專利名稱：從靈長類動物胚胎干細胞制備胚狀體的方法
相關申請的交叉參考不適用。
關于聯邦政府資助的研究的申明下述非人的靈長類動物細胞的工作得到了美國政府資助的資金的支持，并由下述機構授權NIH RR11571。美國政府在本發明中享有一定的權利。在本文所述的人細胞研究工作中沒有使用到美國政府的資金。
發明的背景未分化的靈長類胚胎干(“ES”)細胞可無限增殖，并仍維持著形成身體的分化的細胞的潛力。參見美國專利第5,843,780號；J.Thomson等人，282 Science，1145-1147(1998)；和J.Thomson等人，38Biology，133-165(1998)。這些出版物和所有其它本文涉及的出版物的公開內容都被完整地納入本文作為參考。
因而，靈長類動物ES細胞提供一種理解人組織的分化和功能的令人激動的新模型，并且提供了藥物開發與測試的新策略。它們還為基于ES細胞衍生組織的移植的新療法提出了展望。例如，將人和恒河猴的ES細胞注入到無免疫應答的小鼠中，形成具有代表所有的3個胚胎胚層的高級分化衍生組織的良性畸胎瘤。人ES細胞畸胎瘤中易于鑒別的分化細胞包括平滑肌、橫紋肌、骨、軟骨、腸和呼吸道上皮、角質化鱗狀上皮、頭發、神經上皮和神經節。
人和非人靈長類動物的ES細胞系為理解正常的人發育以及由此而理解異常的人發育提供了特別有力的新的模型。因為所產下的嬰兒有潛在的風險，所以對植入后的人胚胎進行實驗性操作在倫理上是不可接受的，因此導致對人胚胎的功能性研究不足。結果，所知道的關于人在植入后的早期發育的知識幾乎完全基于少數胚胎的靜態組織切片和第小鼠的實驗胚胎研究的類推。
但是，小鼠和靈長類動物的早期發育明顯不同。例如，人和小鼠胚胎在胚胎基因組表達的時間調控上不同，在胎膜和胎盤的形成、結構和功能上不同，形成的是胚胎盤形式而非卵圓柱(egg cylinder)形式。人發育的最早期事件對人不育、不孕和生育缺陷起關鍵性作用。靈長類動物的ES細胞為理解這些人早期的發育事件以及理解發育失敗的致病原因提供了一個新的窗口。
靈長類動物的ES細胞還為對具體的分化的靈長類動物細胞的正常功能和病理感興趣的研究者提供了分化的、整倍體的、非轉化的細胞的無限的潛在來源。這些得自ES細胞的具體細胞的純化群還將可用于藥物開發、毒性篩選，并將提供用于移植的細胞來源。
對于如心臟之類的完全缺乏組織特異性干細胞的組織，靈長類動物的ES細胞將證明它們更具有價值。靈長類動物的ES細胞還提供了新的移植療法的希望。當病因是有限量的細胞類型的破壞或功能紊亂時，如帕金森疾病(多巴胺能神經元)或青少年發作的糖尿病(胰的β-胰島細胞)，使用ES細胞衍生物替換這些特定的細胞類型可提供潛在的用于整個生命期的治療方法。
為了實現這些目標，需要更有效地ES細胞分化成各種特定譜系。在將非靈長類動物的ES細胞分化成神經、造血和心臟組織方面已獲得大量的進展。例如可參見T.Doetschman等人，87J.Embry.And Exper.Morph.，27-45(1985)；G.Keller，7Current Op.In Cell Biol.，862-869(1995)；美國專利第5,914,268號。在這些例子中，每一個例子的ES細胞都首先形成“胚狀體”，即促進隨后的分化的三維ES細胞聚集體。
但是，對靈長類動物的ES細胞進行的類似實驗證明，采用常規的鼠的方案進行的胚狀體形成是失敗的。在這些常規的方案中，ES細胞被分散成單一的細胞，然后要么使它們在防止細胞粘附到基質上的條件下聚集成胚狀體，要么使它們由懸浮在甲基纖維素中的單一的細胞或細胞簇生長成胚狀體。我們已知道，靈長類動物的ES細胞在被分散成單一的細胞時，如果其粘附被阻止，則這些單一的細胞將很快就死亡，因此，它們不會成功地聚集，因而它們也不會從甲基纖維素中的克隆中長出。
因此，可以看出仍需要制備靈長類動物的胚狀體的改進方法以及由此獲得的分化細胞。
