專利名稱：發(fā)酵法生產l－氨基酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵法生產L-氨基酸的方法。支鏈氨基酸如L-亮氨酸和L-異亮氨酸用于作為食品生產、食物添加劑、合成藥物和農業(yè)化學藥品等等。
相似的，還有許多采用大腸桿菌屬、沙雷氏菌屬、棒狀桿菌屬或者節(jié)桿菌屬微生物來生產L-亮氨酸的方法。采用大腸桿菌屬微生物生產L-異亮氨酸的已知方法包括采用抗thiaisoleucine、異亮氨酸氧肟酸鹽、精氨酸氧肟酸鹽、DL-乙基硫氨酸等的微生物生產的方法(日本已發(fā)表但未經(jīng)審查的專利申請?zhí)柕?30882/93號)；采用抗2-丁酮酸微生物生產的方法(日本已發(fā)表但未經(jīng)審查的專利申請第9982/96號)；采用一種在含有同型絲氨酸作為唯一氮源的培養(yǎng)基中快速生長的微生物生產的方法(日本已發(fā)表但未經(jīng)審查的專利申請第322583/96號)。
然而，上述方法都存在的問題是以相當多的量形成了多種作為副產品的其它非所需L-氨基酸。尤其是，因為在純化的步驟中不容易分離和去除L-纈氨酸，在生產L-亮氨酸或者L-異亮氨酸的方法中，L-纈氨酸的生成導致提高生產成本或者降低了純化的產率和產物的純度。
丙氨酸-纈氨酸轉氨酶(轉氨酶C)催化L-丙氨酸和丙酮酸與2-氧代異戊酸和L-纈氨酸之間可逆的偶聯(lián)轉氨反應，圖示如下L-丙氨酸+2-氧代異戊酸丙酮酸+L-纈氨酸該酶還能催化L-丙氨酸和丙酮酸與2-氧代丁酸和2-氨基丁酸之間可逆的偶聯(lián)轉氨反應，圖示如下
在微生物如大腸桿菌和沙門氏桿菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了編碼丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的基因。至于從大腸桿菌中衍生來的丙氨酸-纈氨酸轉氨酶，已有關于克隆編碼該酶(avtA)的基因和該基因核苷酸序列的報導〔J.Bacteriol.，169，4228(1987)；Gene，65，195(1988)；Science，277，1356(1997)；Genbank，注冊號AE00434(1998)〕。同時有報導指出擴增avtA基因能增加丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的活性〔J.Bacteriol.，169，5610(1987)〕。
以下是關于丙氨酸-纈氨酸轉氨酶生理學作用的報導。
缺乏編碼支鏈氨基酸轉氨酶(轉氨酶B)的基因ilvE的大腸桿菌菌株表現(xiàn)出對L-異亮氨酸的完全需求，而對L-纈氨酸(滲漏表現(xiàn)型)則不然，這說明丙氨酸-纈氨酸轉氨酶涉及催化2-氧代異戊酸成為L-纈氨酸，從而成為替代支鏈氨基酸轉氨酶的第二轉氨酶?！睧scherichiacoli and Salmonella typhimurium，American Society forMicrobiology，Washington，D.C.(1987)〕。而且，通過擴增avtA基因使上述變異菌株對L-纈氨酸(滲漏表現(xiàn)型)的部分需求得到補償〔Escherichia coli and Salmonella typhimurium，AmericanSociety for Microbiology，Washington，D.C.(1987)〕。
然而，目前尚沒有通過增強丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的活性以減少L-纈氨酸生成的報導。
本發(fā)明的公開本發(fā)明的一個目的就是以減少副產品氨基酸的生成量來提供生產L-氨基酸的高效并有工業(yè)優(yōu)勢的發(fā)酵方法。
為了在發(fā)酵生產L-氨基酸的過程中降低副產品即非所需氨基酸的生成，本發(fā)明者作了深入的研究。他們發(fā)現(xiàn)通過加強生產所需的L-氨基酸菌株的丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的活性可以減少不需要的氨基酸的生成；從而他們完成了本發(fā)明。
