專利名稱：具有將甾醇轉化為雄-4-烯-3，17-二酮/雄-1，4-二烯-3，17-二酮能力的微生物及其制備 ...的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物——偶發分枝桿菌(Mycobacterium fortivtum)EUG-119，它具有極好的將甾醇轉化為雄-4-烯-3，17-二酮和雄-1，4-二烯-3，17-二酮的能力，及其制備方法和用途，更具體的說，是一種具有比以前所知的微生物的轉化率高4倍甚至更多的微生物，和微生物的制備方法及其在制備雄-4-烯-3，17-二酮和雄-1，4-二烯-3，17-二酮中的用途。
現有技術甾醇類是一種由腎上腺皮質、睪丸、卵巢、胎盤或黃體釋放的分泌性激素，皆由膽固醇合成。根據它們的生理活性大約可分為如下5類雄性性激素(雄酮，睪酮等)和雌性性激素(雌二醇等)，它們分別在男性和女性的第二性征發育中起關鍵作用，孕激素(孕酮等)刺激和維持懷孕，糖皮質激素(可的松，氫化可的松等)通過分解蛋白質來刺激糖異生作用和提高肝糖原水平，鹽皮質激素(脫氧皮質酮，醛固酮等)在維持體內電解質和水的平衡中發揮重要作用。
隨著文明的進步，出現了許多疾病，由于在這些疾病的治療中廣泛使用類固醇激素，人們生活壓力的增加和暴露在環境激素之下都導致體內上述激素水平的不平衡。特別是合成雌激素基本上用于人工受精和不育癥患者的治療，以及糖皮質激素在減輕多種炎癥，如虹膜炎、關節炎等引起的疼痛中起作用。此外，致命的阿狄森氏癥也可通過施用脫氧皮質酮和氫化可的松治療。
為滿足上述增長的需求，已有大批研究者致力于類固醇激素的體外合成，而其中之一涉及用微生物制備類固醇激素前體。Mamoli和Vercellone(Ber.70470和Ber.702079，1937)報道通過酵母發酵將17-酮-類固醇還原成17-β-羥類固醇。還有，Peterson和Murray在美國專利No.2,602,769中公開了一種用根霉屬真菌產生孕酮的11-α-羥化方法，以及Kraychy在美國專利No.3,684,657中公開了一種用分枝桿菌屬從包含17-烷基的類固醇生成雄-4-烯-二烯-3，17-二酮，雄-1，4-二烯-3，17-二酮和20α-羥甲基孕-1，4-二烯-3-酮的方法。
為了大量生產類固醇激素產物，試圖使用甾醇為唯一碳源分離微生物和改變甾醇結構用作發酵的底物，還用能防止甾醇核降解的化學添加劑(如金屬、金屬吸和金屬還原劑)來提高類固醇的收得率，這一努力已獲得很大進展(Marsheck等，Applied microbiology.23(1).72-77，1972)。此外，還開展了通過物理和化學手段對從土壤中分離出的微生物進行突變來提高類固醇前體產率的研究，特別是Upjohn公司在美國專利No.4,293,644中描述了一種通過一分枝桿菌(ATCC 29472)的突變株從多種類固醇中得到以高產量的雄-4-烯-3，17-二酮(在下文用AD表示)為主，并有少量雄-1，4-二烯-3，17-二酮(在下文用ADD表示)的產物的方法。
為與類固醇激素藥物需求的增長相適應，就需要大量生產上述的激素前體，尤其是AD和ADD，它們是體外合成類固醇的重要前體化合物。然而，以前已知的微生物合成AD和ADD的產率低。從這一點考慮，急需開發具有從甾醇到AD和ADD的高轉化率的微生物。
發明的公開本發明的發明者所進行的許多實驗的結果發現，偶發分枝桿菌(ATCC 29472)的突變株偶發分枝桿菌EUG-119具有極好的從甾醇到AD和ADD的轉化效率，本發明也是在這一結果的基礎上完成的。