發明的簡短描述本發明提供一種從粘附在基質上的靈長類動物胚胎干細胞的集落制備靈長類動物的胚狀體的方法。首先從基質上取得胚胎干細胞的塊狀的粘附集落。然后在容器中，在基本上防止這些塊狀物粘附到該容器上的條件下培育這些塊狀物，使它們聚結成胚狀體。在本發明中，塊狀物指兩個或多個為一組的干細胞，較佳的是，塊狀物大到裸眼可見。
在一個較佳的方式中，獲取步驟是在促進塊狀物以塊狀方式與基質分離的制劑的存在下進行。可使用純化學制劑，如Versene牌EDTA二鈉鈣螯合劑。但是，更佳的是使用優先對胞外基質起作用的蛋白酶，如分散酶、膠原酶、過氧化氫酶、神經氨酸酶、胰酶、胰彈性蛋白酶或胰蛋白酶。如果使用胰蛋白酶，那么必須在相對低的濃度下快速地進行該獲取步驟，以便防止胰蛋白酶還破壞到這些塊狀物。更有利地，也可使用酶和EDTA的混合物。
在另一方式中，所述獲取步驟涉及從所述基質上機械刮下呈塊狀的所述塊狀物。
在另一方面，可通過晃動(如輕微搖動、振動或振蕩)所述容器進行所述培育步驟，此培育步驟使用的容器可以是不粘附的細菌級的培養用塑料，和/或可在缺乏血清粘附因子的無血清培養基的存在下進行此培育步驟。
另一方面，本發明提供已采用上述方法(直接或間接)衍生出的靈長類動物的胚狀體。
又一方面，本發明提供由所述胚狀體(直接或間接)衍生獲得的分化細胞。
根據本發明，已在標準條件下(例如可參見美國專利第5,843,780號)培育的靈長類動物的ES細胞，可在基質(如具有標準飼養層的塑料組織培養皿)上過度生長、堆積和/或否則緊密地接合成塊狀。然后從基質上取出成塊狀的這些細胞(如使用對ES細胞集落與基質的粘附比ES細胞與ES細胞的粘附的攻擊強得多的酶與集落一起培育)。在這種情況中，所述酶可以是濃度約為10mg/ml的分散酶。
或者，可通過使用微量移液管、細胞刮力等將這些塊狀物以塊狀形式機械刮下。
然后在非粘附條件下培育這些基本上完整的集落(較佳是連續搖動培養皿，在非粘附的細菌級培養用塑料上培育，和/或在缺乏血清粘附因子的無血清培養基的存在下進行連續的培養)。然后，這些集落可快速聚結成致密的胚狀體，所獲得的胚狀體此后可在連續懸浮液中或者在再粘附到基質上后分化。可使用這些胚狀體獲得內胚層、中胚層和外胚層的分化衍生物，以及獲得其它所需的譜系。
本發明的一個優點是，本發明提供從靈長類動物胚胎干細胞系形成靈長類動物胚狀體的有效方法。本發明的另一優點是提供適合分化成靈長類動物的其它細胞類型的靈長類動物胚狀體。在研究了本說明書及附帶的權利要求書之后，本發明的其它特征和優點將更顯而易見。
優選實施方式的詳細描述在有絲分裂失活的(3000拉德的γ-輻射過)小鼠胚胎成纖維細胞上培育靈長類動物的胚胎干細胞〔如恒河猴或人，美國專利第5,843,780號；J.Thomson等人，282 Science，1145-1147(1998)〕，所述細胞在先經0.1％明膠過夜處理的組織培養皿上以5×104細胞/cm2而制得。E.Robertson，“胚胎衍生的干細胞系”，在“畸胎瘤和胚胎干細胞一種實用方法”中，IRL出版社，華盛頓區，71-112(1987)。培養基由79％Dulbecco改進的Eagle培養基(DMEM，每升有4500mg葡萄糖，沒有丙酮酸鈉)、20％胎牛血清(FBS)、0.1mM2-巰基乙醇、1mML-谷氨酰胺和1％非必需氨基酸原液(GIBCO)組成。
首先使這些集落在一段時間內形成塊狀物。然后采用保持這些ES細胞成塊狀的物理的或化學的方法，將這些ES細胞集落從組織培養皿中取下。
為了使用分散酶或膠原酶從培養皿上取得ES細胞集落，將上述培養基從這些ES細胞分開。將分散酶(10mg/ml，存在于ES培養基中)或膠原酶(1mg/ml在DMEM或其它基本培養基中的溶液)加到所述培養皿中。然后將培養皿放回到培養器中，在那放置10-15分鐘。
經分散酶處理后，可將這些集落從培養皿上洗出，或者通過輕微的攪動使它們脫離組織培養皿。經膠原酶處理后，可使用5ml玻璃移液管將這些細胞從培養皿上刮下。一些集落會產生解離，但這不足以使這些集落分離成單個細胞。經化學處理從組織培養皿上取得這些細胞后，輕微離心這些細胞懸浮液5分鐘，除去上清液，清洗這些細胞，然后將它們再懸浮在含有或不含有血清的培養基中。
