專利名稱：通過導入notch基因將骨髓基質細胞誘導分化為神經細胞或骨骼肌細胞的方法
技術領域：
本發明涉及一種通過導入Notch基因將骨髓基質細胞誘導分化為神經前體細胞(neural precursor cells)或神經細胞，特別是多巴胺能神經元，或骨骼肌細胞的方法，還涉及用該方法所獲得的神經前體細胞、神經細胞或骨骼肌細胞和所述細胞的治療用途以及治療方法。
背景技術：
在晚期神經退化性病癥如阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、ALS(肌萎縮性側索硬化癥)等病中重建神經功能需要取代由細胞死亡所致的神經細胞喪失。雖然已經使用胚胎或成體神經干細胞、ES細胞和胚胎神經細胞在動物實驗中嘗試進行神經細胞移植，然而將其應用于人類仍面臨很大的障礙。使用胚胎干細胞或神經細胞涉及倫理問題，而能否保證穩定供應也是一個問題。近來，ES細胞的已得到證實的分化能力得到很多關注，然而除了很多倫理問題外，誘導分化為特定細胞類型所需的費用和勞動量以及移植后形成畸胎瘤的風險是妨礙該技術穩定應用的因素。為了使用成體神經干細胞，由于僅在中樞神經系統非常局限的核心區中發現所述細胞故必需通過開顱術才能提取所述細胞，因此接受再生治療的患者也會承受巨大的風險和負擔。
雖然中樞神經系統干細胞的體外分離至今已過去了近十年，但現在仍不能通過目前公認的方法分化神經干細胞及獲得大量多巴胺能或膽堿能神經元(Lorenz Studer，Nature Biotechnology Dec.Issue，p.117(2001))。
由卡爾加里大學(加拿大)的Samuel Weiss教授和Tetsuro Shingo領導的研究組已通過將幾種酪氨酸羥化酶誘導因子的混合物(THcocktail)施用于小鼠腦內而成功地有效誘導產多巴胺神經細胞的分化，然而如根據本發明的從骨髓基質細胞誘導分化多巴胺能神經元和膽堿能神經元目前仍無先例。
運動神經元是乙酰膽堿能的，且其被認為適于治療如ALS(肌萎縮性側索硬化癥)的難治性疾病。在ALS中，原因不明的脊髓運動神經元死亡導致了肌肉控制神經的喪失，從而妨礙包括呼吸肌在內全身肌肉的運動，并導致病人在發作后2-3年之內死亡。目前，尚無對這種病癥的有效治療方法，但正在建立大鼠ALS模型。
大多數退化性肌肉病如肌肉萎縮癥是進行性的，因此骨骼肌細胞移植可構成有效的治療。在健康的個體中，存在于肌肉組織中的衛星細胞補充喪失再生力的骨骼肌，但是在進行性肌肉疾病中，所述細胞數量減少且再生力相應較低。因此，雖然骨骼肌細胞或其前體細胞的移植可作為治療方法，但目前仍不存在有效的治療方法。
在中樞神經系統發育期間，從相對同質的神經前體細胞或神經干細胞誘導分化神經元和神經膠質細胞。存在這樣一種適當的機制，即通過此機制前體細胞群體中部分細胞響應分化信號而分化為特定的細胞亞型，而其它細胞保持未分化狀態。具體地，先分化細胞對其周圍細胞發送特定信號從而阻止細胞再分化為先分化細胞自身的類型。該機制已知為側抑制(lateral inhibition)。在果蠅中，已分化為神經元的細胞表達“Delta”配體，而其周圍細胞表達Delta受體“Notch”，配體和受體的結合確保周圍細胞不分化為神經細胞(Notch信號傳導)。Delta-Notch系統似乎也在脊髓細胞中起作用(參見例如Chitnis，A.，Henrique，D.，Lewis，J.，Ish-Horowicz，D.，Kintner，C.Nature，375，761-766(1995))。
一般認為借助膜蛋白Notch的細胞相互作用在發育過程中發揮主要作用，由此均一細胞群體產生多種不同的類型，特別是依靠通過鄰近細胞的配體刺激，Notch誘導了能夠抑制bHLH(堿性螺旋-環-螺旋)神經分化因子如Mash1、Math1和neurogenin的HES1或HES5的表達，從而抑制分化為與鄰近細胞相同類型(參見例如Kageyama等，Saibo Kogaku[Cell Engineering]Vol. 18，No.9，1301-1306(1999))。
目前對Notch細胞內通路存在如下認識。當Notch首先被鄰近細胞表面上的配體激活時(Delta，Serrate，Jagged)，其細胞內結構域被剪切掉(Artavanis-Tsakonas S等Science(1999)284770-776和Kageyama等，Saibo Kogaku[Cell Engineering]Vol.18，No.9，1301-1306(1999))。在剪切了Notch的細胞內結構域之后，其在核定位信號(NLS)輔助下從細胞膜移至核并在細胞核中與DNA-結合蛋白RBP-Jκ構成復合物(Honjo T.Genes Cells(1996)11-9和Kageyama等，Saibo Kogaku[Cell Engineering]Vol.18，No.9，1301-1306(1999))。RBP-Jκ本身是轉錄的DNA-結合抑制物，且在不存在活化的Notch時，其結合HES1基因(是分化抑制因子)的啟動子，由此阻斷其表達；然而，一經形成RBP-Jκ和Notch細胞內結構域間的復合物，該復合物即轉而發揮活化HES1基因的轉錄的作用(參見Jarriault S.等Nature(1995)377355-358，Kageyama R等Curr.Opin.Genet.Dev.(1997)7659-665和Kageyama等，SaiboKogaku[Cell Engineering]Vol.18，No.9，1301-1306(1999))。這導致HES1表達和HES1-誘導的分化抑制。換言之，已經確信Notch借助HES1而抑制分化(參見Kageyama等，Saibo Kogaku[CellEngineering]Vol.18，No.9，1301-1306(1999))。
同樣在哺乳動物中，已經很清楚Notch介導的基因表達的調節在保持神經前體細胞或神經干細胞中和在神經分化的高度多變的過程中是重要的，且Notch通路對神經系統外的細胞分化也是非常重要的(參見Tomita K等Genes Dev。(1999)131203-1210和Kageyama等，Saibo Kogaku[Cell Engineering]Vol.18，No.9，1301-1306(1999))。另外，已經預期了HES-非依賴性Notch通路的存在、Notch信號對轉錄水平的負調節和對蛋白水平的負相互作用(參見Goh，M.，SaiboKogaku[Cell Engineering]Vol.18，No.9，1291-1300(1999))。而且，前述所有公開內容教導或提示Notch信號傳導在抑制分化方面發揮作用。
不能通過重建來治療的中樞神經疾病實際上包括人群中多種不同的具有高發病率的疾病，從損傷誘導的脊髓損傷或腦血管損傷或能導致失明的青光眼，至神經退化癥如帕金森氏病。因此對治療所述疾病的神經再生方法的研究是非常緊迫的社會需要，而本發明人的研究結果確信是應用于人類的一個突破。在門診病人中通過骨髓穿刺可很容易地提取骨髓基質細胞，且由于其高增殖性，其可在相對短的時期內得以大量培養。而且，如果神經從自體骨髓干細胞構建，則可實施自體移植，故可以預期巨大的優勢。不產生免疫排斥將免除使用免疫抑制劑，故此能使治療更安全。
而且，由于骨髓干細胞可獲自骨髓庫，從供應角度來看，該方法實際上是可行的。如果所述細胞可用于生成神經細胞(迄今為止尚無有效方法)，則可以在再生醫學領域中期待主要效果。
ALS(肌萎縮性側索硬化癥)是一種不明原因脊髓運動神經元細胞死亡的疾病，其中細胞死亡導致肌肉控制神經的喪失，從而妨礙包括呼吸肌在內全身肌肉的運動，并導致病人在發作后2-3年之內死亡，然而目前尚無有效治療方法。從自體骨髓干細胞構建乙酰膽堿能神經元將可以進行自體移植，這將提供顯著的甚至可治療ALS的優勢。
目前尚無肌肉疾病如肌肉萎縮癥(骨骼肌的退行性疾病)的有效治療方法。由于骨骼肌細胞從自體骨髓干細胞構建將能允許實施自體移植，故也能對所述疾病提供顯著的優勢。使用所述細胞生成骨骼肌細胞(迄今為止尚無有效方法)，則可以在再生醫學領域中期待主要效果。
該技術不僅可用于臨床治療領域還可用于預期在未來會成為重要領域的人造器官等工程學領域。如果能在細胞培養水平容易地制備神經細胞或肌細胞，則可設想用于生成雜合人造器官等。
發明概述本發明提供了體外誘導骨髓基質細胞分化為神經細胞或骨骼肌細胞的方法，所述方法包括將Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因導入細胞中，其中最終得到的分化細胞是已導入Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因的骨髓基質細胞分裂的結果。本發明還提供了一種用于神經變性疾病和骨骼肌退行性疾病的新治療方法，該方法使用由前述方法獲得的神經前體細胞，神經細胞或骨骼肌細胞。
附圖
簡述圖.1是代替圖的顯微照片(相差顯微鏡)，顯示了根據本發明誘導分化的神經細胞。
圖.2是代替圖的免疫熒光照片組，顯示了根據本發明誘導分化的神經細胞對MAP-2抗體、神經絲抗體和巢蛋白(nestin)抗體的陽性反應。
圖.3是代替圖的免疫熒光照片組，顯示了根據本發明誘導分化的神經細胞對針對神經遞質合成酶酪氨酸羥化酶(TH)和神經遞質或神經遞質-相關肽囊泡乙酰膽堿轉運體(vesicular acetylcholinetransporter(VAChT))、神經肽Y(NPY)、P物質(SP)、谷氨酰胺(Glu)、降鈣素基因相關肽(CGRP)和血管活性腸肽(VIP)的抗體的陽性反應。
