專利名稱：一種提高輪枝鏈霉菌產轉谷氨酰胺酶活力的方法
技術領域：
一種提高輪枝鏈霉菌產轉谷氨酰胺酶活力的方法，屬于酶工程技術領域。
背景技術：
轉谷氨酰胺酶，又稱谷氨酰胺轉胺酶(Transglutaminase，EC2.3.2.13，簡稱TGase)，是一種催化酰基轉移反應的轉移酶。它能催化酪蛋白、乳球蛋白、肌球蛋白、面筋蛋白等蛋白質發生分子內和分子間的交聯反應，從而改變蛋白質的功能性質，因此在食品工業中有良好的應用前景，但動物和植物組織來源的轉谷氨酰胺酶成本較高，阻礙了它在食品工業中的進一步推廣。
1989年日本味之素公司和天野制藥公司合作從5000多株放線菌中篩選出產轉谷氨酰胺酶活力較高的輪枝鏈霉菌(Streptoverticillium)，開創了微生物轉谷氨酰胺酶的發酵法生產。隨后許多學者致力于微生物轉谷氨酰胺酶的發酵生產研究1996年Zhu等運用黑箱模型設計優化了輪枝鏈霉菌的產酶培養基；1997年Junqua等運用試驗設計方法優化了培養基；1996年吳介文提出添加蛋氨酸或甘氨酸有利于轉谷氨酰胺酶的產生；1998年Zhu等運用質量平衡理論分析了輪枝鏈霉菌發酵過程中氨基酸的代謝情況，提出流加硫酸銨促進產酶的方法；2001年常中義等提出人造沸石可解除銨離子的阻遏作用，從而提高產酶；2002年鄭美英等研究了pH控制在微生物轉谷氨酰胺酶發酵生產中的應用。
在對輪枝鏈霉菌SK4.001(江南大學食品科學研究室保存)產轉谷氨酰胺酶的研究中，發現存在產酶不穩定的問題。在分別研究了菌種(包括菌種的傳接代數、保存方式、接種量等)、氮源、水質等對SK4.001發酵生產轉谷氨酰胺酶穩定性的影響后發現培養基中金屬離子的含量是影響產酶穩定性的主要因素。研究金屬離子在轉谷氨酰胺酶生產中的作用在國內外尚屬首次，本發明重點研究了Zn2+對菌株SK4.001生長及產轉谷氨酰胺酶的影響，并運用螯合劑EDTA對酶液進行透析的方法初步研究了Zn2+的作用機理。

發明內容
本發明的目的是提供一種提高輪枝鏈霉菌產轉谷氨酰胺酶活力的方法，首次提出在液體培養基中添加一定濃度Zn2+離子，可提高菌體生長量和提高酶活力。
本發明的技術方案以輪枝鏈霉菌(Streptoverticillium)為生產菌種，如以輪枝鏈霉菌SK4.001為生產菌種，在液體培養基中添加Zn2+離子，添加量為3ug/mL-50ug/mL。
當培養基中Zn2+添加量由Oug/mL增加到3ug/mL，菌體生長量由10.23mg/mL增為16.99mg/mL。Zn2+含量繼續增加，菌體生長量改變不明顯。當液體培養基中Zn2+添加量由3ug/mL增加到8ug/mL時，轉谷氨酰胺酶酶活迅速提高，由2.289U/mL提高至4.723U/mL，提高了2.06倍。
1.菌種輪枝鏈霉菌SK4.001(江南大學食品科學研究室保存)2.培養基組成斜面培養基高氏一號培養基液體培養基(g/L)甘油16-25蛋白胨15-30酵母浸膏1.6-2.5硫酸鎂1.6-2.5磷酸氫二鉀1.6-2.53.培養方法以上各培養基均于121℃滅菌20min后使用，取一環新鮮斜面菌種，接入裝有25mL液體培養基的250mL三角瓶中，在30℃、210rpm的條件下培養24h。以4％的接種量接入裝有25mL液體培養基的250mL三角瓶中。在30℃、210rpm的條件下連續培養36-72h。
4.液體培養基中Zn2+的添加利用原子吸收分光光度法測得起始液體培養基中Zn2+的含量在0.15ug/mL左右，分別加入不同量的ZnSO4，使Zn2+添加量為3ug/mL-50ug/mL，則液體培養基中Zn2+的含量達到3.15ug/mL-50.15ug/mL。
5.乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)透析室溫下，25mL酶液在含10mmol/LEDTA、pH7.0的0.05mol/L三(羥甲基)氨基甲烷-HCL(Tris-HCL)緩沖液中透析2h，再在含1mmol/LEDTA的pH7.0、0.05mol/LTris-HCL緩沖液中于4℃透析過夜，然后在不含EDTA的pH7.0、0.05mol/LTris-HCL緩沖液中反復透析，脫去多余的EDTA和EDTA的螯合物。
分析方法
1.菌體量的測定取5mL發酵液，離心，將沉淀部分加入30倍水和6mL 1M鹽酸，激烈攪拌后，加4mL 1M氫氧化鈉，離心(2500rpm，10min)，用水洗沉淀，用已恒重的濾紙過濾。置于100℃烘箱中加熱至恒重。在干燥器中降至室溫后稱重，減去濾紙重量即為菌體干重。以mg/mL計。
2.轉谷氨酰胺酶酶活測定比色法測定以CBZ-Gln-Gly為作用底物，以L-谷氨酸-γ-單羥氨酸作標準曲線.