因此，本發明的目的是提供一種具有極好的從甾醇到AD和ADD的轉化效率的突變微生物。
本發明的另一個目的是提供一種制備具有極好的從甾醇到AD和ADD的轉化效率的突變微生物的方法。
提供一種用具有極好的從甾固醇到AD和ADD的轉化效率的突變微生物來制備AD和ADD的方法也是本發明的一個目的。
為達到上述目的，本發明提供了一種制備偶發分枝桿菌EUG-119(于2001年4月14日保藏在韓國微生物培養中心(KCCM)，登記號為NO.KCCM-10259)的方法該方法包括以下步驟(a)在含甾醇培養基中培養偶發分枝桿菌ATCC 29472株；(b)用亞硝基鳥胍(NTG)處理培養的偶發分枝桿菌；(c)使經亞硝基胍處理的細菌在補充甾醇或者AD和ADD(濃度為0.1-0.2g/L)的培養基中生長，借此可篩選出在加甾醇培養基中生長迅速而在加AD和ADD的培養基中生長緩慢的突變株。
制備本發明AD和ADD的方法包括在含甾醇的液體培養基中培養突變微生物偶發分枝桿菌EUG-119和從培養基中回收AD和AD的步驟。
附圖簡述

圖1是在偶發分枝桿菌EUG-119的培養基中AD和ADD的高效液相色譜圖。
實施本發明的最佳方案根據本發明，使用偶發分枝桿菌(ATCC 29472)，它能通過發酵從膽固醇轉化為類固醇。
為制備本發明的偶發分枝桿菌EUG-119，首先使偶發分枝桿菌(ATCC 29472)生長至O.D.0.6到0.8，然后用能殺死99.95生物的量的亞硝基胍(NTG)處理。NTG是一種常用于產生微生物突變株的化合物，它通過將鳥嘌呤的C6位甲基化在DNA復制時通過AT對替換GC對來誘導突變。NTG的量是每5ml培養基300至400μg，優選的量為每5ml 330μg。此外，突變還可由紫外線照射、INH(異煙肼)或其它的致突變化合物完成。
從經NTG處理過的菌株中選出在加甾醇固體培養基中生長迅速而在加AD和ADD的固體培養基中生長緩慢的突變株，最后通過燒瓶培養得到具有最高轉化率的突變株偶發分枝桿菌EUG-119。
任選地，在篩選菌株時所用的甾醇或AD和ADD以0.1到0.2g/L，優選0.4到0.6g/L的量加入培養基中。甾醇可選自谷固醇、膽固醇、豆固醇和菜油固醇，優選的是膽固醇。
通過上述方法制備的偶發分枝桿菌EUG-119于2001年4月14日保藏在韓國微生物培養中心(KCCM)，登記號為NO.KCCM-10259。
在本發明的一個實施方案中，培養了最終選出的突變株偶發分枝桿菌EUG-119，并分析它從膽固醇到AD和ADD的轉化率，在小規模培養時，該突變株的轉化率比野生型菌株高約2.3倍，而在大規模培養時則約高4.2倍。從經一般分離和純化操作的2L突變菌株培養基中回收到純化率約為80％的AD和ADD。發現培養2天后，突變株產生了比野生株濃度高的AD和ADD。
因此，本發明的偶發分枝桿菌EUG-119可用于大量生產AD和ADD。這種方法包括在含甾醇的液體培養基中培養偶發分枝桿菌EUG-119和從培養基中回收AD和ADD的步驟。
當本發明的偶發分枝桿菌EUG-119用于制備用作類固醇激素合成的前體的AD和ADD時，可獲得高產量的AD和ADD。
將通過引用以下實施例并結合附圖更詳細的解釋本發明。然而舉以下實施例僅為說明本發明，但本發明并不限于這些實施例。