圖.4是代替圖的兩個免疫熒光照片，顯示了GDNF處理前后，根據本發明誘導分化的神經細胞的酪氨酸羥化酶陽性的變化(多巴胺能神經元分化率)。
圖.5顯示了GDNF處理前后，根據本發明誘導分化的神經細胞的酪氨酸羥化酶陽性的變化(多巴胺能神經元分化率)。
圖.6是代替圖的一對免疫熒光照片，顯示了神經營養蛋白(NTs；2.5S NGF)處理前后，根據本發明誘導分化的神經細胞的囊泡乙酰膽堿轉運體陽性的變化(乙酰膽堿能神經元分化率)。
圖.7顯示了神經營養蛋白(NTs；2.5 S NGF)處理前后，根據本發明誘導分化的神經細胞的囊泡乙酰膽堿轉運體陽性的變化(乙酰膽堿能神經元分化率)。
圖.8是代替圖的顯微照片(相差顯微鏡)，顯示了根據本發明誘導分化的骨骼肌細胞。
圖.9是代替圖的另一顯微照片(相差顯微鏡)，顯示了根據本發明誘導分化的骨骼肌細胞。該照片顯示了圖.8的骨骼肌隨時間的增加。
圖.10是代替圖的共焦激光顯微照片，顯示了根據本發明誘導分化的骨骼肌細胞的多核特性。核顯示為綠色和肌動蛋白纖維顯示為紅色。
圖.11是顯示了將由本發明分化誘導方法獲得的多巴胺能神經元植入大鼠帕金森氏病模型紋狀體的治療效果的兩個圖。
圖.12是代替圖的免疫熒光照片組，顯示了植入紋狀體的細胞不是神經膠質細胞而是神經細胞和多巴胺能神經元。
圖.13是代替圖的放大免疫熒光照片組，顯示了植入紋狀體的細胞是神經細胞和多巴胺能神經元。
圖.14a～14f顯示了分離的骨髓基質細胞(MSC)的特征。圖.14a顯示大鼠(MSC)的FACS分析結果。該細胞表達CD29(β1-整聯蛋白)，CD90(Thy-1)和CD54(ICAM)，而不表達CD34(造血干細胞標記物)或CD11b/c(巨噬細胞相關標記物)。圖.14b和14c是未處理的大鼠MSC(b)和未處理的人MSC(c)的相差顯微照片。圖.14d～14f為人MSC中CD29(d)、CD90(e)和CD34(f)的免疫組織化學照片。MSC為CD29和CD90陽性的，但卻是CD34陰性的。條帶代表50μm。
圖.15a～15h顯示了NICD(Notch細胞內結構域)轉染后的表現型。圖.15a顯示了NICD轉染前(泳道1)和NICD轉染后(泳道2)大鼠MSC中Notch細胞外結構域(ECD)和細胞內結構域(ICD)的RT-PCR結果。因為在未處理的MSC中檢測到了ECD，故天然表達少量內源性Notch。然而，在NICD轉染之后，ECD下調和NICD稍上調。圖.15b～15g是未處理的大鼠MSC(b，d，f)和NICD-轉染的大鼠MSC(c，e，g)中GLAST(b，c)、3-PGDH(d，e)和巢蛋白(f，g)的免疫組織化學照片。條帶在b，c，d和g中代表50μm而在e和f中代表80μm。圖.15h顯示了未處理的大鼠MSC(MSC)和NICD-轉染的大鼠MSC(NICD)的3-PGDH啟動子活性。3-PGDH的全長型和截短型(M1965)均顯示了NICD轉染后啟動子活性增加了9～10倍(p＜0.01)。
圖.16顯示了用不同營養因子處理時，MAP-2ab+細胞轉化率。當營養因子導入未處理的或用對照載體轉染的大鼠MSC時，均未檢測到MAP-2ab+細胞。導入三種營養因子(FSK+6FGF+CNTF)顯示出最高神經細胞生成率(96.5％)，而缺少這三種因子的任何一種都會導致較低的轉化率。
圖.17a～17q顯示了誘導的神經細胞的分析結果。圖.17a～17c是從大鼠MSC(a，b)和人MSC(c)中誘導的神經細胞的相差顯微照片。條帶在圖.17a中表示200μm而在圖.17b和17c表示50μm。圖.17d～17g和17i～17k是在導入營養因子后，大鼠MSC(f，g，i，j，k)和人MSC(d，e)(5日)中神經元標記物和神經膠質標記物的免疫組織化學照片。在人MSC中觀測到了標記物MAP-2ab(d)和神經絲-M(e)，而β3-微管蛋白(f)和TuJ-1(g)在大鼠MSC中表達。大鼠或人類細胞都不與神經膠質標記物GFAP(I)，GalC(j)和O4(k)反應。條帶在d，e和f中表示100μm，在g中表示60μm而在在i～k中表示100μm。圖.17h顯示了神經細胞的Brd-U標記。MAP-2ab陽性細胞(Alexa Fluor 488-標記的，綠碼)未整合Brd-U(Alexa Fluor 546-標記的，紅色碼)。圖.17l顯示了MAP-2ab大鼠樣本(1)和GFAP大鼠樣本(2)的蛋白印跡分析結果。泳道1為蛋白印跡而泳道2為麗春紅S染色。未處理的MSC(M)既不表達MAP-2ab也不表達GFAP。在導入營養因子后第5日(N)，MSC為MAP-2ab陽性，但仍為GFAP陰性。將腦(B)作為MAP-2ab和GFAP二者的陽性對照。圖.17m～17q顯示了從大鼠MSC(m)誘導的神經細胞和從人MSC(n，p)誘導的神經細胞膜片箝測試的結果。與未處理的MSC(o，p)相比，誘導導致了整流K+電流的顯著增加，其在大鼠MSC(m)和人MSC(n)中分別達到約1600pA和4000pA。圖.17q顯示了記錄于圖.17n中的人MSC的相差顯微照片。
圖.18是一對顯示了未處理的大鼠MSCs(MSC)、NICD-轉染的大鼠MSC(NICD)和神經誘導的大鼠MSC(誘導的)的Neuro D和GFAP的相對啟動子活性的圖。
圖.19a～19m顯示了移植至大鼠帕金森氏病模型的結果。圖.19a顯示了營養因子誘導后大鼠MSC中下述神經遞質的百分比γ-氨基丁酸(GABA)；0.3±0.1，血管活性腸肽(VIP)；0.5±0.1，5-羥色胺(Ser)；2.0±0.4，谷氨酸(Glu)；2.3±0.7，P物質(SP)；2.4±0.9，TH；3.9±0.6，囊泡乙酰膽堿轉運體(VACht)；5.2±2.4，降鈣素基因相關肽(CGRP)；5.3±0.8，神經肽Y(NPY) 6.1±1.6。通過隨后施用GDNF，TH-陽性細胞百分比顯著增加至41.0±14.1(G-TH)。圖.19b和19c顯示了營養因子誘導后和然后GDNF處理后的人MSC中TH表達。人MSC表現出與大鼠MSC相同的反應，在GDNF處理后TH-陽性細胞明顯增加。條帶在b中表示100μm而在c中表示30μm。圖.19d顯示了大鼠MSC中Nurr-1的RT-PCR結果。與營養因子單獨誘導(N)的細胞相比，在施用GDNF(Ng)后可觀察到增加的Nurr-1上調。圖.19e顯示了大鼠MSC中TH的蛋白印跡。在MSC中導入營養因子(N)后TH表達較弱，但在導入GDNF(Ng)后則增加。腎上腺髓質(A)作為陽性對照。泳道1為蛋白印跡而泳道2為麗春紅S染色。圖.19f顯示了將大鼠MSC植入紋狀體后的行為效果。該圖顯示了MSC組(▲-▲)，N-MSC組(●-●)和G-MSC組(■-■)(*0.01＜p＜0.05；**p＜0.01)中阿樸嗎啡誘導的旋轉。圖.19g～19k是在移植入G-MSC組中后第10周時，紋狀體中神經絲-M(s)、TH(h)、DAT(i)、GFAP(j)和O4(i)的免疫染色照片。這些標記物的信號全部用Alexa 546標記(紅碼)。首先用GFP標記移植的大鼠MSC。在g，h和i中觀測到成雙的GFP-神經絲、GFP-TH和GFP-DAT，而在GFAP染色或O4染色時不能觀測到。條帶代表50μm。圖.19l是一組顯示了GFP-標記的大鼠MSC(G-MSC組)整合至紋狀體中的一組截面圖。將在TH免疫組織化學(紅色)后通過圖中點所標記的區域顯示共焦圖像。條帶代表50μm。圖.19m顯示了在移植GDNF-處理的人神經MSC后大鼠中阿樸嗎啡誘導的旋轉。顯示了直至移植后4周的來自5只大鼠(平均旋轉0.44±0.2)的結果(每種顏色代表一只大鼠)。
發明詳述本發明人研究了通過導入在骨髓基質細胞形態發生初期中發揮中心作用的基因刺激骨髓基質細胞，并檢測了所述刺激對誘導骨髓基質細胞分化的影響。具體地，通過導入Notch基因和Notch信號傳導基因(其在神經系統的發育分化和在前體細胞分化為神經細胞或神經膠質細胞時在確定細胞命運中發揮作用)，可以“重新設定(reset)”骨髓基質細胞。
重要的是注意到盡管Notch基因和Notch信號傳導相關基因涉及抑制細胞誘導分化機制，完全意料不到地發現是將導入Notch基因和Notch信號傳導相關基因與其它誘導分化的刺激聯合，也能誘導分化已經導入了Notch基因和Notch信號傳導相關基因的特定細胞(而不是與已經導入了Notch基因和Notch信號傳導相關基因的細胞接觸的細胞)。未證實在本發明分化誘導方法中導入Notch基因和Notch信號傳導相關基因能導致骨髓基質細胞的發育分化重新設定。然而，通過將該基因導入與根據本發明的其它分化誘導步驟聯合，結果能夠提供有效地將骨髓基質細胞誘導分化為神經細胞或骨骼肌細胞的方法。
根據聯合步驟(包括導入Notch基因和Notch信號傳導相關基因)的重復實驗，本發明人首先成功地有效誘導骨髓基質細胞體外分化為神經細胞或骨骼肌細胞。而且，已經證實了通過將用分化誘導方法獲得的神經細胞植入大鼠帕金森氏病模型或大鼠視神經損傷相關性視網膜模型或視神經退化模型，植入的神經確實可以保留并發揮功能，由此完成了本發明。