本發(fā)明涉及以下內容，(1)到(11)。(1)生產L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)可以生產L-氨基酸的微生物，對于它們的親本菌株來說該微生物丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的活性加強了；使L-氨基酸形成并在培養(yǎng)物中富集，并且從培養(yǎng)物中回收該L-氨基酸。(2)根據(jù)(1)的方法，其中該微生物選自突變體、融合細胞系、轉導體和采用DNA重組技術構建的重組菌株。(3)根據(jù)(2)或者(1)的方法，其中微生物選自大腸桿菌屬、沙雷氏菌屬、棒狀桿菌屬或者節(jié)桿菌屬。(4)根據(jù)(1)至(3)的方法，其中微生物為大腸桿菌H-8719/pAD27(FERM BP-7063)或大腸桿菌H-9156/pAD27。(5)根據(jù)(1)的方法，其中L-氨基酸選自L-亮氨酸和L-異亮氨酸。(6)根據(jù)(1)的方法，其中通過增強微生物細胞中丙氨酸-纈氨酸轉氨酶基因表達水平來提高丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的活性。(7)根據(jù)(1)的方法，其中通過增加微生物細胞中丙氨酸-纈氨酸轉氨酶基因的拷貝數(shù)來提高丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的活性。(8)具有生產L-氨基酸的能力，同時與其親本菌株相比丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的活性加強了的微生物。(9)根據(jù)(8)的微生物，選自采用DNA重組技術構建的突變體、融合細胞系、轉導體和重組菌株。(10)根據(jù)(8)或者(9)的該微生物，選自大腸桿菌屬、沙雷氏菌屬、棒狀桿菌屬或者節(jié)桿菌屬。(11)根據(jù)(8)至(10)的微生物，為大腸桿菌H-8719/pAD27(FERMBP-7063)或大腸桿菌H-9156/pAD27。
以下是本發(fā)明的詳細說明。
在本發(fā)明中，任何一種微生物只要它與其親本菌株相比丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的活性加強了，并具有生產L-氨基酸的能力都可以應用。在這里術語“親本菌株”是指用于構建轉導體或者重組菌株、融合細胞系、突變體的起始微生物。與其親本菌株相比丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的活性加強的菌株可能是轉導體或者重組菌株、融合細胞系、突變體中的任何一種。微生物實例包括從大腸桿菌屬、沙雷氏菌屬、棒狀桿菌屬或者節(jié)桿菌屬中篩選出來的微生物。優(yōu)選的實例是所謂棒狀桿菌屬中產谷氨酸的菌株如谷氨酸棒桿菌、Corynebacteriumlactofermentum與大腸桿菌，它們用于氨基酸發(fā)酵生產。
特定的親本菌株實例是能產L-亮氨酸的大腸桿菌H-8719(抗菌株FERM BP-4704誘導產生的4-氮雜亮氨酸的產L-亮氨酸菌株)，與產L-異亮氨酸的大腸桿菌H-9156(FERM BP-5056)。
上述微生物中丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的活性可以加強，方法有如下幾種。
I.采用誘變劑處理帶有丙氨酸-纈氨酸轉氨酶基因的微生物，從中選擇有增強的丙氨酸-纈氨酸轉氨酶活性的突變體。
II.采用體外對丙氨酸-纈氨酸轉氨酶基因引入突變的方法，篩選引入突變后編碼的丙氨酸-纈氨酸轉氨酶活性增強的突變基因。
III.細胞內丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的基因拷貝數(shù)增加的方法。
IV.體外修飾負責丙氨酸-纈氨酸轉氨酶基因表達的序列區(qū)域，以增強該酶基因的表達水平，然后用修飾過的基因取代宿主染色體上編碼丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的基因。
利用誘變劑處理帶有丙氨酸-纈氨酸轉氨酶基因的微生物，然后從中選擇具有增強的丙氨酸-纈氨酸轉氨酶活性的突變體的上述方法可以例如下述的方式實施。用已知方法以誘變劑如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍處理帶有丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的微生物，然后從突變劑處理的微生物中選出與其接受誘變的親本菌株相比丙氨酸-纈氨酸轉氨酶活性增強了的微生物。微生物丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的活性可以測量，例如在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物，將培養(yǎng)的細胞離心，根據(jù)已知的方法破碎所得細胞而制備粗酶溶液，然后用粗酶液和作為底物的L-丙氨酸進行酶促反應，檢測酶促反應生成的L-纈氨酸的量。