實施例1突變株的制備為誘導突變，將分枝桿菌(ATCC 29472)接種到YNG培養基中，并培養至O.D.0.6到0.8，然后離5ml培養液，得到一個細胞團。用含0.5％Tween 80的0.1M無菌檸檬酸鈉緩沖液(pH5.6)洗滌細胞團兩次，并重懸于5ml緩沖液中，然后將濃度為330μg/ml的NTG加入細胞懸浮液中。將經NTG處理的細胞懸浮液于37℃振蕩培養90分鐘，然后離心，得到一細胞團，細胞團用0.1M無菌磷酸鈉緩沖液(pH7.0)洗滌三次，并重懸于該緩沖液中。將最終的細胞懸浮液加到SM1固體培養基上，于37℃培養3-4天以形成克隆。
實施例2突變株的篩選將實施例1所得的克隆接種到MS1，MS1+膽固醇，MS1+ADD(或AD)和YNG固體培養基中，于30℃培養3天以選出在含膽固醇培養基(MS1+膽固醇培養基)中生長迅速而在含ADD(或AD)的培養基中生長緩慢的菌株，所選出的菌株稱為偶發分枝桿菌EUG-119。MS1培養基是極限無機培養基，用作對照，表1列出了培養基的組成。
表1

實施例3偶發分枝桿菌EUG-119k從膽固醇到AD和ADD轉化率的研究將實施例2中選出的突變株偶發分枝桿菌EUG-119在5ml YNG培養液中預培養，然后于30℃，200rpm培養120小時，培養基為100ml含1g葡萄糖，0.5g酵母提取物，0.01g Tween80和各種無機鹽的SM4發酵培養基(見表1)。由于膽固醇在培養基中不能很好的溶解，而溶于丙酮，因此將丙酮溶中的膽固醇懸液以每100ml0.1g膽固醇的量加入培養基中。培養后，用乙醚和石油醚抽提培養液，并用2-丙醇溶解提取物，然后用HPLC分析該溶液中由偶發分枝桿菌EUG-119從膽固醇產生AD和ADD的量。從膽固醇到AD和ADD的轉化率由AD和ADD的摩爾濃度與加入的膽固醇的摩爾濃度的比值計算的產率來表示。還研究了野生菌株偶發分枝桿菌(ATCC 29472)的AD和ADD的產量及轉化率。結果列于表2中。
表2

注產率＝產生的AD和ADD的摩爾濃度/加入的膽固醇的摩爾濃度如表2所示，突變株偶發分枝桿菌EUG-119顯示比野生菌株偶發分枝桿菌(ATCC 29472)高2.3倍的從膽固醇到AD和ADD的轉化率。
實施例4將用實施例3相同的方法制備的、在100ml培養液中預培養的突變株接種到含有2.5L無菌培養基(pH8.0)的5L發酵罐，并于1vvm(通氣流量)，30℃，600rpm振蕩培養120小時。以5g/L的量加入丙酮中溶解的膽固醇。用與實施例3相同的方法分析AD和ADD的產量及從膽固醇到AD和ADD的轉化率，結果列于表3中。
表3

如表3所示，突變株偶發分枝桿菌EUG-119顯示比野生菌株高4.2倍的轉化率。
實施例5從實施例4制備的培養液中純化AD和ADD。將2.5L培養液調至pH3.0，并于4℃下以5000rpm離心10分鐘。通過懸浮于70％丙酮提取所得的生物量團，并過濾丙酮蒸發后，保持在5-10℃，使激素沉淀。所得沉淀物經過濾并于55℃干燥，將干燥的測定物加入己烷中以除去殘余膽固醇，然后再過濾和干燥，回收所得的粗激素中間物。激素中間物的回收率列于表4中。
表4

如表4所示，突變株偶發分枝桿菌EUG-119的2.5L培養液中得到的激素中間物的純化率約為80％。
實施例6用HPLC測量由野生型偶發分枝桿菌和突變株偶發分枝桿菌EUG-119產生的激素中間物濃度。含野生型或突變型偶發分枝桿菌的培養液用四倍體積的按1∶l的雙乙醚和石油醚的混合液抽提2次，然后將溶劑蒸發。提取的激素懸浮于異丙基乙醇，并借助HPLC以Pegasil ODS(4.6×250，5μm，120，Senshu Pak，Japan)作為層析柱，在流速1.0ml/min，2,700psi和250nm的條件下作定量分析，流動相用50％的THF(見圖1)分析。