令人驚奇的是，通過將Notch基因和Notch信號傳導相關基因導入骨髓基質細胞，通過施用確信與促進神經分化有關的多種因子和細胞因子，和通過增加被認為是分化開始的一般引發因子的細胞內cAMP，可以成功地在體外培養條件下將骨髓基質細胞誘導分化為神經細胞。我們不僅證實了神經細胞特異性MAP-2和神經絲的表達，還證實了神經遞質合成酶酪氨酸羥化酶的表達和神經遞質如乙酰膽堿、神經肽Y和P物質的產生。
另一方面，已有人指出由5-氮胞苷(5-AZC)造成的一個或非常少的幾個基因的脫甲基化和活化導致了向成肌細胞的轉變(參見Taylar SM，Jones PACell 17771-779，1979和Nabeshima Y.，Seitaino Kagaku 47(3)184-189，1996)。因此，我們將前述Notch基因和Notch信號傳導相關基因導入神經細胞與采用5-氮胞苷(5-AZC)處理的前述脫甲基化聯合起來。具體地，通過采用前述脫甲基劑的基因脫甲基化作用而消除被抑制的表達從而重新設置骨髓基質細胞，隨后導入Notch和Notch信號傳導相關基因，并將該基因導入的細胞與無該基因的骨髓基質細胞共培養，最后用細胞內cAMP的增多劑處理細胞，其中細胞內cAMP被認為是啟動分化的一般引發子，我們成功地通過體外培養將Notch和Notch信號傳導相關基因導入的細胞誘導分化為骨骼細胞。在最終所得細胞中發現了特征性多核肌管形成和橫紋化，且肌肉-特異性蛋白質即肌細胞生成素和Myf5的表達也在mRNA水平得到證實。
根據本發明的一個方面，提供了將骨髓基質細胞體外誘導分化為神經細胞或骨骼肌細胞的方法，所述方法包括將Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因導入細胞，其中所得分化細胞是導入了Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因的骨髓基質細胞的細胞分裂子代。
根據本發明的另一個方面，提供了將骨髓基質細胞體外誘導分化為神經前體細胞的方法，包括如下步驟(1)從骨髓分離骨髓基質細胞，并在添加了血清的標準基本培養基中培養細胞；和(2)將Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因導入細胞，并進一步培養細胞以生成神經前體細胞。
分離的骨髓基質細胞可以是人類細胞。
而根據本發明的另一方面，提供了用前述方法制備的神經前體細胞。
而根據本發明的另一方面，提供了表達神經前體細胞標記物GLAST，3PGDH和巢蛋白的神經前體細胞。
而根據本發明的另一個方面，提供了將骨髓基質細胞體外誘導分化為神經細胞的方法，包括如下步驟(1)從骨髓分離骨髓基質細胞，并在添加了血清的標準基本培養基中培養細胞；(2)將Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因導入細胞，并進一步培養細胞，和(3)在培養基中加入環AMP-增多劑(augmenting agent)或環AMP類似物，和/或細胞分化刺激因子，并進一步培養細胞以生成神經細胞，其中所得分化細胞是導入了Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因的骨髓基質細胞的細胞分裂子代。
標準基本培養基可以是伊格爾氏α改良的最低必需培養基(Eaglesalpha modified minimum essential medium)，血清可以是胎牛血清。
Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因的導入可通過使用哺乳動物表達載體的脂轉染法實施。
所述方法還可包括，在步驟(2)和(3)間，在一個預定的時期選擇已經導入了基因的細胞的步驟。
環AMP-增多劑或環AMP類似物可以是毛喉素，其濃度可以是0.001nM～100μM。
細胞分化刺激因子可選自堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，睫狀神經營養因子(CNTF)及其混合物。
細胞分化刺激因子的濃度可以是0.001ng/ml～100μg/ml。
分離的骨髓基質細胞優選為人類細胞。
而根據本發明的另一方面，提供了用前述方法制備的神經細胞。
而根據本發明的另一方面，提供了表達神經細胞標記物β-微管蛋白同種型3和TuJ-1的神經細胞。
而根據本發明的另一個方面，提供了將骨髓基質細胞體外誘導分化為多巴胺能神經元的方法，包括如下步驟(1)從骨髓分離骨髓基質細胞，并在添加了血清的標準基本培養基中培養細胞；(2)將Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因導入細胞，并進一步培養細胞，和(3)在培養基中加入環AMP-增多劑或環AMP類似物，和/或細胞分化刺激因子，并進一步培養細胞以生成神經細胞；(4)在添加了血清的標準基本培養基培養獲自步驟(3)的神經細胞；和(5)在培養基中加入神經膠質源性神經營養因子(GDNF)，和環AMP-增多劑或環AMP類似物，和/或除神經膠質源性神經營養因子之外的細胞分化刺激因子，并進一步培養細胞以獲得多巴胺能神經元，其中所得多巴胺能神經元是導入了Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因的骨髓基質細胞的子代。
步驟(4)中的標準基本培養基可以是伊格爾氏α改良的最低必需培養基。
步驟(4)中的血清可以是胎牛血清。
步驟(5)中的環AMP-增多劑或環AMP類似物可以是毛喉素。步驟(5)中環AMP-增多劑或環AMP類似物的濃度可以是0.001nM～100μM。
步驟(5)中除神經膠質源性神經營養因子以外的細胞分化刺激因子可選自堿性成纖維細胞生長因子(bFG)、血小板衍生生長因子-AA(PDGF-AA)及其混合物。
步驟(5)中神經膠質源性神經營養因子的濃度可以是0.001ng/ml～100μg/ml，優選為1ng/ml～100ng/ml。
步驟(5)中除神經膠質源性神經營養因子以外的細胞分化刺激因子的濃度可以是0.001ng/ml～100μg/ml。
分離的骨髓基質細胞優選是人類細胞。
而根據本發明的另一方面，提供了用前述方法制備的多巴胺能神經元。
而根據本發明的另一個方面，提供了將骨髓基質細胞體外誘導分化為乙酰膽堿能神經元的方法，包括如下步驟(1)從骨髓分離骨髓基質細胞，并在添加了血清的標準基本培養基中培養細胞；(2)將Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因導入細胞，并進一步培養細胞；(3)在培養基中加入環AMP-增多劑或環AMP類似物，和/或細胞分化刺激因子，并進一步培養細胞以生成神經細胞；(4)在添加了血清的標準基本培養基中培養獲自步驟(3)的神經細胞；和(5)在培養基中加入神經生長因子(NGF)，和環AMP-增多劑或環AMP類似物，和/或除神經生長因子外的細胞分化刺激因子，并進一步培養細胞以獲得乙酰膽堿能神經元，其中所得乙酰膽堿能神經元是導入了Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因的骨髓基質細胞的子代。
步驟(4)中的標準基本培養基可以是伊格爾氏α改良的最低必需培養基。步驟(4)中的血清可以是胎牛血清。
步驟(5)中環AMP-增多劑或環AMP類似物可以是毛喉素。步驟(5)中的環AMP-增多劑或環AMP類似物的濃度可以是0.001nM～100μM。
步驟(5)中除神經生長因子以外的細胞分化刺激因子可選自堿性成纖維細胞生長因子(bFG)、血小板衍生生長因子-AA(PDGF-AA)及其混合物。
步驟(5)中神經生長因子的濃度可以是0.001ng/ml～100μg/ml，優選為1ng/ml～100ng/ml。
步驟(5)中除神經生長因子以外的細胞分化刺激因子的濃度可以是0.001ng/ml～100μg/ml。
分離的骨髓基質細胞優選是人類細胞。
而根據本發明的另一方面，提供了用前述方法制備的乙酰膽堿能神經元。
而根據本發明的另一個方面，提供了將骨髓基質細胞體外誘導分化為骨骼肌細胞的方法，包括如下步驟(1)從骨髓分離骨髓基質細胞，并在添加了血清的標準基本培養基中培養細胞；(2)在培養基中加入脫甲基劑，并進一步培養細胞；(3)在培養基中加入環AMP-增多劑或環AMP類似物，和/或細胞分化刺激因子，并進一步培養細胞，(4)將Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因導入細胞，并進一步培養細胞，(5)將導入了所述基因的細胞與沒有導入所述基因的未處理骨髓基質細胞共培養；和(6)在培養基中加入環AMP-增多劑或環AMP類似物，并進一步培養細胞以獲得骨骼肌細胞，其中所得分化細胞是導入了Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因的骨髓基質細胞的子代。
標準基本培養基可以是伊格爾氏α改良的最低必需培養基，血清可以是胎牛血清。
脫甲基劑可以是5-氮胞苷，其濃度為30nmol/l～300μmol/l。
步驟(3)中環AMP-增多劑或環AMP類似物可以是毛喉素。
步驟(3)中的環AMP-增多劑或環AMP類似物濃度可以是0.001nM～100μM。