使用拉制的玻璃移液管將細胞從培養皿上刮下，從而實現細胞的機械獲取。然后可不離心就立即將細胞塊狀物再懸浮在新鮮的組織培養基中。
一旦從組織培養皿上取得集落，在進一步形成胚狀體過程中，所得的ES細胞應保持在懸浮液中。這可通過如輕微地和連續地搖動該細胞懸浮液而實現。然后將細胞懸浮液的等分試樣加到6-孔組織培養皿的孔中，將該培養皿放到密閉的、濕潤的隔離室中，通入5％CO2、5％O2和90％N2，并將該隔離室放在振蕩器(RedRocker，Hoefer Scientific Instruments)上。將該振蕩器放在溫度維持在37℃的培養器內。可連續搖動這些培養皿至少48小時到14天。
每2天從該搖動設備中取出培養皿，除去培養基，然后給細胞加入新鮮的培養基。然后將培養皿放回到搖動環境中。當在沒有搖動的懸浮培養皿(Nunc)中培養時，或者當在缺乏提供粘附因子的血清的情況下培養時，這些細胞仍維持懸浮狀態。所有的細胞都必須在37℃、在濕潤的和受控氣氛(5％CO2、5％O2和90％N2或者CO2占5％的空氣)中培育。
在懸浮培育達11天后，采用物理或化學的方法分配胚狀體，然后可使它們再粘附到經明膠或基質處理的組織培養皿上，在ES培養基中。經轉移、接種的胚狀體將形成平整的單層，通過每2天置換培養基可維持這些單層。
胚狀體和分化細胞的分析在平板接種培養7天后，我們使用免疫熒光抗體染色來證實存在神經表型細胞。將細胞固定在30％甲醇/10％乙酸中，然后與抗體培育。所使用的抗體如下兔抗牛GFAP抗體(DAKO)、抗-Forse-1抗體(發育學研究雜交瘤庫)、抗-牛MAP-2抗體(Roche)、抗-人NCAM/CD56抗體6(DAKO)和抗-O1抗體(由S.-C.Zhang提供，威斯康星大學)。除了抗-GFAP外，所有的一級抗體都是小鼠單細胞系的。從JacksonImmunoResearch購得二級抗體—FITC偶聯的山羊抗-小鼠IgG抗體和生物素偶聯的山羊抗-兔抗體以及AMCA偶聯的鏈霉親和素。
Forse-1抗體識別磷酸聚糖(phosphacan)，這是一種與人和嚙齒動物的胚胎CNS中的神經細胞粘附分子結合的大腦特異性硫酸軟骨素蛋白聚糖。K.Allendorfer等人，6 Mol.And Cell.Neuro.，381-395(1995)；S.Tole等人，15J.Neuro.，957-969(1995)。O1抗體識別胚胎期的小鼠大腦培養物中第3天出現的前少突神經膠質細胞。M.Schachner等人，83Dev.Biol.，328-338(1981)；I.Sommer等人，83Dev.Biol.，311-327(1981)。
在平板培養的3天中，觀察到被Forse-1和O1抗體染色的神經前體細胞。Forse-1抗體使大量的圓形細胞染色，而非常少的平整的有大量凸起的細胞則被抗-O1抗體染色。
在平板培養3天或之后，通過對神經細胞粘附分子(NCAM)/CD56(圖3)、微管締合蛋白-2(MAP-2)(圖3)、βIII-微管蛋白和膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)的陽性染色，檢測到神經元和神經膠質細胞。NCAM是據認為對神經上皮中的細胞-細胞相互作用起重要作用的細胞粘附分子。B.Cunningham等人，236Science，799-806(1987)；J.Ritz等人，42Adv.Immuno.，181-211(1988)。MAP-2在大腦微管裝配中起重要的作用。βIII-微管蛋白是神經元特異性標記物，膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)是星形細胞標記物。
向各種譜系的分化胚狀體可分化成各種需要的譜系。例如，可使用與M.Wiles等人〔111Development，259-267(1991)〕用于小鼠的類似技術，使用這些胚狀體獲得造血細胞。在這方面，可在2i.u./ml的促紅細胞生成素或IL-3的存在下，在含有血清的培養基中接種胚狀體。
