專利名稱：血吸蟲病快速試紙條診斷試劑盒及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
血吸蟲病快速試紙條診斷試劑盒及其制備方法和應用，采用工業染料代替酶作標記物的所謂染料標記法，用于血吸蟲病快速試紙條診斷，屬于寄生蟲病免疫診斷技術領域。
背景技術：
目前，與本發明相近的血吸蟲病試紙條診斷方法有如下兩種1.膠體金標記法將四氯金酸通過還原(主要有白磷還原、硼氫化鈉還原和鞣酸-枸櫞酸三鈉還原等)的方法配制成直徑約為5-10nm膠體金顆粒溶液，它是一種紅色溶液，由于膠體金表面帶有負電荷而蛋白質帶有正電荷，兩者由于靜電相吸而牢固結合，因此膠體金可作為蛋白質的標記物。其缺點是(1)膠體金價格較貴，特別是成品膠體金價格尤其昂貴，常為進口產品，自制膠體金雖可降低成本，但很難獲取較為滿意的膠體金顆粒；(2)膠體金標記過程較為煩瑣，條件不易掌握，而且需純化后方可使用；(3)膠體金標記物需保存于4℃，不利于運輸攜帶。
2.酶標記法辣根過氧化物酶通過戊二醛膠聯或過碘酸鈉氧化方法與抗體蛋白結合。其缺點是(1)酶的價格較貴；(2)標記方法較為麻煩，需純化后方可使用；(3)酶容易失活，需保存于4℃，不利于運輸攜帶；(4)檢測時花費時間較長，一般在2小時左右，不適于現場大規模普查使用。

發明內容
本發明的目的是提供一種血吸蟲病快速試紙條診斷試劑盒及其制備方法和應用，開發一種新穎、簡便的血吸蟲病免疫診斷技術。
技術方案血吸蟲病快速試紙條診斷試劑盒由試紙條(1)、染料標記抗原液(2)、標板小杯(3)、標板托架(4)和盒體(5)所組成，試紙條密封于有蓋塑料瓶內，試紙條用PVC襯墊，中間貼硝酸纖維層析膜，上端貼吸水墊，底端貼樣品墊，吸水墊和樣品墊必須與層析膜有交疊0.1cm，在距底端1cm處的層析膜上用羊抗人IgG劃上檢測線，在距底端2cm處的層析膜上用兔抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)IgG劃上對照線，染料標記抗原液密封于塑料管內，染料標記抗原液由日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)、染料貯存液和磷酸鹽緩沖液(PBS)以及疊氮鈉PBS和牛血清白蛋白(BSA)封閉液配制而成，染料采用2BLN分散蘭染料，測試時標板小杯置于標板托架內，裝有試紙條(1)的塑料瓶和裝有染料標記抗原液(2)的塑料管和裝有標板小杯(3)的標板托架(4)均安放在盒體(5)內。
上述試劑盒的制備方法為一、材料染料2BLN分散蘭染料，為一種工業用國產染料，分子式C14H9N2O4Br，分子量349。
硝酸纖維(NC)層析膜美國Millipore公司生產，規格Hi-Flow，滲透試驗為120±35秒。
吸水墊美國Millipore公司生產，規格AP22。
樣品墊美國Millipore公司生產，規格AP22。
PVC襯墊。
標板小杯直徑0.6cm，高1cm聚氯乙烯塑料制品。
磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O MW＝358.14)。
磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O MW＝156.01)。
氯化鈉(NaCl MW＝58.44)。
疊氮鈉(NaN3MW＝65.02)。
海藻糖(C12H22O11·2H2O MW＝378.33)。
牛血清白蛋白(BSA)。
磷酸鹽緩沖液(PBS)。
日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)。
羊抗人IgG。
兔抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)IgG。
二、設備高速離心機(20000×g)分光光度計搖擺式搖床溫箱三、試劑配制1.0.01M PBS(pH7.4)Na2HPO4·12H2O 2.9gNaH2PO4·2H2O 0.3gNaCl 8.0g加蒸餾水至1000ml2.封閉液BSA 1.0g加0.01M PBS(pH7.4)至100ml3.1％(W/V)疊氮鈉PBS疊氮鈉 1.0g加0.01M PBS(pH7.4)至100ml4.SEA的制備以日本血吸蟲尾蚴感染家兔，45天后取兔肝分離蟲卵，加生理鹽水置冰浴上研磨1h，離心14000rpm，1h，收集上清液即為SEA。
