原劑，并使還原劑與L-表-2-肌醇單酮反應，生成表肌醇和內消旋肌醇。
本發明第二方面的該方法在實踐中可以通過下列方法(C)、(D)和(E)三種方法之一進行。
本發明第二方面的方法(C)包括步驟一(第一階段)，在需氧條件下、在由含有一定量內消旋肌醇、碳源和氮源的液體培養基組成的含水基質中，按照與本發明第一方面方法的方法(A)中所述相同的培養微生物的步驟，培養能夠將活性內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的微生物，以使內消旋肌醇與所述微生物在液體反應基質或所得培養肉湯中反應，由此將內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮，并在所述培養肉湯中產生和積聚L-表-2-肌醇單酮，如此得到培養肉湯，即含有所述微生物的微生物細胞和L-表-2-肌醇單酮的所得反應溶液；和步驟二(第二階段)，從所得到的培養肉湯、即所述反應溶液中除去所述微生物的微生物細胞，由此得到培養肉湯上清液，即含有所產生的L-表-2-肌醇單酮(無需進行L-表-2-肌醇單酮的分離)的反應溶液濾液；以及步驟三(第三階段)，向所得培養肉湯上清液(即所述反應溶液濾液)中直接加入堿金屬硼氫化物、堿金屬三烷氧基硼氫化物或堿金屬硼氰化物作為還原劑，使L-表-2-肌醇單酮與該還原劑進行還原反應，由此在所述培養肉湯上清液(即所述反應溶液濾液)中產生表肌醇和內消旋肌醇；第四步(第四階段)，從所得還原反應的反應溶液、即含有所產生的表肌醇和內消旋肌醇的培養肉湯上清液中回收表肌醇和內消旋肌醇；以及第五步(第五階段)，將所回收的表肌醇與內消旋肌醇彼此分離。
本發明第二方面的方法(D)包括步驟一(第一階段)，在需氧條件下、在含有碳源和氮源的液體培養基中，按照與本發明第一方面方法的方法(B)中所述相同的培養微生物的步驟，培養能夠將活性內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的微生物，由此得到所述微生物的培養肉湯，然后從所得培養肉湯中分離所述微生物的微生物細胞；步驟二(第二階段)，在由含水緩沖液或液體培養基組成的含水反應基質中，將所分離的所述微生物的微生物細胞與內消旋肌醇反應，由此在所述液體反應基質中產生L-表-2-肌醇單酮；步驟三(第三階段)，從所得到的含有所述微生物的微生物細胞以及在其中生成的L-表-2-肌醇單酮的所得含水反應溶液中除去所述微生物的微生物細胞，由此得到已經除去微生物細胞、而L-表-2-肌醇單酮仍溶解于其中的所得反應溶液濾液；步驟四(第四階段)，向所述反應溶液濾液中加入堿金屬硼氫化物、堿金屬三烷氧基硼氫化物或堿金屬硼氰化物作為還原劑，使L表-2-肌醇單酮與所述還原劑進行還原反應，由此在所述反應溶液濾液中產生表肌醇和內消旋肌醇；第五步(第五階段)，從所得含有所產生的表肌醇和內消旋肌醇的還原反應的反應溶液中回收表肌醇和內消旋肌醇；以及第六步(第六階段)，將所回收的表肌醇與內消旋肌醇彼此分離。
本發明第二方面方法的方法(E)是上述方法(C)和(D)的改進方法。方法(E)包括如下的方法，其中在L-表-2-肌醇單酮與所加入的還原劑進行還原反應之前，進行這樣一個預備步驟，即，將由含有L-表-2-肌醇單酮的培養肉湯上清液或反應溶液濾液組成的含水基質的pH調至pH8-12的堿性pH范圍；然后進行的步驟是，向含有L-表-2-肌醇單酮和pH8-12的該堿性含水介質中加入堿金屬硼氫化物、堿金屬三烷氧基硼氫化物或堿金屬硼氰化物作為還原劑，使L-表-2-肌醇單酮與所述還原劑進行還原反應。按照方法(E)，可以以表肌醇產率遠遠大于副產物內消旋肌醇產率的方式產生所需的表肌醇。
本發明第二方面的方法所用的微生物可以與本發明第一方面的方法所用的微生物相同，是能夠將內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的微生物。
下面更詳細地解釋本發明第二方面方法的上述方法(C)和(E)。
簡要地說，在本發明第二方面方法的方法(C)中，第一階段包括用具有所需能力的微生物接種含有一定量內消旋肌醇的營養液體培養基，在需氧條件下培養接種的微生物，由此轉化內消旋肌醇，并在所得培養肉湯中產生和積聚L-表-2-肌醇單酮，收獲含有所需L-表-2-肌醇單酮的培養肉湯；第二階段包括從所收獲的培養肉湯中回收微生物細胞，得到含有L-表-2-肌醇單酮的培養肉湯上清液；第三階段包括向所述培養肉湯上清液中直接加入合適的還原劑、而不從培養肉湯上清液中分離L-表-2-肌醇單酮，然后進行L-表-2-肌醇單酮的還原反應；以及第四階段包括從所得反應溶液中回收所產生的表肌醇。
因此，本發明第二方面方法的方法(C)由進行第一階段開始，包括在含有一定量內消旋肌醇的液體培養基中培養具有所需能力的微生物，以使內消旋肌醇轉化，并在所得培養肉湯中產生和積聚L-表-2-肌醇單酮，收獲含有L-表-2-肌醇單酮的培養肉湯。該第一階段可以按照與前述方法(A)第一步驟完全相同的方式進行。
