專利名稱：一種新型空氣微生物采樣液的制作方法
技術領域：
空氣微生物對人類健康帶來的危害日益嚴重并逐步引起各方關注。空氣微生物中一種或多種組分會對暴露其中對象的健康產生影響。空氣微生物與很多疾病有關，它們或作為過敏原引起過敏反應(如真菌孢子)；或作為傳染原引起傳染病(如結核分枝桿菌)；而且有些較低濃度的空氣微生物就可以引起急性或慢性的健康損害。由于當今生活水平和生活質量的提高，人們對空氣質量的要求也愈來愈高。所以準確地監測室內外環境空氣中的微生物污染，對制定環境標準，消除污染危害和保證人民健康都是十分必要的。
背景技術：
空氣微生物分析的第一步是必須將空氣中的微生物收集在固體、半固體或液體基質中，然后才能進行后續的生物學、物理學、和化學分析。無論是固體還是液體的采樣基質在應用時都會碰到氣流撞擊的問題，在這種沖擊下如何能保證微生物的存活是一個比較棘手的問題，所以研制一種能夠保證微生物存活和適應后續檢測的新型采樣液就有著十分重要的意義。微生物尤其是細菌的生長速度很快，例如大腸桿菌每20分鐘就能繁殖一代，如果采樣液中含有刺激細菌繁殖的物質，那么細菌數目在采樣和遞送至分析和檢測的幾個小時之內會有驚人的增長，這就造成了對采樣樣品的過高估計。過高估計樣品中的細菌數目會造成假陽性結果，這就會導致人們對本來不具危害地區采取措施，造成人力和財力的浪費。所以選取采樣液時的一個準則是保持樣品完整。既不能刺激生長，也不能對樣品造成危害。例如有些報道使用培養基來直接采樣，如果是在夏季高溫下進行采樣而又未能及時進行分析，則采樣液中的微生物尤其是細菌就會很快繁殖，造成一個不可信的結果。
目前國際上對于空氣微生物采樣液的使用還沒有一個普遍認可的方案，在使用采樣液時基本上是各行其是。隨意使用采樣液的后果是可能低估或高估空氣微生物的含量，這就給實驗結果的解釋帶來了一定困難。例如有人使用的采樣液是最單純的無菌水，而有人使用一些簡單的無機鹽緩沖液，這些采樣液僅起到一個收集作用，對微生物的保護和穩定作用較差，也不能滿足我們在某些特殊條件下的需要(比如在冷凍溫度下使用)。保證存活對于微生物的分離培養和鑒定是十分必要的，因此研制新型空氣微生物采樣液具有十分重要的意義。

發明內容
本發明目的在于提供一種空氣微生物采樣液。
本發明目的是通過如下技術方案實現的本發明空氣微生物采樣液含有如下組合物0.05mol/L PBS〔磷酸鹽緩沖液〕150-300體積份〔重量體積比為g/ml〕、肌醇10-30重量份、海藻糖10-30重量份、甜菜堿1.0-5.0體積份、甘油100-350體積份、去離子水300-800體積份；采樣液中0.05mol/L PBS 150-300體積份可以用1mol/L Tris-HCl 5-15體積份替代；其中0.05mol/L PBS由40重量份NaCl，1.0重量份KCl，7.2g Na2HPO4，1.2重量份KH2PO4，1體積份(重量體積比為g/L)H2O，pH7.4制成；1mol/L Tris-HCl由121重量份Tris堿，1體積份(重量體積比為g/L)H2O，pH調至7.4制成；上述組合物加入常規溶劑制成采樣液。
與常規采樣液相比，本發明采樣液能夠保持樣品完整，既不刺激空氣微生物的生長，同時具有較好的保護效果。本發明采樣液同時具有一定的抗凍、抗蒸發能力，可以在零下10攝氏度使用，在夏季使用可具有一定的抗蒸發性。
采樣是空氣微生物分析和檢驗的第一個步驟，而采樣液是空氣采樣得以實現的必要條件和手段，采樣液的使用直接關系到樣品的處理、分析和檢測效果，因此采樣液研究對于環境監測、衛生檢驗、流行病學調查、工程菌污染評估、空氣過敏源確定等方面都具有重要的意義。隨著人們生活水平的提高，人們對環境衛生愈加重視，對空氣質量要求越來越高，能夠用于大部分空氣微生物檢測的新型采樣液會有一定的需求量。
實驗例1正交實驗選取0.05mol/L PBS(40g NaCl，1.0g KCl，7.2g Na2HPO4，1.2g KH2PO4，1L H2O，pH7.4)或1mol/L Tris-HCl(121g Tris堿，pH調至7.4)(為了統計處理方便，這兩種成分以下簡稱(A)，肌醇(B)，海藻糖(C)，甜菜堿(D)和甘油(E)五種成分作為采樣液的組成部分，每個成分取三個濃度，利用正交實驗設計來測試靜態下各種成分對細菌的保護作用。實驗基礎來自正交表L27(313)，每個成分的三個濃度即為三個不同的實驗水平，五種成分即為實驗所涉及的因素數，即我們實驗中所選用的各種試劑，正交表第一列的1-27代表實驗次數，即將要進行27個平行實驗(表1，表2)。此外根據試劑性質和工作經驗，考慮三個交互作用AB，AC，AE。
