專利名稱：納米微粒標(biāo)記基因探針及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因檢測技術(shù)，更具體地說，涉及納米微粒標(biāo)記基因探針及其制備方法和在基因雜交中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因研究帶動了20世紀(jì)整個(gè)生命科學(xué)的迅速發(fā)展；在21世紀(jì)，基因研究仍將推動生命科學(xué)研究向縱深發(fā)展。基因檢測不僅對生物學(xué)研究至關(guān)重要，而且對臨床醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、農(nóng)業(yè)技術(shù)、環(huán)境監(jiān)控、法學(xué)鑒定等領(lǐng)域也具有極其重要的意義。
基因檢測一般采用直接測序或雜交檢測。直接測序就是直接分離、擴(kuò)增、純化基因片段后，采用末端鏈終止反應(yīng)原理測定核酸中的每個(gè)核苷酸組成及其排列順序。測序方法有同位素、銀染、四色熒光標(biāo)記激光共聚焦測序等，這些方法都需要復(fù)雜的程序，昂貴的試劑和配套昂貴的設(shè)備。相比之下，雜交檢測進(jìn)行基因檢測方法簡單、方便，因此，基因傳感器和基因芯片等基于雜交檢測。
傳統(tǒng)基因檢測進(jìn)行基因探針的標(biāo)記方法有放射法、酶標(biāo)法、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記法等；近年來，銀染法也在DNA序列分析中得到廣泛應(yīng)用。放射法靈敏度高，但因其對環(huán)境有污染，正逐漸被非放射法所取代。酶標(biāo)法由于反應(yīng)過程復(fù)雜，酶催化底物反應(yīng)過快，顯色區(qū)域不集中，限制了它的使用，特別是不適合生物芯片領(lǐng)域的應(yīng)用。化學(xué)發(fā)光標(biāo)記法、普通銀染法及一些其它的標(biāo)記方法則由于靈敏度較低而使其應(yīng)用受到很大限制。
基因芯片的出現(xiàn)使得大規(guī)模生物信息的同時(shí)存儲與處理成為現(xiàn)實(shí)。迄今，比較成熟的基因芯片檢測方法是激光掃描共聚焦顯微法，但其程序復(fù)雜，檢測設(shè)備昂貴，難于推廣和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有基因檢測技術(shù)存在的問題和不足，提供一種由納米微粒表面共價(jià)結(jié)合寡核苷酸單鏈基因探針分子構(gòu)成的納米微粒標(biāo)記基因探針；本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種本發(fā)明的納米微粒標(biāo)記基因探針的制備方法；本發(fā)明還有一個(gè)目的是將本發(fā)明的基因探針作為基因雜交檢測，特別適合于低集成度診斷型基因芯片的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，即將表面合成化學(xué)、生物化學(xué)及物理化學(xué)技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來，解決目視法基因檢測技術(shù)設(shè)計(jì)與制造中的關(guān)鍵技術(shù)；提供雙探針雜交銀粒子著色進(jìn)行微量DNA檢測與信息放大的最新工藝，進(jìn)而研究具有實(shí)用價(jià)值的能夠用于多種目的基因檢測的目視法基因芯片檢測系統(tǒng)，如肝炎(七種肝炎病毒)等傳染性疾病或遺傳疾病臨床用目視法基因芯片診斷系統(tǒng)，推動基因診斷技術(shù)的進(jìn)步。