在方法(C)的第二階段，從所述第一階段收獲的培養肉湯中回收所述微生物的微生物細胞，得到含有L-表-2-肌醇單酮的培養肉湯上清液。在隨后的第三階段，將氫化物作為還原劑直接加入所得培養肉湯上清液中之后進行L-表-2-肌醇單酮的還原反應，在所述培養肉湯上清液中產生表肌醇和內消旋肌醇。所用還原劑可以是能夠使L-表-2-肌醇單酮在含水基質中還原成表肌醇的那些。可取的還原劑是例如硼氫化鈉、硼氫化鋰、硼氫化鉀、三甲氧基硼氫化鈉或氰基硼氫化鈉。還原反應可以在0℃至室溫的溫度范圍內進行。當L-表-2-肌醇單酮完全消耗、或者所需反應產物的量達到預期的適當水平時，即為還原反應的終點。因此，在該第三階段中，得到了含有所產生的表肌醇和內消旋肌醇的培養肉湯上清液作為還原反應的反應溶液。
然后進行第四階段，即，從第三階段得到的作為還原反應的反應溶液的培養肉湯上清液中回收所產生的表肌醇和內消旋肌醇。在該回收的第四階段中，優選下列方法，包括將第三階段得到的所述含表肌醇和內消旋肌醇的培養肉湯上清液通過強酸性陽離子交換樹脂、例如Duolite(注冊商標)C-20(H+型)柱，以除去不需要的成分，收集柱流出液，用去離子水洗滌該陽離子交換樹脂柱，收集所得水洗液，將所述流出液與水洗液合并，將所得合并的溶液過弱堿性陰離子交換樹脂、例如Duolite(注冊商標)A113(OH-形式)柱，收集所得后一柱的流出液，用去離子水洗滌后一陰離子交換樹脂柱，收集所得水洗液，并將后一流出液與后一水洗液合并，得到含有表肌醇和內消旋肌醇、而基本上不含任何雜質的水溶液。
在方法(C)的最后一步(第五階段)中，從上述第四階段中得到的表肌醇和內消旋肌醇的水溶液中將表肌醇和內消旋肌醇彼此分離出來。為了分離這些產物，優選采取如下方法，該方法包括減壓濃縮所述表肌醇和內消旋肌醇的水溶液，使所得濃縮物通過強堿性陰離子樹脂、例如Amberlite(注冊商標)CG-400(OH-型)柱，然后用去離子水洗脫該陰離子樹脂柱，分別收集含有大部分內消旋肌醇的洗出液餾分和含有所需表肌醇的洗出液餾分作為獨立的餾分。將含有表肌醇的水溶液(洗出液餾分)濃縮，向所得表肌醇濃縮溶液中加入適當量的乙醇。將所得混合物在室溫或更低溫度下放置過夜，使純的L-表-2-肌醇單酮產物以結晶的形式結晶出來。
此外，對于方法(C)，如果方法(C)的第四階段是如下進行，即含有還原反應產生的表肌醇的培養肉湯上清液用系列排列的多個離子交換樹脂柱處理，則可以得到含有表肌醇和內消旋肌醇、但是基本上不含雜質的水溶液。根據我們的發現，如果按照下列方法進行方法(C)的第五階段，可以將表肌醇與內消旋肌醇有效地分離開，所述方法包括將上述含有表肌醇和內消旋肌醇、但是基本上不含雜質的水溶液濃縮；使所得濃縮液通過強酸性陽離子交換樹脂柱，該樹脂柱含有帶磺酸基作為離子交換基團的苯乙烯聚合物(Ca2+型)、例如Diaion(注冊商標)UBK 520M(Ca2+型)；由此將表肌醇和內消旋肌醇吸附在所述柱上；然后用去離子水洗脫該柱。
簡要地說，在本發明第二方面方法的方法(D)中，第一階段包括在需氧條件下、在液體營養培養基中，培養具有所需能力的微生物，并從所得培養肉湯中分離所述微生物的微生物細胞，由此得到大量所述的微生物細胞；第二階段包括，在由含一定量溶解于其中的內消旋肌醇的緩沖液或液體培養基組成的含水反應基質中，將所分離的微生物細胞與內消旋肌醇反應，由此在所述含水反應基質中產生L-表-2-肌醇單酮；第三階段包括，從所得反應溶液中除去微生物細胞，得到含有L-表-2-肌醇單酮的反應溶液濾液；第四階段包括，向所述反應溶液濾液中加入合適的還原劑、而無需從所述反應溶液濾液中分離L-表-2-肌醇單酮，使L-表-2-肌醇單酮還原，由此在所述濾液中產生表肌醇和內消旋肌醇；第五階段包括，從所得還原反應溶液中回收所產生的表肌醇和內消旋肌醇；以及第六階段包括，將所回收的表肌醇與內消旋肌醇彼此分離。
在方法(D)的第一階段中，在需氧條件下、在常用的液體培養基中，培養能夠將內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的微生物，并從所得培養肉湯中分離所述微生物的微生物細胞。所分離的微生物細胞用于方法(D)的第二階段。作為所述微生物細胞，可以使用從前述方法(A)的第一步驟得到的培養肉湯中分離收集的該微生物細胞。也可以使用在適當的培養條件下、在獨立的步驟中培養該適用微生物獲得的該微生物細胞。通過離心、過濾或采用其他已知方法處理培養肉湯，可以有效地分離和收集微生物細胞。
在方法(D)的第二階段中，作為內消旋肌醇與微生物細胞反應中所用的液體反應基質，既可以使用含水緩沖液，又可以使用液體培養基。這里所用的液體培養基，可以使用與前述方法(A)第一步驟中所用的類似培養基。可以使用濃度為10-500mM、優選20-100mM的磷酸鹽緩沖液、Good′sCHES緩沖液等作為所述的緩沖液。內消旋肌醇在所述含水反應基質中的濃度優選為0.1-30％(重量)。微生物細胞與內消旋肌醇反應的條件可以根據所用微生物、緩沖液或液體培養基的性質而變化。反應溫度是5-60℃、優選10-45℃，反應時間是1-50小時，優選3-48小時。用作含水反應基質的緩沖液或液體培養基的pH是2-10，優選pH3-9。微生物細胞與內消旋肌醇在第二階段的反應得到了含有L-表-2-肌醇單酮的反應溶液。