表1.27次試驗正交安排表試驗號1(A)2(B)5(C)8(E) 11(D)1 1 1 1 1 12 1 1 2 2 23 1 1 3 3 34 1 2 1 2 35 1 2 2 3 16 1 2 3 1 27 1 3 1 3 28 1 3 2 1 39 1 3 3 2 110 2 1 1 1 111 2 1 2 2 212 2 1 3 3 313 2 2 1 2 314 2 2 2 3 115 2 2 3 1 216 2 3 1 3 217 2 3 2 1 318 2 3 3 2 119 3 1 1 1 120 3 1 2 2 221 3 1 3 3 322 3 2 1 2 323 3 2 2 3 124 3 2 3 1 225 3 3 1 3 226 3 3 2 1 327 3 3 3 2 1
表2.正交表中的各個因素及其水平因素 A(PBS or B C E DTris)水平10.01mol/L 0.5％0.5％ 5％ 0.1mol/L水平20.02mol/L 1％ 1％ 10％ 0.2mol/L水平30.05mol/L 2％ 2％ 30％ 0.5mol/L此正交設計針對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和粘質沙雷氏菌均同時開展實驗。具體實驗步驟為，將9.5ml最終配方液體置于大試管內，加入0.5ml菌液，室溫放置30min，然后從每個大試管中取1ml涂布兩個營養瓊脂平板，37℃倒置培養12小時后計菌落數。實驗對照組為10ml無菌去離子水。完畢后用SAS統計軟件進行分析，根據分析結果選取保護效果較好的前8種，命名為Samplution PX1，PX2，PD1，PD2，TX1，TX2，TD1和TD2。其中X代表夏用型，D代表冬用型。
表3六次正交實驗結果結果(P1/P2/T1/T2/粘沙/金葡) 存活率％ 存活率提高百分點％管號(單位CFU) 計數結果/菌總數×100％ (計數-對照)/菌總數×100％1335/143/157/242/756/24389.8/77.3/53.2/71.8/99.5/10568.9/48.1/44.1/17.5/33.2/31.02350/138/175/229/748/20593.8/74.6/77.6/68.0/98.4/89.1 72.9/45.4/50.2/13.6/32.1/14.53264/108/141/238/648/18470.8/58.4/47.8/70.6/85.3/79.2 49.9/29.2/38.6/16.3/18.9/4.514266/76 /146/238/666/16971.3/41.1/49.5/70.6/87.6/73.5 50.4/11.9/40.3/16.3/21.3/-1.15265/167/160/261/771/22371.0/90.3/54.2/77.4/100 /97.0 50.1/61.1/45.1/23.1/35.1/22.36307/172/163/265/690/23382.3/93.0/55.3/78.6/90.8/10161.4/63.8/46.1/24.3/24.5/26.77364/161/162/247/739/20797.6/86.5/54.9/73.3/97.2/90.0 76.7/57.8/45.8/19.0/30.9/15.48252/108/118/269/693/22367.6/58.4/40.0/79.8/91.2/97.0 46.6/29.2/30.8/25.5/24.9/22.39336/149/152/277/672/17190.1/80.5/51.5/82.2/88.4/74.3 69.2/51.4/42.4/27.9/22.1/0.010314/141/127/252/752/27784.2/76.2/43.1/74.8/98.9/12063.3/47.0/38.6/20.5/32.6/45.811327/150/165/262/672/21887.7/81.0/55.9/77.7/88.4/94.8 66.8/51.9/41.7/23.4/22.1/20.112240/98 /97 /236/618/19964.3/53.0/32.9/70.0/81.3/86.5 43.4/23.8/24.1/15.7/15.0/11.913258/107/117/235/686/19969.2/57.8/39.7/69.7/90.3/86.5 48.3/28.6/27.1/15.4/23.9/11.914331/146/185/211/683/27388.7/78.9/62.7/62.6/89.9/11967.8/49.7/40.3/8.30/23.6/47.115341/147/179/170/645/19591.4/79.5/60.7/50.4/84.9/84.8 70.5/50.2/40.7/-3.9/18.6/10.216319/157/141/195/739/22785.5/84.9/47.8/57.9/97.2/98.7 64.6/55.7/44.1/3.60/30.9/24.117204/87 /104/235/676/20254.7/47.0/35.3/69.7/88.9/87.8 