如果需要心臟譜系，則可使用與T.Doetschman等人〔87 J.Embry.Exper.Morph.，27-45(1985)〕所使用的類似技術。可在沒有添加劑的含血清培養基中接種這些胚狀體。
為了開發神經譜系，可在20ng/ml成纖維細胞生長因子+20ng/ml表皮生長因子的存在下，平板培養這些胚狀體。這與B.Reynolds等人〔255Science，5052(1992)〕所述的技術類似。
因此，本發明提供一種從靈長類動物的ES細胞制備靈長類動物的胚狀體的有效方法。雖然上述工作集中于恒河猴和人的胚胎干細胞(以及經由這些胚狀體由這些干細胞獲得的神經細胞)，但是本文所述的技術應能廣泛地應用于靈長類動物的胚胎干細胞和其它細胞類型。此外，雖然已討論了獲取塊狀物的特殊技術，但本發明不受到這些技術的單獨限制。相反，從基質獲取成塊狀的細胞的其它技術也應是可取的。
因此，本發明不受到本文所述的特殊實施方式的限制。確切地說，應使用權利要求來判斷本發明的全部范圍。
工業應用性本發明提供適合用于進行研究、醫療目的，以及向各種譜系的分化的人和其它靈長類動物的胚狀體。
權利要求
1.一種從粘附在基質上的靈長類動物的胚胎干細胞集落制備靈長類動物的胚狀體的方法，它包括從基質上獲取所述胚胎干細胞的塊狀粘附集落；然后在基本上抑制這些塊狀物與容器粘附的條件下，在容器中培育這些塊狀物，使其聚結成胚狀體。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在促進所述塊狀物以塊狀形式與所述基質分離的酶的存在下進行所述獲取步驟。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述酶是分散酶。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在螯合劑的存在下進行所述獲取步驟。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述獲取步驟包括將所述塊狀物從所述基質上機械刮下。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在胰蛋白酶、鈣和鎂的存在下進行所述獲取步驟。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述培育步驟包括搖動所述容器。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在塑料容器中進行所述培育步驟。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在無血清培養基中進行所述培育步驟。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述靈長類動物的胚胎干細胞是人的胚胎干細胞，所述靈長類動物的胚狀體是人的胚狀體。
11.采用權利要求1所述的方法獲得的靈長類動物的胚狀體。
12.如權利要求11所述的靈長類的胚狀體，其特征在于，所述胚狀體是人的胚狀體。
13.使用權利要求11的胚狀體獲得的分化的靈長類動物的細胞。
14.如權利要求13所述的分化的靈長類動物的細胞，其特征在于，所述細胞是人的細胞。
15.如權利要求14所述的分化的靈長類動物的細胞，其特征在于，所述細胞是人的神經細胞。
全文摘要
從靈長類動物的ES細胞形成靈長類動物胚狀體。所述ES細胞形成塊狀物。然后獲得成塊狀的塊狀物，并在非粘附的條件下進行培育。從靈長類動物的ES細胞發育出胚狀體依賴于這些細胞聚集狀態的維持，因為分離成單個的細胞很快就會死亡。
文檔編號C12N5/02GK1404526SQ01805291
公開日2003年3月19日 申請日期2001年2月20日 優先權日2000年2月21日
發明者J·A·托馬斯, V·S·馬歇爾, J·J·斯威吉爾 申請人:威斯康星校友研究基金會