在方法(D)的第三階段，采用已知的方法如離心、分離等，從方法(D)第二階段得到的含L-表-2-肌醇單酮的反應溶液中分離所述微生物的微生物細胞。由此得到含有L-表-2-肌醇單酮的反應溶液濾液。在隨后的第四階段，將氫化物作為還原劑加入含有L-表-2-肌醇單酮的反應溶液濾液中之后進行L-表-2-肌醇單酮的還原反應。由此產生表肌醇和內消旋肌醇。該第四階段的還原反應可以按照與方法(C)第三階段所述同樣的方式進行。
然后進行第五階段，即，從上述還原反應所得的含有表肌醇和內消旋肌醇的反應溶液中以水溶液形式回收表肌醇和內消旋肌醇。然后進行從含有表肌醇和內消旋肌醇的所述水溶液中回收表肌醇的第六階段。該方法(D)的第五和第六階段可以按照與方法(C)第四和第五階段所述同樣的方式進行。
本發明第二方面方法的上述方法(E)以如下方式進行在進行本發明第二方面方法的方法(C)第二階段或方法(D)第四階段即向上述培養肉湯上清液或反應溶液濾液中加入堿金屬硼氫化物型還原劑，使L-表-2-肌醇單酮還原之前，進行一個預備步驟，即，通過加入氫氧化鈉或氫氧化鉀或碳酸鈉或碳酸鉀，將所述培養肉湯上清液或所述反應溶液濾液的pH調至pH8-11、優選9-10，在所述預備步驟之后，L-表-2-肌醇單酮與所加入的還原劑進行還原反應。我們從另一項研究中發現，與未經調節還原反應的反應基質的pH、并且通常在pH5-7的反應基質中進行的反應相比，當如上所建議將所述還原反應的反應基質的pH調節至堿性pH時，由該還原反應產生的表肌醇的產量增加1.3-1.5倍，而副產物內消旋肌醇的產量減少1/2-1/4倍，所以在pH5-7進行的L-表-2-肌醇單酮的還原反應產生6-7份表肌醇/3-4份內消旋肌醇。按照方法(E)，在pH8-11的含水反應基質中用氫化物試劑還原L-表-2-肌醇單酮，可以以表肌醇產率遠遠大于副產物內消旋肌醇產率的方式產生表肌醇。
上述菌株AB 10119、AB 10215和AB 10135是新的微生物，并且均適用于由內消旋肌醇制備L-表-2-肌醇單酮。因此，本發明第三方面提供了新微生物黃單胞菌(Xanthomonas sp.)AB 10119，該微生物能夠使內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮，并且已經保藏在日本保藏機構，國立生命科學和人體技術研究所，保藏號為FERM BP-7168。
本發明第四方面提供了新微生物假單胞菌(pseudomonas sp.)AB10215，該微生物能夠使內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮，并且已經保藏在日本保藏機構，國立生命科學和人體技術研究所，保藏號為FERMBP-7170。
本發明第五方面提供了新微生物歐文氏菌(Erwinia sp.)AB 10135，該微生物能夠使內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮，并且已經保藏在日本保藏機構，國立生命科學和人體技術研究所，保藏號為FERM BP-7169。
按照本發明的第一和第二方面，可以工業規模和經濟合算的快速生產高純度的L-表-2-肌醇單酮，該L-表-2-肌醇單酮適于用作合成藥物和農業化學品、以及用作的藥物的表肌醇的原料。
該培養肉湯上清液經高效液相色譜(HPLC)分析，測量條件如下所示。結果證明，在所述肉湯上清液中產生了濃度為66mg/ml的L-表-2-肌醇單酮(由內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的轉化率為55.6％)。與此同時，在所得的上述肉湯上清液中未檢測到內消旋肌醇。
上述由內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的轉化率是通過以下等式計算的L-表-2-肌醇單酮的轉化率(％)＝[1毫升肉湯上清液中所含L-表-2-肌醇單酮的摩爾數÷1毫升液體培養基中最初所含內消旋肌醇的摩爾數]×100高效液相色譜分析的測量條件如下柱Wakosil 5NH24.6×350mm柱溫40℃監測器RI DETECTOR ERC-7515A(ERMA CR.INC.)上清液的注入量20μl洗脫溶劑乙腈-水(4∶1)L-表-2-肌醇單酮的洗脫時間；6.7分鐘(2)制備L-表-2-肌醇單酮(第二個實驗)向每一只500毫升容量的折流板錐形瓶中倒入每份100毫升的液體培養基(總共400毫升)，其中含有25.0％(250mg/ml)內消旋肌醇、1.0％葡萄糖和0.7％酵母提取物，未調節pH。然后，將含有培養基的燒瓶在高壓滅菌器中滅菌。在每只燒瓶經滅菌處理的培養基中接種黃單胞菌(Xanthomonas sp.)AB 10119菌株(保藏號為FERM BP-7168)，并在27℃和振搖下將接種的細菌菌株培養5天。離心(8000rpm，20分鐘)所得培養肉湯，得到培養肉湯上清液。
該培養肉湯上清液經高效液相色譜(HPLC)分析，測量條件如上所示。結果證明，在所述肉湯上清液中產生了濃度為247mg/ml的L-表-2-肌醇單酮(轉化率為99.9％)。與此同時，在所得的上述肉湯上清液中未檢測到內消旋肌醇。