本發(fā)明包括三方面的內(nèi)容納米基因探針、該種探針的制備方法、該種探針的應(yīng)用。其創(chuàng)新點(diǎn)在于探針制備，納米放大，目視顯色主要技術(shù)，適用于各類用途的基因檢測，特別適合于低集成度基因芯片領(lǐng)域。
1、探針制備，即基因探針的制備。該探針是由納米微粒表面共價(jià)結(jié)合100～1000個(gè)寡核苷酸單鏈基因探針分子構(gòu)成，納米微粒的化學(xué)組成包括金、銀原子，硫化鎘、氧化鐵、氧化硅等分子，微粒與寡核苷酸通過二硫鍵、醚鍵、硫胺酯鍵結(jié)合，寡核苷酸與微粒的結(jié)合處有脂肪烴臂，寡核苷酸為單鏈DNA或RNA。
探針的制備方法和注意事項(xiàng)包括如下①膠體金或納米微粒的制備，目前通過將氯金酸溶液煮沸還原法，通過添加還原劑和攪拌速度來控制粒徑。也可采用反向膠束法等方法制備。粒徑一般使用8～160納米。
②DNA探針分子設(shè)計(jì)及委托合成與修飾，要根據(jù)不同用途設(shè)計(jì)不同的DNA堿基順序并連接不同的基團(tuán)，如用于交連到玻片上的探針，除了在5’端添加氨基等活性基團(tuán)外，還應(yīng)增加脂肪酸鏈或非特異性核苷酸以克服雜交時(shí)的空間位阻。用于納米微粒標(biāo)記的DNA探針除了考慮雜交時(shí)的空間位阻外，更重要的是應(yīng)考慮使用易于與納米微粒交連固定的活性基團(tuán)，如巰基(-SH)。
③納米標(biāo)記探針的自組裝合成與封閉，這是本發(fā)明實(shí)現(xiàn)與否的關(guān)鍵，只有嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，才能使多達(dá)成百上千的基因探針牢牢地以共價(jià)鍵結(jié)合到納米金上，使用牛血清白蛋白或聚乙二醇或鮭魚精子DNA封閉多余的活性位點(diǎn)后，經(jīng)過后續(xù)的雜交反應(yīng)，才能使銀粒子特異性富集。
2、納米放大，主要通過“金標(biāo)記寡核苷酸探針”或納米微粒探針與固定到波片、尼龍膜、硝酸纖維素膜等基片上的雙探針與目的或待檢DNA片段特異性地互補(bǔ)雜交，通過氫鍵形成一種多級三維聚集的立體結(jié)構(gòu)，借重與基片上固定的探針形成化學(xué)鍵將雜交聚集體錨定在固體支持物上，實(shí)現(xiàn)雜交信號的分子聚集放大。
3、目視顯色，是在上述特異性的雜交聚集體形成的基礎(chǔ)上，將銀鹽(如硝酸銀)和還原劑添加在雜交體系中，首先通過靜電相互作用將帶正電荷的銀離子吸引到帶負(fù)電荷的核酸片段周圍和納米金球表面，再被還原成銀原子，在成核理論作用下沉積在雜交聚集體四周，顯示出銀灰色，從而將雜交信號放大100萬倍以上。在光學(xué)效應(yīng)上實(shí)現(xiàn)了目視顯色，觀察基因雜交結(jié)果。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果①具有靈敏度高、特異性好、簡便、快速、廉價(jià)的特點(diǎn)。
②既可用于單基因檢測，也可應(yīng)用于多基因集成檢測，如多種傳染性微生物病原的臨床檢測、癌癥早期診斷、遺傳病產(chǎn)前診斷與在體常規(guī)體檢，基因表達(dá)調(diào)控研究，特征基因表達(dá)譜檢測，基因文庫篩選等，尤其適用于低集成度基因芯片檢測，有很好的臨床使用價(jià)值。