采用體外對丙氨酸-纈氨酸轉氨酶基因引入突變，并篩選引入突變后丙氨酸-纈氨酸轉氨酶活性增強的突變基因的方法包括以下內容1)采用位點特異性誘變將堿基缺失、替代或添加引入丙氨酸-纈氨酸轉氨酶基因〔Nucleic Acids Research，10，6487(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，5662(1984)；Science，224，1431(1984)；PCTW085/00817(1985)；Nature，316，601(1985)；Gene，34，315(1985)；Nucleic Acids Research，13，4431(1985)；Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons(1987-1997)〕從而獲得編碼活性高于誘導前水平的丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的基因；2)采用易錯聚合酶鏈式反應將堿基替代隨機引入丙氨酸-纈氨酸轉氨酶基因〔Bio/Technol.，9，1073(1991)(從現(xiàn)在起聚合酶鏈式反應即為PCR)〕從而獲得編碼活性高于誘導前水平的丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的基因。
編碼丙氨酸-纈氨酸轉氨酶基因的拷貝數(shù)可以增加，如克隆丙氨酸-纈氨酸轉氨酶基因以后1)將含有編碼丙氨酸-纈氨酸轉氨酶基因的DNA片段和在所需的微生物細胞中具有自我復制能力的質粒載體連接起來，并將結果得到的質粒引入到該微生物中；或者2)將含有編碼丙氨酸-纈氨酸轉氨酶基因的重組DNA以同源重組或者用噬菌體、轉座子的方法整合到宿主菌株的染色體上。
體外修飾負責丙氨酸-纈氨酸轉氨酶基因表達的序列區(qū)域以增強基因的表達水平，然后用修飾過的基因替代宿主染色體上編碼丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的基因的方法示例包括如下內容1)用已知在作為引入和表達該基因的宿主的微生物中具有強啟動子活性的啟動子代替該基因負責基因表達的序列區(qū)域；并且2)采用上述位點特異性誘變或者易錯聚合酶鏈式反應將堿基缺失、替代或者添加引入到具有負責基因表達的核苷酸序列的DNA中，從突變DNA中篩選與突變前相比編碼丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的基因的表達水平提高的DNA。
用于本發(fā)明編碼丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的基因可以來自任何細胞，優(yōu)選來源于微生物，更優(yōu)選屬于大腸桿菌屬或者沙門氏桿菌屬的微生物。
編碼丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的基因可以通過例如下述的方法獲得。
I.當微生物編碼丙氨酸-纈氨酸轉氨酶基因的核苷酸序列已知時，如大腸桿菌或鼠傷寒沙門氏菌的情況，可以用該微生物的染色體DNA做模板在已知序列的基礎上采用PCR的方法得到該基因。〔PCRProtocols，Academic Press(1990)〕II.細胞具有丙氨酸-纈氨酸轉氨酶活性，而編碼該基因的核苷酸序列未知時，采用傳統(tǒng)的方法建立源于該細胞的cDNA文庫或者染色體DNA文庫〔Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版(1989)(從現(xiàn)在以后簡稱為分子克隆，第二版)〕，然后，1)測量構成文庫的每種細胞的丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的活性，篩選含有編碼丙氨酸-纈氨酸轉氨酶基因的細胞，或者2)采用菌落雜交或噬菌斑雜交方法(分子克隆，第二版)以大腸桿菌或者鼠傷寒沙門氏菌中的丙氨酸-纈氨酸轉氨酶基因作探針從組成文庫的細胞中篩選含有編碼丙氨酸-纈氨酸轉氨酸的基因的細胞。III.當已知染色體DNA的全基因序列但未確定編碼丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的基因時，采用分析軟件如BLAST〔J.Mol.Biol.，215，403(1990)〕或者FASTA〔Methods in Enzymology，183，63(1990)〕從上述全基因中確定具有與大腸桿菌或者鼠傷寒沙門氏菌中的丙氨酸-纈氨酸轉氨酶基因高同源性的核酸序列的基因，然后用PCR得到所需的基因。