細胞分化刺激因子可選自堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血小板衍生生長因子-AA(PDGF-AA)、heregulin，及其混合物，其濃度可以是0.001ng/ml～100μg/ml。Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因的導入可通過使用哺乳動物的表達載體的脂轉染法實施。
所述方法還可包括，在步驟(4)和(5)間，在一個預定的時期選擇已經導入了基因的細胞的步驟。
步驟(5)中環AMP-增多劑或環AMP類似物可以是毛喉素。
步驟(5)中環AMP-增多劑或環AMP類似物的濃度可以是0.001nM～100μM。
分離的骨髓基質細胞優選是人類細胞。
而根據本發明的另一方面，提供了用前述方法制備的骨骼肌細胞。
而根據本發明的另一方面，提供了治療患有中樞神經系統疾病、紊亂或病癥的患者的方法，所述方法包括將治療有效量的前述神經前體細胞施用于發現有疾病、紊亂或病癥的患者的中樞神經系統區域，其中神經前體細胞的存在表現出對疾病、紊亂或病癥的治療效果。
而根據本發明的另一方面，提供了治療有效量的前述神經前體細胞在制備用于治療患有中樞神經系統疾病、紊亂或病癥的患者的藥物組合物中的用途。
而根據本發明的另一方面，提供了治療患有中樞神經系統疾病、紊亂或病癥的患者的方法，所述方法包括將治療有效量的前述神經細胞施用于發現疾病、紊亂或癥狀的患者的中樞神經系統區域，其中神經細胞的存在表現出對疾病、紊亂或癥狀的治療效果。
而根據本發明的另一方面，提供了治療有效量的前述神經細胞在制備用于治療患有中樞神經系統疾病、紊亂或病癥的患者的藥物組合物中的用途。
而根據本發明的另一方面，提供了治療患有中樞神經系統疾病、紊亂或病癥的患者的方法，所述方法包括將治療有效量的前述表達神經細胞標記物β-微管蛋白同種型3和TuJ-1的神經細胞施用于發現有疾病、紊亂或病癥的患者的中樞神經系統區域，其中神經細胞的存在表現出對疾病、紊亂或病癥的治療效果。
而根據本發明的另一方面，提供了治療有效量的表達神經細胞標記物β-微管蛋白同種型3和TuJ-1的前述神經細胞在制備用于治療患有中樞神經系統疾病、紊亂或病癥的患者的藥物組合物中的用途。
而根據本發明的另一方面，提供了治療患有中樞神經系統疾病、紊亂或病癥的患者的方法，所述方法包括將治療有效量的前述多巴胺能神經元施用于發現有疾病、紊亂或病癥的患者的中樞神經系統區域，其中神經細胞的存在表現出對疾病、紊亂或病癥的治療效果。
而根據本發明的另一方面，提供了治療有效量的前述多巴胺能神經元在制備用于治療患有中樞神經系統疾病、紊亂或病癥的患者的藥物組合物中的用途。
而根據本發明的另一方面，所述疾病、紊亂或病癥可以是帕金森氏病。
而根據本發明的另一方面，提供了治療患有中樞神經系統疾病、紊亂或病癥的患者的方法，所述方法包括將治療有效量的前述乙酰膽堿能神經元施用于發現有疾病、紊亂或病癥的患者的中樞神經系統區域，其中神經細胞的存在表現出對疾病、紊亂或病癥的治療效果。
而根據本發明的另一方面，提供了治療有效量的前述乙酰膽堿能神經元在制備用于治療患有中樞神經系統疾病、紊亂或病癥的患者的藥物組合物中的用途。
所述疾病、紊亂或病癥可選自ALS(肌萎縮性側索硬化癥)和阿耳茨海默氏病。
而根據本發明的另一方面，提供了治療患有與肌肉退化相關的疾病、紊亂或病癥的患者的方法，所述方法包括將治療有效量的前述骨骼肌細胞施用于患者的肌肉退化區域，其中骨骼肌細胞的存在表現出對疾病、紊亂或病癥的治療效果。
而根據本發明的另一方面，提供了治療有效量的前述骨骼肌細胞在制備用于治療患有與肌肉退化相關的疾病、紊亂或病癥的患者的藥物組合物中的用途。
所述疾病、紊亂或病癥可以是肌肉萎縮癥。
在本說明書全文中，術語“骨髓基質細胞”是指存在于骨髓中而不存在造血系統中的并具有分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等的潛能的細胞。骨髓基質細胞可通過CD29(β1-整聯蛋白)、CD90(Thy-1)和CD54(ICAM-1)陽性和CD34(造血干細胞標記物)和CD11b/c(巨噬細胞標記物)陰性而得以鑒別。
如本說明書全文中所使用的與誘導分化相關的術語“有效地”是指通過本發明的分化誘導方法可將所選擇的骨髓基質細胞以高轉化率最終轉變為神經細胞或骨骼肌細胞。本發明的分化誘導方法的效率為50％或更高、優選75％或更高、更優選80％或更高、更優選85％或更高，更優選90％或更高和最優選95％或更高。
如本說明書全文中所使用的術語“神經前體細胞”是指導入Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因后即刻可得的骨髓基質細胞，更具體地，它們是導入營養因子前的細胞。
如本說明書全文中所使用的術語“神經細胞”是指形態學特征為細胞體和兩類突觸(樹突和軸突)，生物化學特征為與針對β-微管蛋白同種型3和TuJ-1的抗體反應的神經元。
神經細胞的特征是分泌神經遞質、神經遞質合成酶或神經遞質-相關性蛋白，例如，酪氨酸羥化酶(TH)，囊泡乙酰膽堿轉運體，神經肽Y和P物質(SP)。
酪氨酸羥化酶是多巴胺能神經元的標記物，而囊泡乙酰膽堿轉運體是乙酰膽堿能神經元(通常是運動神經元)的標記物。
如本說明書全文中所使用的術語“神經膠質細胞”是指在中樞神經中，在神經元和其突觸間發現的星形膠質細胞，少突膠質細胞，小膠質和上皮細胞。
神經膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)是星形膠質細胞的標記物，O4是少突膠質細胞的標記物。
如本說明書全文中所使用的術語“骨骼肌細胞”是指肌纖維或肌肉纖維，且其是骨骼肌的單個肌細胞。在形態學上。其特征為具有肌管形成和橫紋化的非常長、細、多核的細胞，而在生物化學上，其特征在于表達轉錄調節因子如肌細胞生成素和Myf5。
根據本發明的誘導骨髓基質細胞分化為神經細胞或骨骼肌細胞的方法是新的，因為其包括將Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因導入前述細胞的步驟。另一新方面是該步驟可以與其它現有技術中的分化步驟以指定順序組合。本發明人將根據本發明的所述步驟的選擇和最優組合組成了高度顯著性的新發現。已知，骨髓基質細胞是能被誘導分化為成骨細胞、血管內皮細胞、骨骼肌細胞、脂肪細胞和平滑肌細胞的間充質干細胞或前體細胞，但骨髓基質細胞是否確實能被分化為神經細胞或骨骼肌細胞則是未知的，盡管已有大量嘗試但該目標尚未成功實現。然而不想受到任何具體理論限制，本發明人推測將Notch基因和/或Notch基因信號傳導相關基因導入前述細胞中會導致細胞在發育分化方面的重新設置，并能輔助其他分化誘導處理的功能。
下述實施例更詳細地解釋本發明，這些實施例應理解為不以任何方式限制本發明的范圍。
實施例實施例1神經誘導從成年大鼠(Wistar大鼠)的骨髓中提取基質細胞并進行培養。所使用的培養基為含有20％胎牛血清(14-501F，Lot #61-1012，BioWhittaker Co.)的Minimum Essential Medium Alpha EagleModification(M4526，Sigma Co.)。
在傳4代后，當細胞接近80-90％匯合時，導入Notch細胞內結構域的基因。將Notch細胞內結構域的3.1kb EcoRI-XbaI片段插入pCI-neo哺乳動物表達載體(#E1841)(Promega)的EcoRI-XbaI多克隆位點以實施重組。采用AlipofectAMINE 2000(11668-027，GibcoBRL)系統實施導入。
于導入后的那一天，將G418硫酸鹽(83-5027，Gibco BRL)加至濃度為200ng/ml然后用10天時間選擇導入的細胞。
在細胞群體恢復至90％匯合后，加入5μM毛喉素(344273，Calbiochem)、10ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(100-18B，PeprotechEC，Ltd.)和50ng/ml睫狀神經營養因子(557-NT，R&D Systems)。
約10日后分析細胞，結果如圖.1所示，觀測到神經細胞的特征性形態學。誘導的細胞表現出與抗MAP-2(MAB364，Chemicon)、神經絲(814342，Boehringer Manheim)和巢蛋白(BMS4353，Bioproducts)的抗體的陽性反應，如圖.2中所示。因為MAP-2和神經絲是神經細胞的標記物而巢蛋白是神經前體細胞的標記物，因此可判斷誘導的細胞具有神經細胞的特性。
采用抗神經遞質合成酶酪氨酸羥化酶(AB151，Chemicon)和神經遞質或神經遞質-相關性蛋白囊泡乙酰膽堿轉運體(AB1578，Chemicon)、神經肽Y(RIN7172，Peninsula Lab Inc.)、P物質(RPN1572，Amersham Inc.)等的抗體實施試驗，如圖.3中所示，顯示了細胞對每個抗體約有2～4％的陽性，由此也顯示出存在產生神經遞質的神經細胞。
采用該步驟誘導神經細胞，在這一階段，全部分化誘導的神經細胞的2.9±0.5％表現出對酪氨酸羥化酶(多巴胺能神經元的標記物)的反應，如圖.5左所示。而且，如圖.7左所示，全部分化誘導的神經細胞的1.78±0.75％表現出對囊泡乙酰膽堿轉運體(通常是運動神經元的乙酰膽堿能神經元的標記物)的反應。