5.羊抗人IgG親和層析產品(購自上海華美公司)，使用時用PBS稀釋至1mg/ml，加海藻糖，使海藻糖終濃度為0.15M，簡寫為含0.15M海藻糖。
6.兔抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)IgG的制備用標準體外免疫法免疫家兔，以SEA作抗原，每次2mg，加福氏完全佐劑，采用皮內多點注射法免疫，共免疫3次，當免疫兔血清滴度達到1∶10240以上時采集兔血，分離血清，再以Protein A親和層析法純化收集IgG，使用時用PBS稀釋至1mg/ml，含0.15M海藻糖。
四、方法1.染料貯存液制備染料 0.5g蒸餾水10ml充分混懸后離心15000×g，30min，棄上清液，沉淀加蒸餾水10ml，充分混懸后離心15000×g，30min，重復4次(共洗5次)，完畢后，棄上清液，沉淀加蒸餾水10ml，充分混懸后離心250×g，30min，取上清液作為染料貯存液。
測定染料貯存液的A值取少量染料貯存液用蒸餾水稀釋100倍，將分光光度計波長調至630nm，以蒸餾水調零，讀取吸光(OD)值，A＝OD630nm值×100。
在染料貯存液中加入1％疊氮鈉PBS，使疊氮鈉終濃度為0.05％，保存于室溫下備用。
2.染料標記抗原液制備SEA 1mg染料貯存液xml(x＝60/染料貯存液A值)PBS(0.01M pH7.4)加至5ml將上述材料置10ml離心管中，放入37℃溫箱中來回搖2h取出，加封閉液5ml，繼續于37℃溫箱中來回搖4h，取出離心15000×g，30min，4℃，棄上清液，沉淀加10ml封閉液，混勻后離心15000×g，30min，4℃，棄上清液，沉淀加封閉液5ml，用吸管輕輕將沉淀吹打均勻，須打至無肉眼可見的粗顆粒，加1％疊氮鈉PBS，使疊氮鈉終濃度為0.05％，此為染料標記貯存液，使用時用封閉液稀釋8倍，補充加1％疊氮納PBS，使疊氮納終濃度為0.05％，(簡寫為含0.05％疊氮納)，即為染料標記抗原液，貯存液和抗原液均可在室溫保存。
3.試紙條制備將PVC襯墊裁成5cm長，在中間貼上2.5cm硝酸纖維層析膜，在上端貼上2.25cm長的吸水墊，在底端貼上0.5cm長的樣品墊，吸水墊和樣品墊必須與硝酸纖維層析膜的兩端交疊0.1cm。在距底端1cm處的層析膜上用羊抗人IgG(用PBS稀釋至1mg/ml，含0.15M海藻糖)劃上0.05cm寬的檢測線，在距底端2cm處的層析膜上用兔抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)IgG(用PBS稀釋至1mg/ml，含0.15M海藻糖)劃上0.05cm寬的對照線，置37℃2小時，將加工好的膜切成0.3cm寬的條即為試紙條。
上述試劑盒的檢測應用取標板小杯，加50μl染料標記抗原液和10μl待檢血清，充分混勻1min，然后插入試紙條，將樣品墊一端插入杯底，5-10min后觀察結果。結果判斷檢測線與對照線都出現紫蘭色為陽性反應，對照線出現紫蘭色而檢測線無紫蘭色為陰性反應。
注意事項1.檢測血清必須新鮮，否則會影響檢測結果。
2.取試紙條時，用手捏住吸水墊(較長的一端)，嚴禁觸摸檢測膜。
3.試紙條一定要插入杯底。
4.該試紙條與肺吸蟲病人和肝吸蟲病人有部分交叉反應，檢測時注意。
有益效果1.標記用2BLN染料是一種工業用國產染料，用于免疫診斷為首創，而且價格非常便宜。
2.標記方法簡便。
3.標記好的試紙條及抗原液質量穩定，可在室溫中運輸，而且在室溫中能保存1年以上。該項技術也為專有。
4.測試方法簡便，無需任何儀器設備。一般人員按照說明即可操作，勿需專門培訓。
5.測試方法快速，整個過程僅需10分鐘左右即可完成檢測。


圖1試劑盒組成圖。1、試紙條；2、標記染料抗原液；3、標板小杯；4、標板托架；5、盒體。
圖2為試紙條測試效果圖A陽性反應檢測帶和對照帶都出現紫蘭色帶；B陰性反應對照帶出現紫蘭色帶而檢測帶無紫蘭色帶。
圖3制備方法和應用的流程框圖。
具體實施方法實施例1按說明書中記述的方法，配制的試劑盒的組成包括48條試紙條，3ml染料標記抗原液，48個PVC標板小杯。