上述由內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的轉化率是通過上面給出的等式計算的。(3)制備L-表-2-肌醇單酮(第三個實驗)向每一只500毫升容量的折流板錐形瓶中倒入每份100毫升的液體培養基，其中含有4.0％(40mg/ml)內消旋肌醇、0.2％酵母提取物、0.1％(NH4)2SO4、0.7％K2HPO4、0.2％KH2PO4和0.01％MgSO47H2O，并且pH為7。然后，將燒瓶在高壓滅菌器中滅菌。在每只燒瓶經滅菌處理的培養基中接種歐文氏菌(Erwinia sp.)AB 10135菌株(保藏號為FERMBP-7169)，并在27℃和振搖下將接種的細菌菌株培養5天。離心(8000rpm，20分鐘)所得培養肉湯，得到培養肉湯上清液。
該培養肉湯上清液經高效液相色譜(HPLC)分析，測量條件如上所示。結果證明，在所述肉湯上清液中產生了濃度為22mg/ml的L-表-2-肌醇單酮(轉化率為55.6％)。與此同時，在所得的上述肉湯上清液中未檢測到內消旋肌醇。
上述由內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的轉化率是通過上面給出的等式計算的。(4)制備L-表-2-肌醇單酮(第四個實驗)向每一只500毫升容量的折流板錐形瓶中倒入每份100毫升的液體培養基(總共400毫升)，其中含有25.0％(250mg/ml)內消旋肌醇、1.0％葡萄糖和0.7％酵母提取物，未調節pH。然后，將燒瓶在高壓滅菌器中滅菌。在每只燒瓶經滅菌處理的培養基中接種假單胞菌(Pseudomonas sp.)AB10215菌株(保藏號為FERM BP-7170)，并在27℃和振搖下將接種的細菌菌株培養5天。離心(8000rpm，20分鐘)所得培養肉湯，得到培養肉湯上清液。
該培養肉湯上清液經高效液相色譜(HPLC)分析，測量條件如上所示。結果證明，在所述肉湯上清液中產生了濃度為244mg/ml的L-表-2-肌醇單酮(轉化率為98.7％)。與此同時，在所得的上述肉湯上清液中未檢測到內消旋肌醇。(b)回收和分離L-表-2-肌醇單酮將上述實施例1(2)得到的培養肉湯上清液通過裝有80毫升強酸性陽離子交換樹脂Duolite(注冊商標)C-20(H+型)的柱(內徑2cm×高30cm)。然后，用80ml離子交換水(即去離子水)沖洗該柱。之后，將培養肉湯上清液通過所述柱得到的流出液與用去離子水洗滌所述柱得到的水洗液合并。將所得合并的溶液通過含有160ml弱堿性陰離子交換樹脂Duolite(注冊商標)368S(游離堿形式)的柱(內徑3cm×高30cm)，然后用160ml去離子水沖洗該陰離子交換樹脂柱。
將后一柱得到的流出液與所得水洗液合并在一起，得到水溶液。該水溶液含有L-表-2-肌醇單酮，但是基本上不含任何雜質。
將上述得到的水溶液減壓濃縮至200毫升體積。向該濃縮溶液中加入3倍(以體積計)乙醇，并將所得液體混合物放置過夜，由此得到60g純的L-表-2-肌醇單酮，為無色結晶。此時L-表-2-肌醇單酮純化產物的回收率是60.7％，而以起始內消旋肌醇計，L-表-2-肌醇單酮的總回收率是60.6％。
上述L-表-2-肌醇單酮純化產物的回收率是通過下列計算等式計算的L-表-2-肌醇單酮純化產物的回收率(％)＝[所分離的純化L-表-2-肌醇單酮的量÷純化前在400毫升培養肉湯上清液中所含L-表-2-肌醇單酮的量]×100上述L-表-2-肌醇單酮的總回收率是通過下列計算等式計算的。
L-表-2-肌醇單酮的總回收率(％)＝[所分離的純化L-表-2-肌醇單酮的摩爾數÷400毫升液體培養基中最初所含內消旋肌醇的摩爾數]×100
該培養肉湯上清液經高效液相色譜(HPLC)分析，測量條件與上述條件相似。結果證明，在所得肉湯上清液中產生了濃度為60mg/ml的L-表-2-肌醇單酮(轉化率為50.6％)。
按照與實施例1(b)中所述同樣的方式，從上述培養肉湯上清液中純化和分離L-表-2-肌醇單酮。由此得到114g結晶(純化L-表-2-肌醇單酮的回收率為76.0％)。此時，以內消旋肌醇計，純化L-表-2-肌醇單酮的總回收率為38.4％。
上述L-表-2-肌醇單酮的轉化率是按照實施例1(b)中給出的計算等式計算的，而上述純化的L-表-2-肌醇單酮的回收率是按照下列計算等式計算的純化的L-表-2-肌醇單酮的回收率(％)＝[所分離的純化L-表-2-肌醇單酮的量÷純化前在2.5升培養肉湯上清液中所含L-表-2-肌醇單酮的量]×100上述以內消旋肌醇計的L-表-2-肌醇單酮的總回收率是通過下列計算等式計算的L-表-2-肌醇單酮的總回收率(％)＝[所分離的純化L-表-2-肌醇單酮的摩爾數÷2.5升液體培養基中最初所含內消旋肌醇的摩爾數]×100