克隆avtA基因，即大腸桿菌中編碼丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的基因，可以采用例如以下方式。
首先，以來自大腸桿菌屬微生物的丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的基因序列和其鄰近序列〔Genbank，注冊號AE00434(1998)〕為基礎，設計并合成兩種引物DNA作為一對引物，例如一對引物DNA分別含有已知為SEQ ID NOs1和2的核苷酸序列，同時采用該微生物的染色體DNA作為模板，通過PCR擴增含有avtA基因和其啟動子序列的區(qū)域(約1.9kb)。
將獲得的avtA基因和在引入該基因的微生物細胞中能夠自主復制的質粒載體連接起來，采用傳統(tǒng)的方法將重組載體引入該微生物細胞，由此克隆avtA基因。
在引入編碼丙氨酸-纈氨酸轉氨酶基因的微生物細胞中能夠自主復制的質粒載體，任何一種都可以在本發(fā)明中使用。如果引入該基因的微生物是大腸桿菌，那么任何一種可以在大腸桿菌中自主復制的質粒均可應用。合適的質粒包括ZAP Express〔Stratagene；Strategies，5，58(1992)〕，pBluescript II SK(+)〔Nucleic AcidsResearch，17，9494(1989)〕〕λzap II(Stratagene)，λgt10，λgt11[DNA cloning，A Practicai Approach，1，49(1985)，]λTriplEx(Clontech Laboratories，Inc.)，λBlueMid(ClontechLaboratories，Inc.)，λExCel1(Pharmacia)，pT7T318U(Pharmacia)，pcD2[Mol.Cell.biol.，3，280(1983)]，pUC18[Gene，33，103(1985)]，pUC19[Gene，33，103(1985)]和它們的衍生物。
將avtA基因連接到在引入該基因的微生物細胞中起作用的啟動子的下游位置，來提高編碼丙氨酸-纈氨酸轉氨酶基因的表達水平是可能的。如果引入基因的微生物是大腸桿菌，在宿主細胞中起作用的任何一種啟動子均可應用。合適的啟動子包括從大腸桿菌、噬菌體等衍生而來的多種啟動子如色氨酸啟動子(Ptrp)，乳糖啟動子，PL啟動子，PR啟動子和T7啟動子。人工設計和修飾的啟動子如兩個Ptrps串聯(lián)聯(lián)接的(Ptrp×2)啟動子，tac啟動子，lacT7啟動子和letI啟動子等也可以使用。
優(yōu)選使用SD序列(核糖體結合序列)與起始密碼子距離恰當?shù)馁|粒(如6到18個堿基)。
將質粒引入到引入基因的微生物細胞內的方法實例包括電穿孔即利用強電流將外源DNA引入細胞〔Nucleic Acids Research，16，6127(1988)〕，原生質體法(日本已發(fā)表但未經(jīng)審查的專利申請第248394/88號)。質粒引入大腸桿菌時，采用CaCL2處理提高DNA通透性的方法也有用(分子克隆，第二版)。
攜帶引入的含有編碼丙氨酸-纈氨酸轉氨酶基因的質粒的微生物可以采用該微生物質粒中抗藥基因產生的藥物抗性作為指示篩選出來。接下來通過檢測丙氨酸-纈氨酸轉氨酶活性，以及檢測插入質粒的DNA片段的限制酶切圖譜或者其核苷酸序列可以鑒定如此獲得的轉化體。
用如此獲得的與宿主菌株相比丙氨酸-纈氨酸轉氨酶活性增加的產L-氨基酸菌株，采用發(fā)酵生產L-氨基酸的普通培養(yǎng)辦法就可以生產L-氨基酸。也就是說，進行培養(yǎng)的培養(yǎng)基中含有碳源、氮源、無機鹽、維生素和在合適的溫度、pH條件下菌株有氧生長所需的其他各種成分。
碳源實例包括多種碳水化合物如葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、或者含有上述糖類的糖蜜、纖維素水解產物、粗糖水解產物和淀粉水解產物等。
氮源實例包括氨、各種有機或者無機酸的銨鹽，如氯化銨、硫酸銨、醋酸銨和磷酸銨、胺和其他含氮化合物、蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解物、豆蛋白水解物、豆餅水解物和多種發(fā)酵的微生物細胞及其消化產物。
無機鹽實例包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鐵、硫酸鎂、硫酸銅和碳酸鈣。