實施例2多巴胺能神經元的誘導在包含10％胎牛血清(14-501F，Lot#61-1012，BioWhittakerCo.)，還包括50ng/ml神經膠質源性神經營養因子(GDNF)(人重組GDNF，#450-10，Peprotech EC Ltd.)、5μM毛喉素(344273，Calbiochem)、10ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(100-18B，Peprotech EC，Ltd.)和5ng/ml血小板衍生生長因子-AA(396-HB，Peprotech EC Ltd.)的Minimum Essential Medium Alpha EagleModification(M4526，Sigma Co.)中培養分化誘導的神經細胞。
該步驟的結果為，與酪氨酸羥化酶反應的多巴胺能神經元增至全部神經細胞的17.2±5.1％(參見圖.5右)。如圖.4中照片所示，在GDNF處理后，用FIPC染成綠色的酪氨酸羥化酶蛋白的比率顯著增加。
實施例3乙酰膽堿能神經元的誘導在包含10％胎牛血清(14-501F，Lot #61-1012，BioWhittakerCo.)，還包含神經生長因子(2.5 S NGF，#T002A，Takara)、5μM毛喉素(344273，Calbiochem)、10ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(100-18B，Peprotech EC，Ltd.)和5ng/ml血小板衍生生長因子-AA(396-HB，Peprotech EC Ltd.)的Minimum Essential Medium AlphaEagle Modification(M4526，Sigma Co.)中培養實施例1的分化誘導的神經細胞。
該步驟的結果是，與囊泡乙酰膽堿轉運體反應的乙酰膽堿能神經元增至全部神經細胞的20.5±0.05％(參見圖.7右)。如圖.6中照片所示，在NGF(神經營養因子(Nts))處理后，用FIPC染成綠色的囊泡乙酰膽堿轉運體蛋白的比率顯著增加。
實施例4骨骼肌誘導從成年大鼠的骨髓(Wistar大鼠)中提取基質細胞并培養。所使用的培養基為包含20％胎牛血清(14-501F，Lot #61-1012，BioWhittaker Co.)的Minimum Essential Medium Alpha EagleModification(M4526，Sigma Co.)。
在傳4代后，當細胞接近80-90％匯合時，加入3μmol/l 5-氮胞苷，然后毛喉素繼續培養24小時。
然后將培養基換為包含5μM毛喉素(344273，Calbiochem)、10ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(100-18B，Peprotech EC，Ltd.)和5ng/ml血小板衍生生長因子-AA(396-HB，Peprotech EC Ltd.)以及200ng/ml的heregulin(396-HB，R&D Systems)的培養基，然后再繼續培養7日。
然后采用與實施例1相同的方法導入Notch細胞內結構域基因。
于導入后1日，加入G418硫酸鹽(83-5027，Gibco BRL)至濃度為200ng/ml然后用10天時間篩選導入的細胞。
在細胞群體恢復至大約100％匯合后，將沒有導入基因的未處理骨髓基質細胞加入培養基中并進行共培養。
3日后，加入5μM毛喉素(344273，Calbiochem)。再過幾日后，該細胞隨時間增加(圖.9)融合至局部呈現多核的骨骼肌細胞(參見圖.8)。采用共焦激光顯微鏡觀測骨骼肌細胞，如圖.10中所示。通過RT-PCR證實細胞中肌細胞生成素和Myf5 mRNA的表達。電子顯微鏡觀察顯示了骨骼肌細胞的肌纖維特征。
實施例5將采用本發明的分化誘導方法獲得的多巴胺能神經元植入大鼠帕金森氏病模型紋狀體中時的治療效果我們檢測了將采用本發明的分化誘導方法獲得的多巴胺能神經元植入大鼠帕金森氏病模型的效果。已經通過將6-OHDA(6-羥基多巴胺)注入大鼠腦黑質中而建立了帕金森氏病模型，這些模型用于本試驗(Svendsen等，Exp.Neurol.137376-388(1996)；Svensen等，Exp.Neurol.148135-146(1997))。已知，將阿樸嗎啡施用于所述大鼠模型可刺激旋轉運動，旋轉增加提示惡化，而旋轉降低提示改善。
如圖.11頂部所示，通過將誘導的神經細胞植入紋狀體，在9周的觀察期間，每分鐘的旋轉次數與緊接移植后相比幾乎沒有變化。在無處理時，每分鐘的旋轉次數傾向于逐漸增加(未顯示)，因此水平斜率顯示至少阻止了惡化。
如圖.11底部所示，通過將誘導的多巴胺能神經元植入紋狀體，每分鐘的旋轉次數從移植后的第一周開始降低，在大約半數動物中，在9周后發現每分鐘的旋轉次數達到0或1或2，從而得到非常顯著的改善。(在9周后表現為超過8次旋轉/分鐘的圖.11底部中的兩例被認為是表示移植失敗因此未在評估中予以考慮。)為了研究本發明注射(移植)至紋狀體中的多巴胺能神經元所分化出的細胞類型，在10周后提取紋狀體組織并將其切片用于免疫組織化學檢測。
使用逆轉錄病毒將能發出綠色熒光的綠色熒光蛋白(GFP)的基因整合至骨髓基質細胞染色體。因此，如圖.12中免疫熒光照片所示，誘導分化自骨髓基質細胞的神經細胞，并因此植入紋狀體的多巴胺能神經元，發射綠色熒光。
而且，將紅光發射用于作為神經細胞標記物的神經絲，作為多巴胺能神經元標記物的酪氨酸羥化酶，作為星形膠質細胞(神經膠質細胞)標記物的GFAP和作為少突膠質細胞(神經膠質細胞)標記物的O4。
因此，GFP產生的綠光和前述標記物產生的紅光疊加生成黃光，從而區分移植10周后移植的多巴胺能神經元形成的細胞類型。
如圖.12所示，移植10周后幾乎所有的紋狀體-移植細胞分化為神經細胞而不是神經膠質細胞。而且，從相當多數量的酪氨酸羥化酶-陽性的神經細胞(即多巴胺能神經元)中判斷，可以得出如下結論，本發明的體外分化誘導方法將多巴胺能神經元比率增至總神經細胞的17.2±5.1％，而前述移植進一步增加了該比率。
圖.13是放大的免疫熒光照片組，顯示了酪氨酸羥化酶的著色。在圖.13中，無論何種細胞類型，細胞核均為藍色(復染)。藍色的核的位置顯示了細胞的位置。
該步驟證實了在這些大鼠帕金森氏病模型中，將用本發明的分化誘導方法得到的多巴胺能神經元植入紋狀體中能顯著地改善帕金森氏病的癥狀。
下述為用于下列實施例6～11中的試驗步驟。
試驗步驟培養骨髓基質細胞本發明人以前的文獻[4]中描述了從Wistar大鼠骨髓中分離MSC的方法。人MSC獲自商業來源(PT-2501，BioWhittaker，Walkersville，Maryland)和健康供體(根據Kyoto University Graduate School ofMedicine的Ethics Committee的指南獲得)。采用前述方法[3]分離人MSC。在包含10％胎牛血清(FBS)的α-MEM(M-4526，Sigma，St.Louis，Missouri)中培養細胞。
FACS分析采用FITC-標記的小鼠抗-CD34(Santa Cruz Biotechnology Inc.，Santa Cruz，California)，抗-CD54，抗-CD90和抗-CD11b/c或倉鼠抗-CD29(PharMingen，San Diego，California)孵育大鼠MSC。用FITC-標記的抗-小鼠或抗-倉鼠IgG，或者用未免疫小鼠血清孵育對照組。對人MSC使用藻紅蛋白-標記的小鼠抗-CD34，抗-CD29，抗-CD90，抗-CD54，抗-CD11c和抗-血管性血友病(von-Willebrand)因子。對照組包括用藻紅蛋白-標記的抗-小鼠IgG染色的細胞。獲取數據然后用CellQuest軟件(Becton Dickinson，Franklin Lakes，New Jersey)在FACScalibur上分析。
質粒根據Weinmaster等(1991)39的方法對Notch1進行編號。將m-Notch 1細胞內結構域NICD(開始于氨基酸1703并終止于3’非翻譯區)，TM(氨基酸1747～2531)，M2(通過突變兩個氨基酸Ala-Ala(1992和1993)為Glu-Phe而修飾自TM)(NICD，TM和M2由Dr.Masashi Kawaichi提供)[17，34]，mNIC Δ3’(氨基酸1846-2477，由Dr.Jeffery Nye提供)[35]，RAMIC(氨基酸1703-1969，通過NotI和AccIII酶切消化獲自NICD cDNA)和TADIC(氨基酸2192-2531，通過XhoI和XbaI酶切消化獲自NICD cDNA)的cDNA亞克隆至pCI-neo哺乳動物的表達載體(Promega，Madison，Wisconsin)。3-PGDH(全長和M1965二者)的熒光素酶報告質粒由Dr.ShigekiFuruya[29]提供，NeuroD由Ming-Jer Tsai[40]提供，GFAP啟動子由Caleb E Finch[41]提供。采用lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，California)將這些質粒轉染MSC和并根據廠商指南通過G418進行選擇。