上述L-表-2-肌醇單酮的轉化率是按照與上述實施例1類似的方法計算的，而上述純化的L-表-2-肌醇單酮的回收率是按照下列計算等式計算的純化的L-表-2-肌醇單酮的回收率(％)＝[所分離的純化L-表-2-肌醇單酮的量÷純化前在400毫升反應溶液中最初所含L-表-2-肌醇單酮的量]×100上述以內消旋肌醇計的純化L-表-2-肌醇單酮的總回收率是通過下列計算等式計算的純化的L-表-2-肌醇單酮的總回收率(％)＝[所分離的純化L-表-2-肌醇單酮的摩爾數÷400毫升磷酸鹽緩沖液中最初加入的內消旋肌醇的摩爾數]×100
按照本發明第二方面方法的方法(C)制備表肌醇的實施例(1)制備L-表-2-肌醇單酮向每一只500毫升容量的折流板錐形瓶中倒入每份100毫升的液體培養基(總共2升)，其中含有25.0％(500g)內消旋肌醇、1.0％葡萄糖和2.5％酵母提取物，未調節pH。然后，將燒瓶在高壓滅菌器中滅菌。在每只燒瓶經滅菌處理的培養基中接種黃單胞菌(Xanthomonas sp.)AB 10119菌株(FERM BP-7168)，并在27℃和振搖下將接種的細菌菌株培養5天。離心(8000rpm，20分鐘)所得培養肉湯，得到培養肉湯上清液。
按照與實施例1(1)類似的方法，對該培養肉湯上清液進行高效液相色譜(HPLC)分析。結果證明，在所述培養肉湯上清液中產生了415g L-表-2-肌醇單酮(L-表-2-肌醇單酮的轉化率為83.9％)。(2)制備表肌醇向2升上述步驟(1)得到的含有L-表-2-肌醇單酮的培養肉湯上清液中緩緩加入29.2g硼氫化鈉作為還原劑。在室溫進行L-表-2-肌醇單酮的還原反應。還原反應完成后，在下列測量條件下，通過高效液相色譜對肉湯上清液(即，由還原反應得到的反應溶液)進行分析。結果證明，由還原反應得到的反應溶液(即還原反應后得到的肉湯上清液)含有235.8g所產生的表肌醇和102.4g副產物內消旋肌醇(表肌醇加上內消旋肌醇的總反應產率為80.6％)。由L-表-2-肌醇單酮轉化為表肌醇的表肌醇的轉化率是56.2％。上述高效液相色譜的測量條件如下。
柱Wakosil 5NH24.6×250mm柱溫40℃
檢測器RI DETECTER ERC-7515A(ERMA CR.INC.)反應溶液的注入量20μl洗脫溶劑乙腈-水(4∶1)表肌醇的洗脫時間8.5分鐘上述表肌醇加上內消旋肌醇的總回收率(％)通過下列計算等式評價總回收率(％)＝[(在上述還原反應后得到的肉湯上清液中所含表肌醇的摩爾數加上內消旋肌醇的摩爾數之和)÷(在上述還原反應前的肉湯上清液中最初所含L-表-2-肌醇單酮的摩爾數)]×100上述由L-表-2-肌醇單酮轉化為表肌醇的表肌醇的轉化率通過下列計算等式評價表肌醇的轉化率(％)＝[在上述還原反應后得到的肉湯上清液中所含表肌醇的摩爾數÷在上述還原反應前的肉湯上清液中所含L-表-2-肌醇單酮的摩爾數]×100(3)回收和分離表肌醇的第一個實驗將上述步驟(2)得到的反應溶液(即，還原反應后得到的肉湯上清液)分成兩半。將其中一半所述反應溶液通過含有300ml強酸性陽離子交換樹脂Duolite(注冊商標)C-20(H+型)的柱(內徑5cm×高30cm)，得到柱流出液。然后，用400ml去離子水沖洗該柱。將所得流出液與所得水洗液合并在一起，并使合并的溶液通過含有600ml強堿性陰離子交換樹脂Duolite(注冊商標)A-113(OH-型)的柱(內徑5cm×高60cm)，得到柱流出液。然后，用700ml去離子水沖洗該柱。
將所得柱流出液與所得水洗液合并在一起。如此合并得到的水溶液含有所產生的表肌醇和副產物內消旋肌醇，但是基本上不含雜質。
將上述合并得到的水溶液減壓濃縮至300毫升體積。取所得濃縮溶液(300ml)的1/4份(75ml)，使其通過含有1500ml強堿性陰離子交換樹脂Amberlite(注冊商標)CG-400(OH-型)的柱(內徑5cm×高200cm)，然后用去離子水沖洗該柱。對所得該柱的洗脫液區分主要含內消旋肌醇的餾分和主要含所需表肌醇的餾分分別收集。濃縮溶液的剩余3/4份(225ml)用Amberlite CG-400(OH-型)柱進行類似處理，由此得到僅含表肌醇的洗脫液餾分。將這些洗脫液餾分濃縮至干，得到73g表肌醇。此外，將該表肌醇溶解在水中，得到15％水溶液，向該水溶液中加入兩倍體積的乙醇。將所得液體混合物放置過夜使表肌醇重結晶。由此得到63g純表肌醇結晶(純化表肌醇的回收率為53.4％)。由內消旋肌醇得到的表肌醇的總產率是25.2％。
上述表肌醇的回收率是通過下列計算等式評價的純化表肌醇的回收率(％)＝[所分離晶狀表肌醇的量/還原反應后所得肉湯上清液中所含表肌醇的量]×100上述由內消旋肌醇得到的表肌醇的總回收率是通過下列計算等式評價的表肌醇的總回收率(％)＝[所分離晶狀表肌醇的量/1升液體培養基中最初所含內消旋肌醇的量]×100(4)回收和分離表肌醇的第二個實驗將前面分出的上述步驟(3)的另一半反應溶液(還原反應后得到的肉湯上清液)通過含有300ml強酸性陽離子交換樹脂Duolite(注冊商標)C-20(H+型)的柱(內徑5cm×高30cm)，得到所述柱的流出液。然后，用400ml去離子水沖洗該柱。將所得流出液與所得水洗液合并在一起，并通過含有600ml強堿性陰離子交換樹脂Duolite(注冊商標)A-113(OH-型)的柱(內徑5cm×高60cm)，得到柱流出液。然后，用700ml去離子水沖洗該柱。