實施例2用血吸蟲病快速試紙條診斷試劑盒檢測急性血吸蟲病人血清30例、慢性血吸蟲病人血清84例，其敏感性分別為96.7％和94.0％，檢測健康人血清60例，其特異性為96.7％。Joden’s指數分別為0.967+0.967-1＝0.934；0.94+0.967-1＝0.907。表明該法的敏感性高，特異性好。為一種高效的血吸蟲病免疫診斷試劑盒。
——摘自《中國血吸蟲病防治雜志》2000年第12卷第1期第18頁至30頁實施例3現場應用2001年用血吸蟲病快速試紙條診斷試劑盒檢測江西省波陽縣糞檢陽性的血吸蟲病人血清121例，陽性率為96.69％(117/121)，30例健康人均為陰性，特異性為100％，Joden’s指數可達0.967+1.000-1＝0.967。表明該法的敏感性高，特異性好，適用于現場查病。
——摘自《中國寄生蟲病防治雜志》2001年第14卷第1期第28頁至30頁實施例4現場應用2001年采用血吸蟲病快速試紙條診斷試劑盒檢測江西省德興市(血吸蟲病已消滅15年)20000例人群血清，陰性符合率達99.3％(特異性)，而對照的30例糞檢陽性血清陽性符合率為93.3％(28/30)，30例非流行區健康人中有1例為陽性，特異性為96.7％(1/30)。表明該法的敏感性高，特異性好。
——摘自《中國血吸蟲病防治雜志》2001年第13卷第5期第304頁實施例5現場應用2002年在江蘇省南京市郊區(血吸蟲病低度流行區)應用血吸蟲病快速試紙條診斷試劑盒進行血吸蟲病消滅達標考核，共查2788人，陽性率僅為0.29％。與當地流行狀況相符，而且費用較其他免疫診斷方法節省23.76％。故該法也適用于血吸蟲病達標考核。
——摘自《中國血吸蟲病防治雜志》2002年第14卷第5期第374頁至375頁實施例6現場應用2002年在江蘇省鎮江市丹徒縣(血吸蟲病低度流行區)用血吸蟲病快速試紙條診斷試劑盒對463人(自然人群)的篩查中，18例糞檢陽性的血吸蟲病人，檢出17例陽性，陽性符合率為94.4％。而環卵沉淀法(COPT)的陽性符合率則為72.2％。表明該法適用于血吸蟲病低度流行區篩查，較其他免疫診斷方法更為適用。
——摘自《中國血吸蟲病防治雜志》2003年第15卷第1期實施例7現場應用2002年在江蘇省南京市郊區(血吸蟲病低度流行區)用血吸蟲病快速試紙條診斷試劑盒對465例自然人群篩查中，13例糞檢陽性的血吸蟲病人，結果全為陽性，陽性符合率為100％。表明該法適用于血吸蟲病低度流行區篩查確定化療對象。
——文章待發表
權利要求
1.一種血吸蟲病快速試紙條診斷試劑盒，其特征是由試紙條(1)、染料標記抗原液(2)、標板小杯(3)、標板托架(4)和盒體(5)所組成，試紙條密封于有蓋塑料瓶內，試紙條用PVC襯墊，中間貼硝酸纖維層析膜，上端貼吸水墊，底端貼樣品墊，吸水墊和樣品墊必須與層析膜有交疊0.1cm，在距底端1cm處的層析膜上用羊抗人LgG劃上檢測線，在距底端2cm處的層析膜上用兔抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)LgG劃上對照線，染料標記抗原液密封于塑料管內，染料標記抗原液由日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)、染料貯存液和磷酸鹽緩沖液(PBS)以及疊氮鈉PBS和牛血清白蛋白(BSA)封閉液配制而成，染料采用2BLN分散蘭染料，測試時標板小杯置于標板托架內，裝有試紙條(1)的塑料瓶和裝有染料標記抗原液(2)的塑料管和裝有標板小杯(3)的標板托架(4)均安放在盒體(5)內。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征是試劑盒的組成包括48條試紙條，3ml染料標記抗原液，48個PVC標板小杯。