神經誘導實驗對于營養因子誘導，將NICD-轉化的MSC的亞匯合培養物在包含10％FBS、5μM FSK(Calbiochem，La Jolla，California)、10ng/mlbFGF(Peprotech，London，UK)和10ng/ml CNTF(R&D Systems，Minneapolis，Minnesota)的α-MEM中孵育。對于GDNF處理，將50ng/ml GDNF(Peprotech)加至包含10％FBS的α-MEM培養基中。
Brd-U標記在營養因子誘導后(5日)，將Brd-U(10μM)加入培養基，然后培養24小時。然后用4％多聚甲醛的PBS溶液將細胞固定并在TOTO-3(Molecular Probes)復染前進行MAP-2ab和Brd-U雙標記。
RT-PCR分析采用SV總RNA提取系統(Promega)分離總細胞RNA。為了分析不同mRNA的相對表達，將cDNA的量根據來自遍在表達的β-肌動蛋白mRNA的信號進行標準化。使用Taq聚合酶(Sigma)按標準步驟實施PCR。循環參數為94℃變性30秒，54-68℃退火1分鐘(依賴于引物)，和72℃延伸，35個循環。
免疫細胞化學具體步驟如前述[4]。GLAST抗體由Dr.Masahiko Watanabe[18]提供，3-PGDH由Dr.Shigeki Furuya[19]提供。下述一抗為商業購得巢蛋白(1500，PharMingen)、MAP-2ab(1250，Sigma)、神經絲-M(1200，Chemicon，Temecula，California)、β-微管蛋白同種型3(1400，Sigma)、TuJ-1(1100，Babco，Richmond，California)、GFAP(11，DAKO，Carpinteria，California)、O4(120，BoehringerMannheim，Germany)、GalC(130，Chemicon)、GABA(11000，Sigma)、5-羥色胺轉運體(1200，Chemicon)、囊泡乙酰膽堿轉運體(1100，Chemicon)、谷氨酰胺(1100，Chemicon)，神經肽Y(11000，Peninsula Laboratories Inc.，Belmont，California)、TH(1200，Chemicon)、VIP(1500，Incstar，Stillwater，Minnesota)、CGRP(11200，Amersham，Buckinghamshire，UK)、SP(1500，Amersham)、DAT(1200，Chemicon)。用Alexa Fluor 488-或546-綴合的二抗孵育細胞，然后進行TOTO-3碘化物復染。在共焦激光掃描顯微鏡(Radians 2000，Bio-Rad，Hertfordshire，UK)下檢測細胞報告物測定根據廠商指南用lipofectamine 2000(Invitrogen)轉染細胞。轉染后48小時，采用雙熒光酶檢測試劑盒(Promega)檢測細胞的螢火蟲和腎海鰓(Renilla)熒光酶活性。通過表達腎海鰓熒光酶的質粒將螢火蟲熒光酶值進行校正以測定轉染效率。
Western-印跡分析。
制備細胞溶胞產物，然后將50μg溶胞蛋白在5％和10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳。采用堿性磷酸酶檢測MAP-2(1500，Chemicon)，GFAP(1500，Dako)和TH(11000，Chemicon)抗體的抗原。
電生理學方法用CEZ-2300(Nihon Kohden，Tokyo，Japan)膜片箝放大器于室溫(20-25℃)檢測電流。用pClamp 6.0軟件(Axon Instruments，Inc.，Foster City，California)控制數據采集和刺激。在5kHz濾過信號并在10～50kHz取樣。采用吸量管(硼硅玻璃，Narishige，Tokyo，Japan)以4～8MΩ的電阻值在全細胞膜片箝構型中實施實驗。為記錄延遲整流鉀電流，標準細胞外溶液包含(mM)NaCl(150)、KCl(4)、CaCl2(2)、MgCl2(2)、葡萄糖(10)和Hepes(10)(用NaOH調為pH 7.4)。標準吸量管溶液為(mM)KCl(130)、MgCl2(5)、EGTA(10)和Hepes(10)(用KOH調為pH 7.4)。
帕金森病模型大鼠的分析在先的報道[45]中已經公開了建立該病模型的步驟。簡言之，用戊巴比妥鈉(40mg/kg，腹膜內)麻醉成體雄性Wistar大鼠(體重250-300g)，然后將6-OHDA溶液(8μg/4μl 0.1％抗壞血酸鹽水)注入左內側位前腦束(A/P＝-4.4mm；距前囪的L＝+1.1mm，距硬腦膜的V＝-7.7mm)。
將延長的對側旋轉用作目標行為，將在施用阿樸嗎啡后(0.8mg/Kg，皮下)最初30分鐘表現為平均低于6旋轉/分鐘的大鼠排除出去。將1×105細胞/8μl以下述座標A/P＝+0.5mm；距前囟L＝+3.0mm，和V＝-4.5mm植入受損的紋狀體。MSC組中動物數為5，N-MSC組中為6和G-MSC組中為10。
為了移植的紋狀體(術后10周G-MSC組)的免疫組織化學，用抗神經絲-M、TH、DAT、GFAP和O4的抗體孵育神經膠質切片。然后在TOTO-3碘化物 復染前，通過Alexafluor 546-標記的二抗(Molecular Probes)進行檢測。
對于人MSC的移植，植入5只動物并通過每日一次皮下注射FK506(1mg/kg，Fujisawa，Osaka，Japan)來抑制免疫。移植4周后，檢測阿樸嗎啡誘導的旋轉。為了在HPLC檢測多巴胺，制備1mm厚的腦冠狀切片(距前囪A/P+2.5mm～-1.5mm；共4片)，從中線分離，在包含10％FBS的α-MEM中分別培養每一面。24小時后，收集培養基然后通過SRL Communication and Health，Tokyo，Japan對其進行HPLC分析。所有動物試驗均由東京大學醫學研究生院的動物照管和實驗委員會(the Animal Care and ExperimentationCommittee of Kyoto University Graduate School of Medicine)批準。
統計分析將數據表示為均數±SEM。通過用Bonferroni方法進行配對比較的ANOVA比較數據。P值＜0.05是顯著性的，而＜0.01是高度顯著性的。
實施例6MSC的鑒定將大鼠和人MSC用于下面的試驗中。采用前述方法分離大鼠MSC(Wistar)并培養[4]。人MSC獲自健康供體或購自商業來源(BioWhittaker)。
采用熒光活化的細胞分選術(FACS)評測大鼠MSC和人MSC上的細胞表面標記物。MSC表達CD29(β1-整聯蛋白)、CD90(Thy-1)和CD54(ICAM-1)，而不表達CD34(造血干細胞標記物)，CD11b/c(巨噬細胞-相關性標記物)或血管性血友病因子(人內皮細胞標記物，數據未顯示)(圖.14a)。該數據與在先報道相符[3，11]。通過免疫細胞化學檢測可以獲得相似的結果(圖.14b-f)。根據Pittenger等(1999)[3]所述的方法證實來自大鼠和人MSC二者的脂肪性、軟骨形成性和成骨性分化。這提示該細胞是間充質細胞來源(數據未顯示)。
實施例7NICD轉染對MSC的效果將NICD轉染至MSC中，因為在Notch蛋白的細胞內結構域中發現Notch信號傳導活性且除去細胞外結構域能得到Notch的組成型活性形式[16]。NICD包括編碼小鼠Notch的細胞外小結構域部分，跨膜區和整個細胞內結構域[17]的序列，并由the Nara Institute of Scienceand Technology的Dr.Kawaichi提供。將該片段亞克隆至pCI-neo(包含CMV啟動子的哺乳動物表達載體)，然后通過脂轉染法和隨后的G418選擇將其轉染至MSC中。
由于檢測到Notch細胞外和細胞內結構域，因此未處理的MSC表達少量內源性Notch。然而，NICD-轉染的MSC僅主要表達NICD，而未檢測到細胞外結構域的(圖.15a)。
在神經干細胞(NSC)和放射狀膠質中存在谷氨酸轉運體GLAST和3-磷酸甘油脫氫酶(3PGDH)[18，19]。其被認為與干細胞直系相關，在胚胎發生時可作為神經元的來源[20]。成年小鼠海馬的齒狀回中的溴脫氧尿苷(Brd-U)-陽性的NSC幾乎總是3PGDH免疫陽性的[19]。在NICD轉染后，大鼠MSC上調這些分子以及已知為NSC和神經祖細胞(NPC)標記物的巢蛋白二者的轉錄和表達[21]。未處理的MSC差不多沒有表現出GLAST或3PGDH的表達，但非常少部分的細胞是巢蛋白陽性的(0.74±0.1％)。然而，在NICD轉染后，這些細胞上調GLAST，3PGDH和巢蛋白(4.92±1.0％，p＜0.01)(圖.15b-g)。在熒光酶啟動子檢測中，NICD轉染后大鼠MSC中5’-側翼全長(核苷酸-3742～-1)和5’-側翼M1965(-1792～-1)3PGDH活性(二者均報道在放射狀膠質和神經上皮干細胞中具有活性[19])顯著增加(p＜0.01)(圖.15h)。(啟動子由Dr.S.Furuya，Brain ScienceInstitute，RIKEN提供)。