培養(yǎng)在有氧條件下進行，例如在通氣條件下?lián)u動或者旋動培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度最好控制在20℃到40℃之間，培養(yǎng)基pH值控制在5到9之間，優(yōu)選保持在中性附近。調節(jié)pH值采用碳酸鈣、有機或者無機酸、堿性溶液、氨或者pH緩沖液等。通常培養(yǎng)1-7天L-氨基酸就會在培養(yǎng)物中生成并積累。
從培養(yǎng)物中回收L-氨基酸可以采用已知的方法例如離子交換樹脂、濃縮、鹽析和沉淀法。〔The Society of Chemical Engineers，Japan(ed.)，Handbook of Bioseparation Process，KyoritsuShuppan(1996)〕本發(fā)明的實施例表示如下。構建這些實施例并非用來限制本發(fā)明的范圍。
將獲得的培養(yǎng)物在4℃以5,000rpm離心10分鐘，收集細胞。將獲得的細胞用TE緩沖液(10mmol/L三羥甲基氨基甲烷，1mmol/L乙二胺四乙酸二鈉鹽，pH7.5)洗滌并收集。采用Saito-Miura方法〔Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)〕從收獲的細胞中分離染色體DNA。
為了以染色體DNA作為模板通過PCR擴增avtA基因，在已知avtA基因及附近的核苷酸序列〔Genbank，注冊號AE00434(1998)〕的基礎上合成寡聚核苷酸引物，分別含有SEQ ID Nos1和2中的核苷酸序列。含有SEQ ID Nos1和2核苷酸序列的DNA是引物，它們含有與avtA基因上游含啟動子的序列和下游序列同源或者互補的序列。
采用上述染色體DNA和引物對通過PCR擴增avtA基因，PCR每個循環(huán)的條件為94℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，72℃ 2分鐘，共設30個循環(huán)。
采用T4 DNA聚合酶將PCR擴增得到的DNA片段(1.9kb)補平，采用內切酶EcoRI和PstI酶切質粒載體pUC19后用T4 DNA聚合酶補平，然后將兩者用T4 DNA連接酶連接。用電穿孔法將上述反應產物轉化大腸桿菌H-8719。獲得的細胞懸液涂布在含有100mg/L氨芐青霉素的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上，接下來于37℃培養(yǎng)24小時。挑選長在瓊脂平板培養(yǎng)基上的克隆，采用多種限制性內切酶分析轉化體攜帶的插入質粒的DNA片段的結構，以此來確認avA基因存在于插入的DNA片段中。
采用下述方式檢測上述轉化體的丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的活性。在LB培養(yǎng)基中30℃振蕩培養(yǎng)(振蕩速度300rpm)24小時以后，分別用8.5g/L的氯化鈉水溶液兩次、緩沖液A(25mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH7.0，50ml/L甘油，0.1mmol/L乙二胺四乙酸三鈉鹽，0.2mmol/L二硫蘇糖醇，0.2mmol/L磷酸吡哆醛)一次懸浮再離心洗滌培養(yǎng)的細胞。然后重新在同一緩沖液中懸浮細胞，濃度為每升100g濕細胞重。超聲波破碎懸浮的細胞，離心制備粗酶液。在緩沖液A中加入10mmol/L的丙酮酸、10mmol/L的L-纈氨酸制得反應液，將獲得的粗酶液(20ul)加入到980ul反應液中，于37℃反應30分鐘。用高效液相色譜(HPLC)檢測生成的L-丙氨酸，來測定丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的活性。高效液相色譜分析如下。柱子YMC ODS-AQ312柱流動相2.94g/L檸檬酸三納，1.42g/L硫酸鈉，63ml/L正丙醇，3g/L十二烷基磺酸鈉，pH3.75(用2mol/L的硫酸調節(jié))。流動相流速2ml/分鐘反應溶液18.5g/L硼酸，11g/L氫氧化鈉，3ml/L Brig-35，0.6g/L鄰苯二醛，2ml/L巰基乙醇反應溶液流速1ml/min熒光檢測激發(fā)波長345nm檢測波長455nm結果發(fā)現(xiàn)，轉化體丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的活性比被視為1的大腸桿菌H-8719高出10倍多，如此得到的質粒命名為pAD27(圖.1)上述步驟獲得的重組大腸桿菌(Escherichia coli)H-8719/pAD27按照布達佩斯條約以保藏號FERM BP-7063于2000年3月2號保存在日本國立生命科學和人體技術研究所(National Institute ofBioscience and Human-Technology，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology，Ministry ofEconomy，Trade and Industry，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，305-0046，日本)。