酶活的定義37℃、1min生成1umol L-谷氨酸-γ-單羥氨酸的量定義為一個酶活單位。
3.殘余甘油測定改進的多元醇比色法Zn2+對輪枝鏈霉菌SK4.001培養的影響1.對輪枝鏈霉菌SK4.001菌體生長的影響表1.Zn2+添加量對細胞生長量的關系

由上表可以看出Zn2+的添加量由0ug/mL增加到1ug/mL時，最大生物量增加很快，從10.23mg/mL增加到15.60mg/mL，超過50％。當Zn2+添加量加到3ug/mL時，最大生物量略有增長，達到16.99mg/mL。再進一步增加Zn2+濃度，最大生物量的改變并不明顯。
2.對甘油消耗量的影響Zn2+缺乏時，甘油的利用并不十分完全。發酵60h后，殘余甘油的含量為2.56mg/mL。在起始液體培養基中加入Zn2+后，甘油的代謝利用率明顯增加，Zn2+添加量為1ug/mL時，發酵36h后殘余甘油的含量為0.076mg/mL。之后殘余甘油含量相對穩定，維持在0.078mg/mL左右。Zn2+添加量為3、6、8、9ug/mL時的甘油代謝沒有明顯的區別，殘余甘油含量均在32h左右達到最低，最低殘余甘油含量維持在0.045mg/mL左右。
3.對pH的影響
Zn2+缺乏時，pH呈下降趨勢，改變幅度不大。含有Zn2+時，發酵液的pH變化規律表現為先下降后上升的趨勢，不同Zn2+含量間的區別并不明顯。
4.對輪枝鏈霉菌SK4.001產轉谷氨酰胺酶的影響表2.Zn2+添加量對轉谷氨酰胺酶酶活的影響

當Zn2+缺乏時，輪枝鏈霉菌SK4.001對甘油的利用不完全，pH變化異常，SK4.001的代謝是病態的，不產轉谷氨酰胺酶。Zn2+添加量為1ug/mL時，SK4.001代謝正常，但酶活很低，隨著Zn2+含量的增加，酶活也隨之增加。當Zn2+添加量達到8ug/mL時，酶活達到最高。進一步增加Zn2+含量，酶活的改變并不很明顯。
5.螯合劑EDTA透析對轉谷氨酰胺酶酶活的影響表3.EDTA透析對轉谷氨酰胺酶酶活的影響

結果表明EDTA對酶活并無明顯負面影響，酶活的稍許下降與發酵液的不同保存環境及檢測時的誤差有關。
綜上結果，欲保證SK4.001的正常生長，并獲得較高的生物量，發酵培養基中Zn2+的含量不應低于3ug/mL。進一步增加Zn2+的含量可提高轉谷氨酰胺酶的酶活。8ug/mL的添加量可獲得最高的酶活，達到4.723U/mL。
Zn2+在SK4.001發酵生產轉谷氨酰胺酶中的作用可分為二其一，作為一種營養成分滿足SK4.001菌體生長的需要；其二，具有促進SK4.001產轉谷氨酰氨酶的作用。
金屬離子常在酶蛋白中起到穩定結構和作為活性中心的作用，或兼而有之。Zn2+在生物大分子中與肽鏈作用形成穩定的共價化合物十分常見。但發酵液的EDTA透析表明，轉谷氨酰胺酶的酶活并沒有受到EDTA的明顯影響，即Zn2+并不是轉谷氨酰胺酶的構成部分或活性中心。
Zn2+能抑制轉谷氨酰氨酶的活性，酶液中含有1mmol/L的Zn2+時，85％的酶活被抑制。故而推測發酵培養中酶活的增加是因為酶產量的增加，而非Zn2+對酶活性的調控。
本發明的有益效果Zn2+在輪枝鏈霉菌SK4.001生產轉谷氨酰氨酶的液體培養基中含量為3.15ug/mL時，即可獲得較高菌體量，為16.9.9mg/mL。進一步提高Zn2+的含量，相對于Zn2+含量為3.15ug/mL時而言，菌體量增加不明顯，但轉谷氨酰氨酶的酶活迅速提高。發酵培養基中Zn2+的添加量為8ug/mL時，轉谷氨酰氨酶的酶活可達到4.723U/mL，是Zn2+添加量為3ug/mL時的2.06倍。其它金屬離子的拮抗作用對Zn2+的吸收及產酶的促進作用沒有負面影響，可以確定Zn2+不是轉谷氨酰胺酶的組成部分或活性中心，其對SK4.001產微生物轉谷氨酰胺酶的促進機理有待進一步研究。