在脊椎動物中，NSC和神經嵴干細胞通過神經分化抑制而形成神經膠質[13，14，16]。本發明人已經證實了將NICD插入大鼠NSC中能生成GFAP-陽性的星形膠質細胞，但在NICD-轉染的MSC發現了非常少的GFAP-陽性細胞(數據未顯示)。另一方面，已經報道了將激活的Notch1導入小鼠前腦能在胚胎發生期間促進放射狀膠質[15]同一性。由于MSC在導入NICD后表達NSC和NPC相關標記物，故可以合理地推斷NICD轉染使MSC將其表型變為類似于NSC和/或NPC。
NICD-轉染的MSC中的神經誘導本發明人研究了從NICD-轉染的MSC選擇性生成神經細胞所需的條件。因此我們檢測了已知作用于神經發生的多種因子[22](神經營養因子、白血病抑制因子、bFGF和CNTF)和毛喉素。我們發現神經細胞的特定誘導最有效的條件是同時導入FSK、bFGF和CNTF。(下文中指“營養因子導入”)。
在NICD轉染至大鼠MSC后，將細胞培養至60～70％匯合并導入三種營養因子(FSK+pFGF+CNTF)，5日后96.5±0.6％的細胞為MAP-2ab陽性(圖.16，圖.17a～d)。本發明人發現單用bFGF時MAP-2ab-陽性率為73.2±5.1％而再加入FSK和CNTF時為87.5±3.1％和83.6±3.4％。該差異不具有顯著性(p＞0.05)(圖.16)。FSK和CNTF分別單獨產生的陽性率為29.2±5.4和4.3±1.9％(p＜0.01)而同時產生的陽性率為11.4±2.4％(圖.16)。
營養因子對MAP-2ab細胞的誘導最有可能是通過抑制MSC向神經膠質和其它細胞分化而導致的，而不是通過特異性殺死非-神經細胞，因為在營養因子誘導后通過TOTO-3核染色幾乎沒有觀測到死亡細胞(數據未顯示)。
營養因子自身的誘導，或在插入沒有NICD的pCI-neo對照載體后，導致無可識別的神經表型(圖.16)。因此，NICD轉染可能對MSC神經誘導非常重要。
MSC神經細胞的表征來自前述大鼠和人MSC的神經細胞顯示了明確的神經元形態學特征，所述特征包括具有豐富膨體的神經突樣突起，和表達典型神經標記物如神經絲-M，β3-微管蛋白和Tuj1(圖.17a-g)。巢蛋白-陽性細胞雖然很少，但仍能識別(2.03±0.7％)(數據未顯示)。誘導的神經細胞在用胰蛋白酶處理后傳代培養時不能增殖。營養因子誘導后5日，Brd-U的摻入研究顯示了MAP-2ab陽性細胞的最小標記(圖.17h)，這提示這些神經細胞不進行有絲分裂。
在未處理的MSC中通過蛋白印跡未檢測到MAP-2ab，而在營養因子誘導后則可檢測到(圖.171(1))。
延遲整流鉀電流隨發育而增高與細胞興奮性和神經分化的成熟相關[23]。本發明人通過采用電位鉗法在誘導的神經細胞研究了該特性。在來自大鼠和人類的誘導的MSC中通過正電壓步驟引發外向整流K+電流。該電流幅度顯著性高于未處理的MSC中的電流(圖.17m-q)。本發明人還研究了緊接全細胞構型形成后，在電流鉗條件下的靜息膜電位。神經細胞中的靜息膜電位比未處理的MSC中的低(分別是-50～-60mV和-30～-40mV)。這些在MSC誘導的神經生理學特性與成熟神經元中的類似。
在對神經膠質細胞的檢測中，本發明人實施了免疫細胞化學，其中采用GFAP作為星形膠質細胞的標記物，半乳糖腦苷脂(GalC)和O4作為少突膠質細胞的標記物。大鼠或人MSC的營養因子誘導后未發現標記物-陽性神經膠質細胞(圖.17i-k)。該現象由蛋白印跡得到證實(圖.17l(2))。為進一步證實神經誘導的特異性，本發明人檢測了NeuroD和GFAP的啟動子活性。在未處理的大鼠MSC中，NeuroD和GFAP的比率分別為67.2±15.3和5.16±1.36。然而，營養因子誘導后，NeuroD活性顯著性增至132.7±20.9而GFAP降至0.63±0.22(圖.18)。這些結果顯示了在營養因子誘導后僅從NICD-轉染的MSC特異性誘導了神經細胞。
TH-陽性細胞的生成神經功能與細胞類型特異性神經遞質密切相關。因此，本發明人在營養因子誘導后進行神經遞質和相關蛋白的免疫細胞化學檢測(圖.19a)。已知，GDNF與中腦多巴胺能神經元的發生和發展有關[36]。本發明人還檢測了GDNF的施用是否誘導神經MSC增加其酪氨酸羥化酶(TH)-陽性細胞的比率。該比率從營養因子單獨誘導后的3.9±0.6％增至施用GDNF后的41.0±14.1％(圖.19a-c)。GDNF還誘導Nurr-1的表達，Nurr-1是在中腦前體分化為多巴胺能神經元中發揮作用的轉錄因子[37](圖.19d)。蛋白印跡進一步證實了這些結果(圖.19e)。
將神經細胞移植至帕金森氏病模型大鼠為了研究來自MSC的神經細胞的體內存活能力和功能，將大鼠和人類細胞植入帕金森氏病模型大鼠紋狀體。在中前腦束中單側施用6-OHDA選擇性破壞了黑質中的多巴胺能神經元，由此提供帕金森氏病的有用模型。植入用綠色熒光蛋白(GFP)[4]標記的三種類型的大鼠MSC1)未處理的(MSC組)，2)用營養因子誘導變成神經細胞后(N-MSC組)，和3)誘導后施用GDNF(G-MSC組)。動物接受在受損紋狀體同側植入1×105MSC。在細胞植入后，用10周的時間檢測阿樸嗎啡誘導的旋轉行為。MSC組顯示偏離受損側的旋轉，并一直持續，而N-MSC組顯示了隨時間輕微恢復。相反，G-MSC組顯示了旋轉行為的顯著性恢復(圖.19f)。移植的動物追蹤觀察16周，在腦中未發現腫瘤形成。
植入腦后10周實施組織化學檢測，包括免疫組織化學檢測。移植的紋狀體顯示了GFP-陽性細胞，而移植細胞為神經絲陽性的，并且在不多的情況中，顯示出用抗-GFAP或抗-O4抗體標記。很多移植細胞還是TH和多巴胺轉運體(DAT)陽性的(圖.19g-k)。GFP-標記的MSC中GFAP-陽性細胞的百分數為2.5±1.4％，而TH-和DAT-陽性細胞的百分數分別為45.7±4.2％和30.7±0.9％。在G-MSC組的連續切片中，發現移植細胞移入并在宿主紋狀體中延伸(圖.19l)。在紋狀體中細胞計數大約為3.4×104(34％)。
將人GDNF-處理的神經MSC同樣植入6-OHDA-受損大鼠的紋狀體。每日用FK 506對動物實施免疫抑制，在4周記錄旋轉行為。移植導致旋轉行為的顯著改善(平均旋轉指數，術后/前，為0.44±0.2)(圖.19m)。采用高效液相色譜法(HPLC)檢測移植腦切片的培養基中多巴胺濃度從而評測植入的人MSC合成和釋放多巴胺的能力。從中線將腦切片，分為植入側和完整側，然后分開培養。檢測每側的培養基中多巴胺濃度并計算受損與完整側的比率。偽操作(sham-operated)的大鼠顯示比率為0.57±0.01(n＝3)而移植動物的比率為0.67±0.04(n＝3)。這與移植的多巴胺釋放的增加(p＝0.04)一致。這些結果提示了從人MSC誘導的細胞能夠在受損的大鼠紋狀體中合成和釋放多巴胺。
參考文獻1.Bishop，A.E.，Buttery，L.D.&Polak，J.M.Embryonic stemcells(Review).J.Pathol. 197，424-429(2002).
2.Weissman，I.L. Stem cellsunits of development，units ofregeneration，and units in evolution(Review).Cell 100，157-168(2000).
3.Pittenger，M.F.等Multilineage potential of adult humanmesenchymal stem cells.Science 284，143-147(1999).
4.Dezawa，M.等Sciatic nerve regeneration in rats inducedby transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromalcells.Eur.J.Neurosci.14，1771-1776(2001).
5.Jiang，Y.等Pluripotency of mesenchymal stem cellsderived from adult marrow.Nature 418，41-49(2002).
6.Eglitis，M.A.，Dawson，D.，Park，K.W.&Mouradian，M.M.Targeting of marrow-derived astrocytes to the ischemic brain.Neuroreport 10，1289-1292(1999).
7.Kopen，G.C.，Prockop，D.J.&Phinney，D.G. Marrow stromalcells migrate throughout forebrain and cerebellum，and theydifferentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 96，10711-10716(1999).
8.Terada，N.等Bone marrow cells adopt the phenotype ofother cells by spontaneous cell fusion.Nature 416，542-545(2002).
9.Wagers，A.J.，Sherwood，R.I.，Christensen，J.L.&Weissman，I.L.Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoieticstem cells.Science 297，2256-2259(2002).