③本發(fā)明所述的納米微粒也適用于采用免疫學(xué)原理的免疫組化檢測，如蛋白質(zhì)芯片檢測等。
四

圖1為本發(fā)明實(shí)施步驟方框圖；圖2為硅烷化處理反應(yīng)分子機(jī)理示意圖。
其中1-基因探針合成與修飾，2-納米粒子制備與表征，3-硅烷化處理4-金標(biāo)探針制備與表征，5-載體表面探針固定，6-雜交與納米放大，7-模式識別體系配套，8-基因目視檢測，9-結(jié)果分析。
由圖1可知，本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用包括9大步驟每個(gè)步驟的技術(shù)要求都比較高，必須由專業(yè)技術(shù)人員嚴(yán)格控制工藝過程，方能達(dá)到新方法所述基因檢測的標(biāo)準(zhǔn)。
①基因探針合成與修飾1，主要是作好分子設(shè)計(jì)，一般借重分子生物學(xué)設(shè)計(jì)軟件完成。如上所述，要根據(jù)不同用途設(shè)計(jì)不同的DNA堿基順序并連接不同的基團(tuán)。總的要求是便于探針與固相支持物交連固定和便于充分雜交。
②納米粒子制備與表征2，我們使用加熱還原法，也可使用反向膠束等其它方法。根據(jù)不同的基因檢測需要制備不同粒徑和外型的納米微粒。納米粒子的表征可以使用透射電子顯微鏡、瑞利(Rayleigh)散射光譜、X-射線衍射，現(xiàn)已有專門納米測量儀器出售。
③硅烷化處理3，使用現(xiàn)有基因芯片技術(shù)中的玻片處理方法，略加改進(jìn)。
④納米標(biāo)記探針制備與表征4，指金標(biāo)基因探針的制備。要選用合適粒度的納米金，一般選用8～160nm(分辯率要求越高粒徑越小，濃度為10～20nM)與預(yù)先針對目的基因片段設(shè)計(jì)、合成并用烷基巰基修飾好的DNA寡核苷酸水溶液，濃度1～10μM(微摩爾)在溫度為15～40℃，控制反應(yīng)的PH值為6～8之間，時(shí)間為10～20小時(shí)，繼續(xù)在0.1M NaCl，10mM磷酸緩沖液中放置30～50小時(shí)后，12000～16000離心去上清，加入0.1M NaCl，10mM磷酸緩沖液反復(fù)洗滌三次，最后加入0.3MNaCl，10mM磷酸緩沖液(pH7)，0.01％疊氮化納，4℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物冷藏保存。表征方法目前采用紫外吸收法和瑞利散射法。
⑤載體表面探針固定5，采用直接點(diǎn)樣法，探針濃度10-5～10-11摩爾。反應(yīng)過程中要保持潤濕和無菌狀態(tài)。
⑥雜交與納米放大6，如前所述。
⑦模式識別體系配套7，指事先設(shè)計(jì)規(guī)定好的結(jié)果判定方法、標(biāo)準(zhǔn)；與檢測相對應(yīng)的信號識別軟件及必要的識別、掃描和分析設(shè)備配套。
⑧基因目視檢測8，通過探針雜交后經(jīng)過納米放大銀染看是否顯色，顯出灰褐色的即為有基因雜交信號，可以用肉眼觀察直接判定檢測結(jié)果。
⑨結(jié)果分析9，將上述顯色結(jié)果，經(jīng)過模式識別和分析處理后，將檢測結(jié)果整理輸出。