從大腸桿菌H-8719/pAD27的培養(yǎng)細胞中提取質粒pAD27，采用電穿孔法將該質粒轉化到產L-異亮氨酸的大腸桿菌H-9156中。
采用先前所述的同種方法篩選抗氨芐青霉素的轉化體得到帶有pAD27的重組大腸桿菌H-9156/pAD27。測量轉化體丙氨酸-纈氨酸轉氨酶活性的方法也同前所述。結果證實了轉化體丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的活性比被視為1的大腸桿菌H-9156高出10倍多。實施例2L-亮氨酸的生產測試檢測大腸桿菌H-8719，攜帶含avtA基因的質粒pAD27的大腸桿菌H-8719/pAD27以及攜帶質粒載體pUC19的大腸桿菌H-8719/pUC19生產L-亮氨酸的能力，可以采用下述方法。
將H--8719/pAD27和H-8719/pUC19分別涂布到含有l(wèi)00mg/L氨芐青霉素的LB瓊脂糖平板培養(yǎng)基上，同時H-8719涂布到不含有氨芐青霉素的LB瓊脂糖平板培養(yǎng)基上。每種菌株均在30℃培養(yǎng)24小時。取一接種環(huán)的培養(yǎng)細胞接入6ml種培養(yǎng)基(20g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，2.5g/L氯化鈉，以及10g/L碳酸鈣，pH7.4)，接下來于30℃在大試管(直徑25mm，長200mm)中振蕩培養(yǎng)(振蕩速度300rpm)17小時。將獲得的培養(yǎng)物(0.1ml)轉移到6ml生產培養(yǎng)基(65g/L葡萄糖，2g/L玉米漿，16g/L硫酸銨，2g/L磷酸氫二鉀，40g/L磷酸鎂，以及10g/L碳酸鈣，pH7.0)，然后于30℃在大試管(直徑25mm，長200mm)中振蕩培養(yǎng)(振蕩速度300rpm)48小時。
培養(yǎng)完成以后，采用HPLC來檢測生成并富集在培養(yǎng)物中的L-亮氨酸，同時檢測副產品L-纈氨酸(方法同實施例1中檢測L-丙氨酸)。
上述培養(yǎng)物的檢測獨立測試20次，所得結果的平均值如表1所示。表1

平均值(n＝20)上述三個菌株表現(xiàn)出幾乎相同的生產L-亮氨酸的能力。菌株H-8719/pAD27中avtA基因的表達水平提高了，它的作為副產品的L-纈氨酸和L-亮氨酸的比值與宿主菌H-8719的相比有恒定的降低，降低率大約為54％。
上述結果表明，副產品L-纈氨酸的生成會干擾發(fā)酵產品L-亮氨酸的純化，但是產L-亮氨酸菌株中avtA基因編碼的丙氨酸-纈氨酸轉氨酶活性的提高可以顯著降低副產品L-纈氨酸生成。實施例3L-異亮氨酸的生產檢測檢測大腸桿菌H-9156，攜帶含avtA基因的質粒pAD27的大腸桿菌H-9156/pAD27以及攜帶質粒載體pUC19的大腸桿菌H-9156/pUC19生產L-異亮氨酸的能力，可以采用下述方法。
將H-9156/pAD27和H-9156/pUC19分別涂布到含有100mg/L氨芐青霉素的LB瓊脂糖平板培養(yǎng)基上，同時H-9156涂布到不含有氨芐青霉素的LB瓊脂糖平板培養(yǎng)基上。每種菌株均在30℃培養(yǎng)24小時。取-接種環(huán)的培養(yǎng)細胞接入6ml種培養(yǎng)基(20g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，2.5g/L氯化鈉，以及10g/L碳酸鈣，pH7.4)，接下來于30℃在大試管(直徑25mm，長200mm)中振蕩培養(yǎng)(振蕩速度300rpm)17小時。將獲得的培養(yǎng)物(0.1ml)轉移到6ml生產培養(yǎng)基(65g/L葡萄糖，2g/L玉米漿，16g/L硫酸銨，2g/L磷酸氫二鉀，0.1g/L DL-蛋氨酸，40g/L磷酸鎂，以及10g/L碳酸鈣，pH7.0)，然后30℃在大試管(直徑25mm，長200mm)中振蕩培養(yǎng)(振蕩速度300rpm)48小時。
培養(yǎng)完成以后，采用HpLC檢測生成并富集在培養(yǎng)物中的L-亮氨酸，同時檢測副產品L-纈氨酸。檢測條件同實施例2所述。
上述培養(yǎng)物的檢測獨立測試20次，取得的平均值如表2所示。表2