結果表明，培養2天后，突變株偶發分枝桿菌EUG-119產生AD和ADD的水平高于野生菌株偶發分枝桿菌ATCC 29472。
實施例7用已知方法研究突變株偶發分枝桿菌EUG-119的真菌學特性，結果如下。
偶發分枝桿菌EUG-119可在30-35℃下利用糖包括葡萄糖、多糖、甘油、脂肪酸等作為碳源。同時，偶發分枝桿菌EUG-119作為革蘭氏陽性菌株，其細胞壁中含有大量脂肪并生長形成黃色克隆。
總之，本發明的偶發分枝桿菌EUG-119顯示與已知偶發分枝桿菌ATCC 29472類似的形態學和物理特性，但具有極好的通過發酵作用將甾醇轉化成AD和ADD的能力。
工業應用如上所述，本發明的偶發分枝桿菌EUG-119與以前已知的微生物，特別是偶發分枝桿菌ATCC 29472相比，具有極好的從甾醇到AD和ADD的轉化率。因此，本發明的偶發分枝桿菌EUG-119對類固醇激素的大量生產是很有用的。
權利要求
1.偶發分枝桿菌EUG-119(KCCM-10259)衍生自偶發分枝桿菌(ATCC 29472)，能將甾醇轉化為雄-4-烯-3，17-二酮和雄-1，4-二烯-3，17-二酮。
2.如權利要求1所述的偶發分枝桿菌EUG-119，其特征在于，所述甾醇選自谷固醇、膽固醇、豆固醇和菜油固醇。
3.制備偶發分枝桿菌EUG-119(于2001年4月14日保藏在韓國微生物培養中心(KCCM)，登記號為NO.KCCM-10259)的方法包括以下步驟(a)在含甾醇培養基中培養偶發分枝桿菌ATCC 29472株；(b)用亞硝基胍處理培養的偶發分枝桿菌；(C)使經亞硝基胍處理的細菌在補充甾醇或者以濃度為0.1-0.2g/L的雄-4-烯-3，17-二酮和雄-1，4-二烯-3，17-二酮的培養基中生長，借此可篩選出在加甾醇培養基中生長迅速而在加雄-4-烯-3，17-二酮和雄-1，4-烯-3，17-二酮的培養基中生長緩慢的突變株。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述甾醇選自谷固醇、膽固醇、豆固醇和菜油固醇。
5.制備雄-4-烯-3，17-二酮和雄-1，4-二烯-3，17-二酮的方法，所述方法包括在含甾醇的液體培養基中培養偶發分枝桿菌EUG-119和從培養基中回收雄-4-烯-3，17-二酮和雄-1，4-二烯-3，17-二酮的步驟。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述甾醇選自谷固醇、膽固醇、豆固醇和菜油固醇。
全文摘要
公開的是一種具有極好的將甾醇轉化為雄－4－烯－3，17－二酮(AD)和雄－1，4－二烯－3，17－二酮(ADD)能力的微生物，和微生物的制備方法及其用途，更具體的說，是偶發分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)ATCC 29472的突變株——偶發分枝桿菌EUG－119，和制備突變株的方法及其在制備AD和ADD中的用途。本發明的突變株與已知微生物相比，具有極好的將甾醇轉化為AD和ADD的能力，AD和ADD是類固醇激素前體，因此，對類固醇激素的大量生產非常有用。
文檔編號C12N1/20GK1507489SQ02809664
公開日2004年6月23日 申請日期2002年5月10日 優先權日2001年5月11日
發明者盧承權, 金明國, 尹源泰, 樸敬文, 樸相玉 申請人:優俊科學公司