由圖2可知，玻片表面在處理過程中經(jīng)過了一系列化學(xué)變化，通過硅烷化偶聯(lián)劑和/或手臂分子將寡核苷酸探針共價(jià)結(jié)合到玻片上，便于以后步驟的穩(wěn)定實(shí)施。固相載體如果用硝酸纖維素膜、尼龍膜、納米粒等可不用硅烷化處理，只需活化過程。
本發(fā)明流程如下1、基片表面處理以玻片為基片的檢測芯片為例用濃硝酸煮洗玻片10分鐘，再用蒸餾水洗3次，放入烘箱40℃烘干。
取1.5毫升水，28毫升丙酮和600微升硅烷化偶聯(lián)劑PDITC(苯2異硫氰酸酯)加入容器中，再將玻片浸入其中40分鐘。用丙酮(分析純)洗滌玻片5次(5分鐘/次)，再將玻片烘干。
把玻片放入0.2％PDITC溶液中，置于烘箱中2小時(shí)(維持溫度37℃)。
從PDITC中取出玻片，先用甲醇洗滌5次(5分鐘/次)，再用丙酮洗滌2次，最后用雙蒸水洗滌一次，晾干。
將光密度值為1OD(吸光度值)的5’-氨基寡核苷酸溶解于100μl(微升，容積單位)TE(Tris-EDTA緩沖液，分子生物學(xué)常用試劑)中，然后將單鏈DNA點(diǎn)在玻片上，將玻片在4℃放置5小時(shí)，轉(zhuǎn)入潮濕的環(huán)境下40℃放置2小時(shí)。
2、納米金微粒(膠體金)的制備(100ml)將0.01％的HAuClO4(氯金酸)加熱至沸。攪拌下加入2-4ml、1％的檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)，繼續(xù)加熱煮沸15分鐘。停止加熱，攪拌下冷卻至室溫，用蒸餾水恢復(fù)至原體積，粒徑8～140納米。
3、納米金微粒探針的制備用0.1M Na2CO3(碳酸納)或1M Tris堿調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH至選定值，選擇pH7±0.5為反應(yīng)pH值。原則上可選擇待標(biāo)記核酸或蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，也可略微偏堿。但通常最適反應(yīng)pH往往需經(jīng)多次試驗(yàn)才能確定。
取制備好的納米金球1ml(14nm)，離心(10000轉(zhuǎn)左右)，去除沉淀物。再16000～25000轉(zhuǎn)離心30～5分鐘，去上清，再加入1ml(0.1M NaCl，10mM磷酸緩沖液，0.2％的PEG(聚乙二醇)或BSA(牛血清白蛋白))溶液，超聲旋起，重復(fù)3次，以除去雜物。
將1OD DNA溶解在100μlTE中，加入上述1ml納米金球溶液中，室溫放置1小時(shí)，然后在4℃放置過夜，離心洗滌去上清后加入終濃度為0.3M NaCl，10mM磷酸緩沖液，0.01％疊氮化納的溶液體系中，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 4、雜交取PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增產(chǎn)物或直接提取的目標(biāo)序列溶解在100μlTE中，取1-10μl溶解到1-50ml 8×PBS(磷酸緩沖液)中(濃度大于100nM)，將固定好DNA的玻片與之雜交(50℃ 1小時(shí)，4℃放置過夜)，然后，加入納米金探針1-50μl(濃度大于5nM)，繼續(xù)雜交2～4小時(shí)。
5、染色(1)溶液配制A、銀顯影液*乳酸銀顯影液
a.10％阿拉伯膠水溶液或1％明膠60mlb.枸櫞酸緩沖液(pH3.5)10mlc.對苯二酚0.85g，加水15ml溶解d.乳酸銀0.11g，加水15ml溶解以上a～c用前混合過濾，最后加入d.注意避光.