將所得后一柱流出液與所得水洗液也合并在一起。將所得水溶液減壓濃縮至300ml體積。將所得濃縮溶液(300ml)通過含有1500ml強酸性陽離子交換樹脂Diaion(注冊商標)UBK 520M(Ca+型)的柱(內徑5cm×高200cm)，得到流出液。用去離子水沖洗該柱。對所得該柱的洗脫液區分主要含內消旋肌醇的餾分和主要含所需表肌醇的餾分分別收集。由該色譜方法得到75g表肌醇。此外，將該表肌醇溶解在水中，得到15％水溶液，向該水溶液中加入兩倍體積的乙醇。將所得液體混合物放置過夜使表肌醇重結晶。由此得到66g純表肌醇結晶(純化表肌醇的回收率為56.0％)。以內消旋肌醇作為原料計，純化表肌醇的總產率是26.4％。
純化表肌醇的回收率和總回收率按照與上述步驟(3)同樣的方法計算。
按照與實施例1(1)類似的方法，對該培養肉湯上清液進行高效液相色譜(HPLC)分析。結果證明，在所述肉湯上清液中產生了23g L-表-2-肌醇單酮(以內消旋肌醇計，L-表-2-肌醇單酮的轉化率為93.0％)。(2)制備表肌醇向100毫升上述步驟(1)得到的含有L-表-2-肌醇單酮的肉湯上清液中加入5M氫氧化鈉水溶液，將上清液的pH調節至pH10。此后立即向該pH10的上清液中緩緩加入1.3g硼氫化鈉。然后在室溫進行還原反應。反應完成后，在實施例4(2)所述測量條件下，通過高效液相色譜對肉湯上清液(即，由還原反應得到的反應溶液)進行分析。結果證明，由還原反應得到的反應溶液(即還原反應后得到的肉湯上清液)含有18.4g所產生的表肌醇和0.8g副產物內消旋肌醇(表肌醇加上內消旋肌醇的總反應產率為82.6％)。由L-表-2-肌醇單酮轉化為表肌醇的表肌醇的轉化率是79.1％。
上述表肌醇加上內消旋肌醇的總反應產率(％)通過下列計算等式評價表肌醇加上內消旋肌醇的總反應產率＝[在還原反應后得到的肉湯上清液中所含表肌醇摩爾數與內消旋肌醇摩爾數之和÷在還原反應前的肉湯上清液中最初所含L-表-2-肌醇單酮的摩爾數)]×100上述由L-表-2-肌醇單酮轉化為表肌醇的表肌醇轉化率通過下列計算等式評價由L-表-2-肌醇單酮轉化為表肌醇的表肌醇轉化率(％)＝[在還原反應后得到的肉湯上清液中所含表肌醇的摩爾數÷在還原反應前的肉湯上清液中所含L-表-2-肌醇單酮的摩爾數]×100(3)回收和分離表肌醇按照與實施例4(4)所述同樣的方法，從還原反應得到的所述反應溶液中回收、純化和分離表肌醇。以結晶形式得到的表肌醇的產量是15.7g。此時，由最初在反應溶液中所含的表肌醇得到的純化表肌醇的回收率是85.3％。以還原前最初在反應溶液中所含的L-表-2-肌醇單酮計，表肌醇的產率是67.5％。以用作原料的內消旋肌醇計，純化表肌醇的總回收率是62.8％。
以還原反應后在反應溶液中最初所含表肌醇計，上述純化表肌醇的回收率通過下列計算等式評價純化表肌醇的回收率(％)＝[所分離純化表肌醇的量÷還原反應后在100ml反應溶液、即肉湯上清液中最初所含表肌醇的量]×100以L-表-2-肌醇單酮計，上述純化表肌醇的產率通過下列計算等式評價純化表肌醇的產率(％)＝[所分離純化表肌醇的摩爾數÷還原反應前在100ml肉湯上清液中所含L-表-2-肌醇單酮的摩爾數]×100上述由內消旋肌醇得到的純化表肌醇的總回收率通過下列計算等式評價純化表肌醇的總回收率(％)＝[所分離純化表肌醇的量÷培養開始時100ml液體培養基中最初所含內消旋肌醇的量]×100工業實用性按照本發明，可以容易地和有效地由內消旋肌醇制備L-表-2-肌醇單酮，后者是用于合成藥物的有用中間體。按照本發明，還可以通過將L-表-2-肌醇單酮還原，容易和有效地制備表肌醇，后者適于用作各種藥物。因此，本發明的方法適用于工業目的。
權利要求
1.L-表-2-肌醇單酮的制備方法，其特征在于該方法包括將內消旋肌醇與能夠使內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的微生物反應，由此將內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮，以產生L-2-肌醇單酮。
2.權利要求1所述的方法，其中所用能夠使內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的微生物是細菌。
3.權利要求1所述的方法，其中所用能夠使內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的微生物是革蘭氏陰性菌。
4.權利要求1所述的方法，其中所用能夠使內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的微生物是選自下列的革蘭氏陰性菌屬于假單胞菌科的黃單胞菌屬(Xanthomonas)或假單胞菌屬(Pseudomonas)的革蘭氏陰性菌；屬于醋酸桿菌科(Acetobacteraceae)的醋酸桿菌屬(Acetobacter)或葡糖桿菌屬(Gluconobacter)的細菌；屬于根瘤菌科(Rhizobiaceae)的土壤桿菌屬(Agrobacterium)的細菌；屬于腸桿菌科(Enterobacteriacea)的歐文氏菌屬(Erwinia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)和耶爾森氏菌屬(Yersinia)的細菌；或者屬于巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)的巴斯德氏菌屬(Pasteurella)或嗜血桿菌屬(Haemophilus)的細菌。