平均值(n＝20)上述三個菌株表現(xiàn)出幾乎相同的生產L-異亮氨酸的能力。菌株H-9156/pAD27中avtA基因的表達水平提高了，它的作為副產品的L-纈氨酸和L-異亮氨酸的比值與宿主菌H-9156的相比有恒定的降低，降低率大概為48％。
上述結果表明，副產品L-纈氨酸的生成會干擾發(fā)酵產品L-異亮氨酸的純化，但是產L-異亮氨酸菌株中avtA基因編碼的丙氨酸-纈氨酸轉氨酶活性的提高可以顯著降低副產品L-纈氨酸生成。
工業(yè)適用性根據(jù)目前的情況，采用丙氨酸-纈氨酸轉氨酶(轉氨酶C)活性提高并具有產L-氨基酸能力的微生物，降低發(fā)酵過程中生成干擾發(fā)酵產品L-氨基酸純化的副產品氨基酸是可能的，如此以來能夠提供具有工業(yè)優(yōu)勢的生產L-氨基酸的方法。
無序列文本SEQ ID NO1-人工序列的描述合成的DNASEQ ID NO2-人工序列的描述合成的DNA
關于保藏的微生物的說明(PCT實施細則第13條之二)







PCT/RO/134表序列表<110>KYOWA HAKKO KOGYO CO.，LTD<120>發(fā)酵法生產L-氨基酸的方法<130>11290WOl<140><141><150>JP 00/83648<151>2000-3-24<160>2<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>1tcgactgtct ggcgcagatg gatacgacct30<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>2cctgataagc gtagcgcatc aggcaatttt30
權利要求
1.生產L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產生L-氨基酸的微生物，相對于其親本菌株該微生物的丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的活性增強；使L-氨基酸形成并在培養(yǎng)物中積累，以及從培養(yǎng)物中回收該L-氨基酸。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中該微生物選自突變體、融合細胞系、轉導體和采用DNA重組技術構建重組菌株。
3.根據(jù)權利要求1或2的方法，其中微生物選自大腸桿菌屬、沙雷氏菌屬、棒狀桿菌屬或者節(jié)桿菌屬。
4.根據(jù)權利要求1至3的方法，其中微生物為大腸桿菌H-8719/pAD27(FERM BP-7063)或大腸桿菌H-9156/pAD27。
5.根據(jù)權利要求1的方法，其中L-氨基酸選自L-亮氨酸和L-異亮氨酸。
6.根據(jù)權利要求1的方法，其中通過增加該微生物細胞中丙氨酸-纈氨酸轉氨酶基因的表達水平來增強該微生物的丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的活性。
7.根據(jù)權利要求1的方法，其中通過增加該微生物細胞中丙氨酸-纈氨酸轉氨酶基因的拷貝數(shù)來增強該微生物的丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的活性。
8.具有生產L-氨基酸的能力的微生物，與其親本菌株相比其丙氨酸-纈氨酸轉氨酶的活性增強。
9.根據(jù)權利要求8的微生物，選自突變體、融合細胞系、轉導體和由DNA重組技術構建的重組菌株。
10.根據(jù)權利要求8或9的微生物，選自大腸桿菌屬、沙雷氏菌屬、棒狀桿菌屬或者節(jié)桿菌屬。
11.根據(jù)權利要求8至10任一項的微生物，為大腸桿菌H-8719/pAD27(FERM BP-7063)或大腸桿菌H-9156/pAD27。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有工業(yè)優(yōu)勢的用發(fā)酵法生產L－氨基酸的方法,其中具有產L－氨基酸能力并攜帶編碼丙氨酸－纈氨酸轉氨酶(轉氨酶C)的基因avtA的微生物,與其親本菌株相比該轉氨酶活性增強,因此采用該微生物降低在純化發(fā)酵法生產的L－氨基酸時引起問題的副產品氨基酸的量。
文檔編號C12P13/00GK1423703SQ01808110
公開日2003年6月11日 申請日期2001年3月23日 優(yōu)先權日2000年3月24日
發(fā)明者池田正人, 矢之崎誠, 阿部彌生, 高野純一 申請人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社