*硝酸銀顯影液a.10％阿拉伯膠水溶液或1％明膠60mlb.枸櫞酸緩沖液(pH3.5)10mlc.對苯二酚1.7g，加水30ml溶解d.硝酸銀50mg，加水2ml溶解以上a～c用前混合過濾，最后加入d.注意避光。
以上兩種顯影液中，如以蒸餾水代替阿拉伯膠或明膠，則顯色速度明顯加快，要在鏡下控制顯色程度。
B、枸櫞酸緩沖液枸櫞酸(C6H8O7·H2O) 2.55g枸櫞酸三鈉(C6H5Na3O7·H2O) 2.35g加蒸餾水100ml溶解。
C、定影液20％硫代硫酸鈉(2)顯色步驟將雜交后的玻片取出，分別用8×PBN漂洗3次，每次2分鐘。銀染色反應(yīng)將基因芯片用去離子水洗滌3×6分鐘，除去Cl-(氯離子)，接著于0.2M pH3.5檸檬酸緩沖液中浸泡3分鐘，然后將玻片放入裝有顯影液的平皿中作用10～15分鐘，再將玻片放入定影液中3分鐘，取出用大量去離子水洗滌后，自然干燥。
判定凡是著色很深、呈均勻一致的灰黑色斑點(diǎn)，與背景反差強(qiáng)者判為強(qiáng)陽性(+++)；著色較深，與背景反差較強(qiáng)者判為陽性(++)；著色淡，與背景反差小者判為弱陽性(+)；不著色者判為陰性(-)。
②玻片的處理用濃硝酸煮洗玻片10分鐘，再用蒸餾水洗，放入烘箱烘干。
③寡核苷酸溶液的配制將光密度值為1.0(約33ug)的5’-氨基寡核苷酸溶解于100ulTE中，濃度約為3.35×10-5mol/L。5’-氨基寡核苷酸序列5’-NH2-GGACTT CTC TCA ATT TTC TAG GG-3’(2)玻片的硅烷化處理，捕獲DNA與玻片的交聯(lián)①活化取1.5毫升水，28毫升丙酮和600微升硅烷化偶聯(lián)劑加入一培養(yǎng)皿中，再將玻片浸入其中40分鐘。用丙酮洗滌玻片5次(5分鐘/次)，再將玻片烘干。
②PDC交聯(lián)把玻片放入0.2％PDITC溶液，置于烘箱中2小時(shí)(維持濕度37攝氏度)。從PDITC中取出玻片，先用甲醇洗滌5次(5分鐘/次)，再用丙酮洗滌2次，最后用雙蒸水洗滌一次，晾干。
③DNA探針的固定將單鏈乙丙型肝炎DNA探針點(diǎn)在玻片上不同的位點(diǎn)，然后將玻片在4℃放置5小時(shí)，潮濕的環(huán)境下40℃放置2～4小時(shí)。
(3)納米微粒金銀放大目視顯色法檢測基因①膠體金的制備，同上。
②在納米金球上修飾HS-DNA。技術(shù)同上，帶巰基修飾的乙丙肝病毒特異性基因探針通過專門設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)序列后委托專業(yè)公司合成HS-DNA。
(4)目的基因獲取與制備。用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)提取病毒核酸或者以此作為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使病原基因達(dá)到檢測最低濃度。
(5)雜交。
取1OD目標(biāo)序列溶解在100ulTE中，取1-10μl溶解到1-50ml8×PBS中(濃度大于100nM)，將固定好DNA的玻片與之雜交(50℃ 2小時(shí)，4℃放置過夜)，然后，加入納米金探針1-50μl(濃度大于5nM)，繼續(xù)雜交2小時(shí)。
(6)染色①銀顯影液硝酸銀顯影液、枸櫞酸緩沖液同上配制。
②定影液20％硫代硫酸鈉③顯色將雜交后的玻片取出，分別用8×PBN漂洗3次，每次2分鐘。銀染色反應(yīng)將基因芯片用去離子水洗滌3×6分鐘，除去Cl-，接著于0.2M pH3.5檸檬酸緩沖液中浸泡3分鐘，然后將玻片放入裝有顯影液的平皿中作用10～15分鐘，再將玻片放入定影液中3分鐘，取出用大量去離子水洗滌后，自然干燥。
判定準(zhǔn)則同上。
(7)結(jié)果。