33.8/17.8/20.3/15.4/22.6/13.018342/129/139/340/756/18691.7/69.7/47.1/100 /99.5/80.9 70.8/40.5/34.6/46.6/33.2/6.2519295/133/125/308/745/21479.1/71.9/42.4/91.4/98.0/93.0 58.2/42.7/35.9/37.1/31.7/18.420346/135/151/289/718/20392.8/73.0/51.2/85.8/94.5/88.3 71.8/43.8/36.6/31.5/28.2/13.621216/99 /91 /240/569/19257.9/53.5/30.8/71.2/74.9/83.5 37.0/24.3/24 4/16.9/0.09/8.8622223/80 /123/190/670/20959.8/43.2/41.7/56.4/88.2/90.9 38.9/14.1/18.0/2.00/21.8/16.323292/139/153/285/745/20078.3/75.1/51.8/84.6/98.0/87.0 57.4/45.9/38.0/30.3/31.7/12.324352/135/143/326/741/18494.4/73.0/48.5/96.7/97.5/80.0 73.5/43.7/36.6/42.1/31.2/5.3825324/151/144/279/679/19686.9/81.6/48.8/82.8/89.3/85.2 66.0/52 4/42.0/28.5/23.0/10.626194/99 /93 /220/558/19652.0/53.5/31.5/65.3/73.4/85.2 31.1/24.3/24.4/11.0/0.07/10.627324/141/130/248/662/16286.9/76.2/44.1/73.6/87.1/70.4 66.0/47.0/38.6/19.3/20.8/-4.1
說明大腸桿菌包括P1，P2，T1，T2四次試驗，粘質沙雷氏菌(表中簡稱粘沙)和金黃色葡萄球菌(表中簡稱金葡)各一次。P1，P2，T1，T2，粘沙和金葡六個對照0min結果依次為；373，185，295，337，7602和302 CFU，60min后對照組結果依次為78，54，27，183，504和172 CFU。
正交試驗結果表明采樣液與對照組相比，在靜態下對三種細菌保護效率平均提高58.2％，40.5％，44.1％，20.5％(大腸桿菌四次實驗)，24.7％(粘質沙雷氏菌)和15.4％(金黃色葡萄球菌)。SAS統計結果表明，成分D在整個采樣液中所起的顯著性作用比較明顯。AB、AC和AE之間都沒有明顯的交互作用(表3)。在幾種試劑之間并不存在著交互作用，這意味著幾種試劑可以以任意比例混溶，對采樣液定型設計有很大的方便。
實驗例28種Samplution進行抗凍、抗蒸發和初步應用實驗。
將冬用型Samplution 10ml置入-20℃冰箱中放置，30min觀察是否結冰。將10ml Samplution置于10ml錐形管中，37℃放置30min記錄剩余液體量。使用AGI-10采樣器，內裝10ml不同配方的采樣液，在室溫下使用打氣機在7L/min恒定流速下打氣30min。使用大容量采樣器采樣，同時使用10mlSamplution、PBS和LB肉湯，觀察剩余液體量。
靜態下Samplution為無色、無味、透明均一的液體，pH值約為7.4-7.6，密度在1.1-1.2之間(表4)。靜態下Samplution在35℃，30min中內基本沒有蒸發作用，但在動態下即20℃，30min和35℃，30min時有較大程度的蒸發作用，與無菌水相比基本沒有差別(表5)。但在使用大容量采樣器時，Samplution抗蒸發效果就顯示出來了，它比PBS和肉湯蒸發作用減少了10％。冬用型Samplution在-20℃時全部未結冰，但在-25℃時有微量結冰現象。
表4 Samplution的密度和pH值采樣液 PX1 PX2 PD1PD2TX1TX2TD1TD2密度 1.151.151.21 1.21 1.14 1.16 1.21 1.21pH 7.357.277.23 7.27 7.74 7.67 7.67 7.64
表5 Samplution動態下蒸發量(30min后)采樣液 PX1PX2PD1PD2TX1TX2TD1TD220℃ 1.71.71.41.82.01.72.01.335℃ 1.91.91.82.01.82.02.02.0在經過綜合考慮后，我們淘汰了其中四種采樣液，剩下的4種為PD1(A1B3C3D1E3，即0.01mol/L PBS、2％肌醇、2％海藻糖、0.1mol/L甜菜堿和30％甘油)，PX2(A1B3C3D1E1，即0.01mol/L PBS、2％肌醇、2％海藻糖、0.1mol/L甜菜堿和10％甘油)，TD1(A1B3C3D2E3，即0.01mol/L Tris-HCl、2％肌醇、2％海藻糖、0.2mol/L甜菜堿和30％甘油)，和TX2(A1B3C3D2E1，即0.01mol/L Tris-HCl、2％肌醇、2％海藻糖、0.2mol/L甜菜堿和10％甘油)。