具體實施例方式
實施例1輪枝鏈霉菌(Streptoverticillium)SK4.001為生產菌種，液體培養基組成為上述組成，添加ZnSO4于液體培養基中，使其中Zn2+添加量為3ug/mL，培養基于121℃滅菌20min后使用，取一環新鮮斜面菌種，接入裝有25mL液體培養基的250mL三角瓶中，在30℃、210rpm的條件下培養24h。以4％的接種量接入25mL液體培養基中，在30℃、210rpm的條件下連續培養60h，得最大細胞干重16.99mg/mL，轉谷氨酰胺酶酶活為2.289U/mL。
實施例2添加ZnSO4于液體培養基中，使其中Zn2+添加量為8ug/mL，其余操作同實施例1，得最大細胞干重17.11mg/mL，轉谷氨酰胺酶酶活為4.723U/mL。
權利要求
1.一種提高輪枝鏈霉菌(Streptoverticillim)產轉谷氨酰胺酶活力的方法，其特征是以輪枝鏈霉菌(Straptoverticillim)為生產菌種，在液體培養基中添加Zn2+離子，添加量為3ug/mL-50ug/mL，Zn2+添加量為3ug/mL，菌體生長量為16.99mg/mL，Zn2+添加量大于3ug/mL時，菌體生長量改變不明顯，當液體培養基中Zn2+添加量由3ug/mL增加到8ug/mL時，轉谷氨酰胺酶酶活迅速提高，由2.289U/mL提高至4.723U/mL，提高了2.06倍。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征是輪枝鏈霉菌為SK4.001，江南大學食品科學研究室保存。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征是所述培養基組成為斜面培養基高氏一號培養基，液體培養基(g/L)甘油16-25，蛋白胨15-30，酵母浸膏1.6-2.5，硫酸鎂1.6-2.5，磷酸氫二鉀1.6-2.5。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征是培養方法為各培養基均于121℃滅菌20min后使用，取一環新鮮斜面菌種，接入裝有25mL液體培養基的250mL三角瓶中，在30℃、210rpm的條件下培養24h，以4％的接種量接入裝有25mL液體培養基的250mL三角瓶中.在30℃、210rpm的條件下連續培養36-72h。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征是所述液體培養基中添加Zn2+離子，分別加入不同量的ZnSO4使液體培養基中Zn2+的添加量達到3ug/mL-50ug/mL。
全文摘要
一種提高輪枝鏈霉菌產轉谷氨酰胺酶活力的方法，屬于酶工程技術領域。以輪枝鏈霉菌(Streptoverticillium)為生產菌種，如以輪枝鏈霉菌SK4.001為生產菌種，在培養基中加入不同添加量的Zn
文檔編號C12N9/78GK1492044SQ0315291
公開日2004年4月28日 申請日期2003年9月2日 優先權日2003年9月2日
發明者江波, 王璋, 曾新, 江 波 申請人:江南大學