芯片上固定有乙肝病毒基因探針的點(diǎn)與對應(yīng)的乙肝病毒檢測金標(biāo)探針與乙肝陽性血清PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交后著色很深、呈均勻一致的灰黑色斑點(diǎn)，與背景反差強(qiáng).顯色率100％，同瓊脂糖凝膠檢測符合率100％。而對照所用丁肝特異性cDNA作捕獲DNA探針，檢測乙肝陽性血清PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，呈空白斑點(diǎn)，不著色，判為陰性。
權(quán)利要求
1.一種納米微粒標(biāo)記基因探針，其特征在于該探針是由納米微粒表面共價(jià)結(jié)合100～1000個(gè)寡核苷酸單鏈基因探針分子構(gòu)成，納米微粒的化學(xué)組成包括金、銀原子，硫化鎘、氧化鐵、氧化硅分子，微粒與寡核苷酸通過二硫鍵、醚鍵、硫胺酯鍵結(jié)合，寡核苷酸與微粒的結(jié)合處有脂肪烴臂，寡核苷酸為單鏈DNA或RNA。
2.權(quán)利要求1所述的一種納米微粒標(biāo)記基因探針的制備方法，其特征在于①膠體金或納米微粒的制備；②DNA探針分子設(shè)計(jì)及合成與修飾；③金納米基因標(biāo)記探針的自組裝合成與封閉。
3.權(quán)利要求1所述的一種納米微粒標(biāo)記基因探針的應(yīng)用，其特征在于該探針應(yīng)用于基因雜交檢測或低集成度診斷型基因芯片。
4.按權(quán)利要求2所述的一種納米微粒標(biāo)記基因探針的制備方法，其特征在于金標(biāo)探針的自組裝合成選用粒度8～160nm的納米金，與預(yù)先針對目的基因片段設(shè)計(jì)、合成并用烷基巰基修飾好的DNA寡核苷酸水溶液，濃度1～10μM(微摩爾)在溫度為15～40℃，控制反應(yīng)的PH值為6～8，時(shí)間為10～20小時(shí)，繼續(xù)在0.1M NaCl，10mM磷酸緩沖液中放置30～50小時(shí)后，12000～16000離心去上清，加入0.1M NaCl，10mM磷酸緩沖液反復(fù)洗滌三次，最后加入0.3MNaCl，10mM磷酸緩沖液，0.01％疊氮化納，4℃保存。
5.按權(quán)利要求3所述的一種納米微粒標(biāo)記基因探針的應(yīng)用，其特征在于納米放大主要通過金標(biāo)記寡核苷酸探針與固定到玻片、尼龍膜、硝酸纖維素膜等基片上的雙探針與目的或待檢DNA片段特異性地互補(bǔ)雜交，通過氫鍵形成一種多級三維聚集的立體結(jié)構(gòu)，借重與基片上固定的探針形成化學(xué)鍵將雜交聚集體錨定在固體支持物上，實(shí)現(xiàn)雜交信號的分子聚集放大。
6.按權(quán)利要求3所述的一種納米微粒標(biāo)記基因探針的應(yīng)用，其特征在于目視顯色是在特異性的雜交聚集體形成的基礎(chǔ)上，將銀鹽和還原劑添加在雜交體系中，首先通過靜電相互作用將帶正電荷的銀離子吸引到帶負(fù)電荷的核酸片段周圍和納米金球表面，再被還原成銀原子，沉積在雜交聚集體四周，顯示出銀灰色。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基因檢測技術(shù),具體地說,涉及納米微粒標(biāo)記基因探針及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供納米微粒標(biāo)記基因探針代替?zhèn)鹘y(tǒng)的標(biāo)記探針以克服它們分別存在的問題和不足,使其從實(shí)驗(yàn)室走向?qū)嶋H應(yīng)用。納米微粒標(biāo)記基因探針的制備方法是:膠體金或納米微粒的制備,DNA探針分子設(shè)計(jì)及合成與修飾,金標(biāo)探針的自組裝合成與封閉。該探針適用于各類用途的基因雜交檢測,進(jìn)行納米放大和目視顯色;特別適用于低集成度診斷型基因芯片應(yīng)用領(lǐng)域。
文檔編號C12Q1/68GK1339609SQ0113352
公開日2002年3月13日 申請日期2001年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月30日
發(fā)明者龐代文, 王業(yè)富, 張志凌, 曹軍平, 蔡汝秀, 鄭鵠志 申請人:武漢大學(xué)