3.一種制造權利要求1的試劑盒的方法，其特征是配制染料標記抗原液(1)配制染料貯存液取0.5g 2BLN分散蘭染料，加蒸餾水10ml洗滌，充分混懸后離心15000×g，30min，棄上清液，重復洗滌4次，共洗5次，洗畢，棄上清液，沉淀加蒸餾水10ml，充分混懸后離心250×g，30min，取上清液作為染料貯存液；在染料貯存液中加1％疊氮鈉PBS，使疊氮鈉終濃度為0.05％，保存于室溫下備用；測定染料貯存液的A值取少量染料貯存液用蒸餾水稀釋100倍，將分光光度計波長調至630nm，以蒸餾水調零，讀取吸光(OD)值，A＝OD630nm值×100；(2)配制染料標記抗原液取抗原SEA 1mg，染料貯存液xml(x＝60/染料貯存液A值)，加PBS(0.01M pH7.4)至5ml，將上述材料置10ml離心管中，放入37℃溫箱中來回搖2h取出，加封閉液5ml，繼續于37℃溫箱中來回搖4h，取出離心15000×g，30min，4℃，棄上清液，沉淀加10ml封閉液，混勻后離心15000×g，30min，4℃，棄上清液，沉淀加封閉液5ml，用吸管輕輕將沉淀吹打均勻，須打至無肉眼可見的粗顆粒，加1％疊氮鈉PBS，使疊氮鈉終濃度為0.05％，此為染料標記貯存液，使用時用封閉液稀釋8倍(含0.05％疊氮鈉)，即為染料標記抗原液，貯存液和抗原液均可在室溫保存；試紙條制備將PVC襯墊裁成5cm長，在中間貼上2.5cm硝酸纖維層析膜，在上端貼上2.25cm長的吸水墊，在底端貼上0.5cm長的樣品墊，吸水墊和樣品墊必須與硝酸纖維層析膜的兩端交疊0.1cm，在距底端1cm處的層析膜上用羊抗人IgG(用PBS稀釋至1mg/ml，含0.15M海藻糖)劃上0.05cm寬的檢測線，在距底端2cm處的層析膜上用兔抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)IgG(用PBS稀釋至1mg/ml，含0.15M海藻糖)劃上0.05cm寬的對照線，置37℃2小時，將加工好的膜切成0.3cm寬的條即為試紙條。
4.根據權利要求2所述的試劑盒的制備方法，其特征是封閉液的配制取牛血清白蛋白(BSA)1g，加0.01M PBS(pH7.4)至100ml。
5.根據權利要求2所述的試劑盒的制備方法，其特征是1％疊氮鈉PBS的配制取疊氮鈉1g，加0.01M PBS(pH7.4)至100ml。
6.根據權利要求2所述的試劑盒的制備方法，其特征是日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)的制備以日本血吸蟲尾蚴感染家兔，45天后取兔肝分離蟲卵，加生理鹽水置冰浴上研磨1h，離心14000rpm，1h，收集上清液即為SEA。
7.根據權利要求2所述的試劑盒的制備方法，其特征是羊抗人1gG，使用時用PBS稀釋至1mg/ml，含0.15M海藻糖。
8.根據權利要求2所述的試劑盒的制備方法，其特征是兔抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)1gG的制備用標準體外免疫法免疫家兔，以SEA作抗原，每次2mg，加福氏完全佐劑，采用皮內多點注射法免疫，共免疫3次，當免疫兔血清滴度達到1∶10240以上時采集兔血，分離血清，再以Protein A親和層析法純化收集IgG，使用時用PBS稀釋至1mg/ml，含0.15M海藻糖。
9.根據權利要求1所述的試劑盒的檢測應用，其特征是取標板小杯，加50μl染料標記抗原液和10μl待檢血清，充分混勻1min，然后插入試紙條，將樣品墊一端插入杯底，5-10min后觀察結果，結果判斷檢測線與對照線都出現紫蘭色為陽性反應，對照線出現紫蘭色而檢測線無紫蘭色為陰性反應。
全文摘要
血吸蟲病快速試紙條診斷試劑盒及其制備方法和應用，屬于寄生蟲病免疫診斷技術領域。本發明配制的試劑盒采用染料標記法，以2BLN分散蘭染料和日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)以及1％疊氮鈉PBS和牛血清白蛋白(BSA)封閉液配制成染料標記抗原液，以硝酸纖維作層析膜，在層析膜上分別用羊抗人1gG劃上檢測線和用兔抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)1gG劃上對照線制作試紙條，將待檢血清和染料標記抗原液充分混勻后，以試紙條進行測試。標記用2BLN國產染料，用于免疫診斷為首創，標記方法簡便，標記好的試紙條和抗原液質量穩定，室溫下有效期為1年以上，檢測方法簡便，一般人員按說明書即可操作。
文檔編號G01N33/532GK1425918SQ0311269
公開日2003年6月25日 申請日期2003年1月14日 優先權日2003年1月14日
發明者朱蔭昌, 何偉 申請人:江蘇省血吸蟲病防治研究所