5.權利要求1所述的方法，其中所用能夠使內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的微生物是黃單胞菌屬菌株(Xanthomonas sp.)AB10119(保藏號FERM BP-7168)或假單胞菌屬菌株(Pseudomonas sp.)AB 10215(保藏號FERM BP-7170)和歐文氏菌屬菌株(Erwinia sp.)10135(保藏號FERMBP-7169)。
6.權利要求1所述的方法，其中在需氧條件下，在含有一定量內消旋肌醇、碳源和氮源的液體培養基中，培養能夠使內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的微生物，由此使所述內消旋肌醇與所述微生物在培養基中反應，并在所得培養肉湯中產生和積聚L-表-2-肌醇單酮。
7.權利要求1所述的方法，包括在培養基中培養能夠使內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的微生物，從所得培養肉湯中分離所培養微生物的微生物細胞，將所分離的微生物細胞加至含有溶解于其中的一定量內消旋肌醇的緩沖液或液體培養基中，并使所加入的微生物細胞與在所述緩沖液或所述液體培養基中的內消旋肌醇反應，在所得反應溶液或在所得培養肉湯中將內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮。
8.權利要求1所述的方法，其中在權利要求6或7的方法中得到含有微生物細胞和所產生并積聚于其中的L-表-2-肌醇單酮的培養肉湯或反應溶液，然后從所述培養肉湯或所述反應溶液中除去微生物的微生物細胞，并且一旦從含有L-表-2-肌醇單酮的所述培養肉湯或所述反應溶液中除去微生物細胞即得到培養肉湯上清液或反應溶液濾液，然后用離子交換樹脂或者活性炭處理該培養肉湯上清液或反應溶液濾液，或者處理所述培養肉湯上清液或反應溶液濾液使L-表-2-肌醇單酮結晶，或者采用這些處理的任何組合方式，由此從所述培養肉湯上清液或反應溶液濾液中回收高純度的L-表-2-肌醇單酮。
9.表肌醇的制備方法，其特征在于該方法包括在含水反應介質中，將能夠使內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的微生物與內消旋肌醇反應，以在所述含水反應培養基中生成L-表-2-肌醇單酮，由此得到含有所述微生物的微生物細胞的以及在其中產生的L-表-2-肌醇單酮的所得反應溶液，從所述反應溶液中除去微生物細胞，得到含有L-表-2-肌醇單酮的反應溶液濾液，向含有L-表-2-肌醇單酮的所述反應溶液濾液中直接加入適當的還原劑，并使還原劑與L-表-2-肌醇單酮反應，生成表肌醇和內消旋肌醇。
10.權利要求9所述的方法，其中所用能夠使內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的微生物是細菌。
11.權利要求9所述的方法，其中所用能夠使內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的微生物是革蘭氏陰性菌。
12.權利要求9所述的方法，其中所用能夠使內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的微生物是選自下列的革蘭氏陰性菌屬于假單胞菌科的黃單胞菌屬(Xanthomonas)或假單胞菌屬(Pseudomonas)的革蘭氏陰性菌；屬于醋酸桿菌科(Acetobacteraceae)的醋酸桿菌屬(Acetobacter)或葡糖桿菌屬(Gluconobacter)的細菌；屬于根瘤菌科(Rhizobiaceae)的土壤桿菌屬(Agrobacterium)的細菌；屬于腸桿菌科(Enterobacteriacea)的歐文氏菌屬(Erwinia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)和耶爾森氏菌屬(Yersinia)的細菌；或者屬于巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)的巴斯德氏菌屬(Pasteurella)或嗜血桿菌屬(Haemophilus)的細菌。
13.權利要求9所述的方法，其中所用能夠使內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的微生物是黃單胞菌屬菌株(Xanthomonas sp.)AB10119(保藏號FERM BP-7168)或假單胞菌屬菌株(Pseudomonas sp.)AB 10215(保藏號FERM BP-7170)和歐文氏菌屬菌株(Erwinia sp.)10135(保藏號FERM BP-7169)。