實驗例3實際應用初步應用的測試在500L氣霧室中進行，測試菌株使用大腸桿菌。使用TK-2型氣溶膠發生器發生大腸桿菌氣溶膠，發生5min后利用AGI-10采樣器以7L/min恒定流速采樣(此時氣溶膠發生器繼續發生氣溶膠)，內裝10mlSamplution，采樣時間為5min。然后從每個采樣器中取1ml涂布兩個營養瓊脂平板，37℃倒置培養12小時后計菌落數，實驗對照組為10ml無菌PBS。觀察Samplution對細菌回收率。采樣器中剩余液體取一定量進行核酸擴增實驗，觀察采樣液對核酸分析的影響。
4種采樣液在動態條件下對待測微生物具體保護效果(以提高百分比計，括號中的兩個數值，前者為Samplution采樣液中細菌菌落數，后者為對照組菌落數)為PD1(153/47226％)；PX2(111/17553％)；TD1(120/48150％)；TX2(419/114268％)。采樣液對隨后的核酸檢測有輕微影響，但可以通過氯仿抽提或快速核酸抽提技術消除。甚至在對照樣品中微生物回收率為0的情況下，Samplution中仍能夠有效回收到較低濃度的微生物。
Samplution對核酸分析的影響。當待測樣品占擴增體系的10％時，基本不會影響以后的核酸擴增；當待測樣品占擴增體系40％或以上時，會明顯影響甚至抑制核酸擴增；兩種緩沖體系中，PBS系統比Tris系統的影響因素更大。鑒于核酸擴增所需樣品量較少，所以采樣液對核酸擴增的影響基本可以忽略。使用酚氯仿抽提或使用快速核酸抽提技術則可以消除以上所有的抑制因素實施例10.05mol/L PBS 200ml、肌醇20g、海藻糖20g、甜菜堿1.17g和甘油300ml，全部組合物溶解混勻后定容至1L；置于高壓蒸汽滅菌器中110℃ 15min即得采樣液。
實施例20.05mol/L PBS 200ml、肌醇20g、海藻糖20g、甜菜堿1.17g和甘油100ml，全部組合物溶解混勻后定容至1L；置于高壓蒸汽滅菌器中110℃ 15min即得采樣液。
實施例31.0mol/L Tris-HCl 10ml、肌醇20g、海藻糖20g、甜菜堿2.34g和甘油300ml，全部組合物溶解混勻后定容至1L；置于高壓蒸汽滅菌器中110℃15min即得采樣液。
實施例41.0mol/L Tris-HCl 10ml、肌醇20g、海藻糖20g、甜菜堿2.34g和甘油100ml，全部組合物溶解混勻后定容至1L；置于高壓蒸汽滅菌器中110℃15min即得采樣液。
權利要求
1.一種空氣微生物采樣液，其特征在于該采樣液中含有如下組合物0.05mol/L PBS 150-300體積份、肌醇10-30重量份、海藻糖10-30重量份、甜菜堿0.5-5重量份、甘油100-350體積份，300-800體積份H2O。
2.如權利要求1所述的空氣微生物采樣液，其特征在于該采樣液中PBS可以用5-15體積份1mol/L Tris-HCl替代。
3.如權利要求1所述的空氣微生物采樣液，其特征在于該采樣液中含有如下組合物0.05mol/L PBS 200體積份、肌醇20重量份、海藻糖20重量份、甜菜堿1.17重量份和甘油300體積份，500體積份H2O。
4.如權利要求1所述的空氣微生物采樣液，其特征在于該采樣液中含有如下組合物0.05mol/L PBS 200體積份、肌醇20重量份、海藻糖20重量份、甜菜堿1.17重量份和甘油100體積份，700體積份H2O。
5.如權利要求2所述的空氣微生物采樣液，其特征在于該采樣液中含有如下組合物Tris堿1.21重量份、肌醇20重量份、海藻糖20重量份、甜菜堿2.34重量份和甘油300體積份，700體積份H2O。
6.如權利要求2所述的空氣微生物采樣液，其特征在于該采樣液中含有如下組合物Tris堿1.21重量份、肌醇20重量份、海藻糖20重量份、甜菜堿2.34重量份和甘油100體積份，900體積份H2O。
全文摘要
本發明公開了一種空氣微生物采樣液，該采樣液中含有如下組合物0.05mol/L PBS 150－300體積份(或1.0mol/L Tris－HCl 5－15體積份)、肌醇10－30重量份、海藻糖10－30重量份、甜菜堿1.0－1.5重量份、甘油100－350體積份，H
文檔編號C12Q1/24GK1519327SQ0310067
公開日2004年8月11日 申請日期2003年1月21日 優先權日2003年1月21日
發明者翟俊輝, 陳梅玲, 徐秀芝, 孫振海, 車鳳翔 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所, 中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物