14.權利要求9所述的方法，包括在需氧條件下、在由含有一定量內消旋肌醇、碳源和氮源的液體培養基組成的含水基質中，培養能夠將內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的微生物，以使內消旋肌醇與所述微生物在所述含水反應基質中反應，由此在所得培養肉湯中產生和積聚L-表-2-肌醇單酮，得到培養肉湯，即含有所述微生物的微生物細胞和L-表-2-肌醇單酮的所得反應溶液；從所得到的反應溶液、即培養肉湯中除去所述微生物的微生物細胞，得到培養肉湯上清液，即含有L-表-2-肌醇單酮的所述反應溶液濾液；向所得培養肉湯上清液中直接加入堿金屬硼氫化物、堿金屬三烷氧基硼氫化物或堿金屬硼氰化物作為還原劑，使L-表-2-肌醇單酮與該還原劑進行還原反應，由此在所述培養肉湯上清液、即所述反應溶液濾液中產生表肌醇和內消旋肌醇；從所得還原反應的反應溶液、即含有所產生的表肌醇和內消旋肌醇的培養肉湯上清液中回收表肌醇和內消旋肌醇；將所回收的表肌醇與內消旋肌醇彼此分離。
15.權利要求9所述的方法，包括在需氧條件下、在含有碳源和氮源的液體培養基中，培養能夠將活性內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的微生物，由此得到所述微生物的培養肉湯，然后從所得培養肉湯中分離所述微生物的微生物細胞；在由含水緩沖液或液體培養基組成的含水反應基質中，將所分離的所述微生物的微生物細胞與內消旋肌醇反應，在所述含水反應基質中產生L-表-2-肌醇單酮；從所得到的含有所述微生物的微生物細胞以及在其中生成的L-表-2-肌醇單酮的所得含水反應溶液中除去所述微生物的微生物細胞，得到已經除去微生物細胞、而L-表-2-肌醇單酮仍溶解于其中的所得反應溶液濾液；向所述反應溶液濾液中加入堿金屬硼氫化物、堿金屬三烷氧基硼氫化物或堿金屬硼氰化物作為還原劑，使L-表-2-肌醇單酮與所述還原劑進行還原反應，由此在所述反應溶液濾液中產生表肌醇和內消旋肌醇；從所得含有所產生的表肌醇和內消旋肌醇的還原反應的反應溶液中回收表肌醇和內消旋肌醇；將所回收的表肌醇與內消旋肌醇彼此分離。
16.權利要求14或15所述的方法，其中在L-表-2-肌醇單酮與所加入的還原劑進行還原反應之前，進行這樣一個預備步驟，即，將由含有L-表-2-肌醇單酮的培養肉湯上清液或反應溶液濾液組成的含水基質的pH調至pH8-12的堿性pH范圍；然后進行的步驟是，向含有L-表-2-肌醇單酮和pH8-12的該堿性含水介質中加入堿金屬硼氫化物、堿金屬三烷氧基硼氫化物或堿金屬硼氰化物作為還原劑，使L-表-2-肌醇單酮與所述還原劑進行還原反應，由此產生了遠遠大于副產物內消旋肌醇產率的所需表肌醇。
17.權利要求9所述的方法，其中L-表-2-肌醇單酮還原反應所用的還原劑選自硼氫化鈉、硼氫化鋰、硼氫化鉀、三甲氧基硼氫化鈉或氰基硼氫化鈉。
18.權利要求9所述的方法，其中所用含水反應基質是水；所用還原劑是硼氫化鈉。
19.新微生物黃單胞菌菌株(Xanthomonas sp.)AB 10119，該微生物具有能夠使內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的特性，并且已經保藏在日本的國立生命科學和人體技術研究所，保藏號為FERM BP-7168。
20.新微生物假單胞菌菌株(Pseudomonas sp.)AB 10215，該微生物具有能夠使內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的特性，并且已經保藏在日本國立生命科學和人體技術研究所，保藏號為FERM BP-7170。
21.新微生物歐文氏菌菌株(Erwinia sp.)AB 10135，該微生物具有能夠使內消旋肌醇轉化為L-表-2-肌醇單酮的特性，并且已經保藏在日本國立生命科學和人體技術研究所，保藏號為FERM BP-7169。
全文摘要
本發明提供了L－表－2－肌醇單酮和表肌醇新的有效制備方法,表肌醇適于用作各種藥物或合成各種藥物的中間體。在該方法中,使用便宜的內消旋肌醇作為原料。也就是說,本發明開發了一種新的方法,包括將內消旋肌醇與能夠將內消旋肌醇轉化為L－表2－肌醇單酮的革蘭氏陰性菌反應,由此通過將內消旋肌醇轉化為L－表－2－肌醇單酮產生L－表－2－肌醇單酮。另外,本發明提供了新的方法,該方法包括將所產生的L－表－2－肌醇單酮與由堿金屬硼氫化物或任何其他堿金屬氫化物組成的還原劑在含水反應基質中反應,產生表肌醇和內消旋肌醇,然后從由表肌醇和內消旋肌醇組成的所得反應產物中分離表肌醇。
文檔編號C12N1/21GK1365394SQ00811034
公開日2002年8月21日 申請日期2000年6月7日 優先權日1999年6月7日
發明者高橋篤, 神邊健司, 森哲也, 北雄一, 玉村健, 竹內富雄 申請人:北興化學工業株式會社, 財團法人微生物化學研究會