10.Woodbury，D.，Schwarz，E.J.，Prockop，D.J.&Black，I.B.Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate intoneurons.J.Neurosci.Res.61，364-370(2000).
11.Kohyama，J.等Brain from boneefficient“meta-differentiation”of marrow stroma-derived mature osteoblaststo neurons with Noggin or a demethylating agent.Differentiation 68，235-244(2001).
12.Sanchez-Ramos，JR.Neural cells derived from adult bonemarrow and umbilical cord blood.J.Neurosci.Res.69，880-893(2002).
13.Lundkvist，J.&Lendahl，U.Notch and the birth of glial cells(Review).Trends Neurosci.24，492-494(2001).
14.Morrison，S.J.等Transient Notch activation initiates anirreversible switch from neurogenesis to gliorenesis by neural creststem cells.Cell 101，499-510(2000).
15.Gaiano，N.，Nye，J.S.&Fishell，G. Radial glial identity ispromoted by Notch1 signaling in the murine forebrain.Neuron 26，395-404(2000).
16.Nye，J.S.，Kopan，R.&Axel，R.an activated Notch suppressesneurogenesis and myogenesis but not gliogenesis in mammalian cells.Development l20，2421-2430(1994).
17.Yamamoto，N.等Role of Deltex-1 as a transcriptionalregulator downstream of the Notch receptor.J.Biol.Chem. 276，45031-45040(2001).
18.Shibata，T.等Glutamate transporter GLAST is expressedin the Radial glial-astrocyte lineage of developing mouse spinal cord.J.Neurosci.17，9212-9219(1997).
19.Yamasaki，M.等3-Phosphoglycerate dehydrogenase，a keyenzyme for 1-serine biosynthesis，is preferentially expressed in theRadial glial/astrocyte lineage and olfactory ensheathing glia in themouse brain.J.Neurosci.21，7691-7704(2001).
20.Gregg，C.T.，Chojnacki，A.K.&Weiss，S.Radial glial cells asneural precursorsthe next generation？J.Neurosci.Res.69，708-713(2002).
21.Roy，N.S.等In vitro neurogenesis by progenitor cellsisolated from the adult human hippocampus.Nat.Med.6，271-277(2000).
22.Ip，N.Y.The neurotrophins and neuropoietic cytokinestwofamilies of growth factors acting on neural and hematopoietic cells(Review).Ann.N.Y.Acad.Sci.840，97-106(1998).
23.Grosse，G.等Expression of Kv1 potassium channels inmouse hippocampal primary culturesdevelopment andactivity-dependent regulation.J.Neurosci.20，1869-1882(2000).
24.Morrison，S.J.Neural differentiationproneural genesinhibit gliogenesis(Review).Curr.Biol.11，R349-351(2001).
25.Sun，Y.等Neurogenin promotes neurogenesis and inhibitsglial differentiation by independent mechanisms.Cell 104，365-376(2001).
26.Ishibashi，M.等Persistent expression of helix-loop-helixfactor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in thecentral nervous system.EMBO J.13，1799-1805(1994).
27.Furukawa，T.等rax，Hes1，and notch1 promote theformation of Muller glia by postnatal retinal progenitor cells.Neuron26，383-394(2000).
28.Seidel，H.M.，Lamb，P.&Rosen，J. Pharmaceuticalintervention in the JAK/Stat signaling pathway(Review).Oncogene19，2645-2656(2000).
29.Burdon，T.，smith，A.&Savatier，P.Signalling，cell cycle andpluripotency in embryonic stem cells.Trends Cell Biol.12，432-438(2002).
30.Nakashima，K.等BMP2-mediated alteration in thedevelopmental pathway of fetal mouse brain cells from neurogenesisto astrocytogenesis.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98，5868-5873(2001).
31.Stork，P.J.&Schmitt，J.M.Crosstalk between cAMP andMAP kinase signaling in the regulation of cell proliferation.TrendsCell Biol.12，258-266(2002).
32.Neufeld，B.等Serine/Threonine kinases 3pK andMAPK-activated protein kinase 2 interact with the basichelix-loop-helix transcription factor E47 and repress itstranscriptional activity.J.Biol.Chem 275，20239-20242(2000).
33.Shimazaki，T.，Shingo，T.&Weiss，S.The ciliary neurotrophicfactor/leukemia inhibitory factor/gp 130 receptor complex operates inthe maintenance of mammalian forebrain neural stem cells. J.Neurosci.21，7642-7653(2001).
34.Kurooka，H.，Kuroda，K.&Honjo，T.Roles of the ankyrinrepeats and C-terminal region of the mouse notch1 intracellularregion.Nucleic Acids Res.26，5448-5455(1998).
35.Franklin，J.L.等Autonomous and non-autonomousregulation of mammalian neurite development by Notch1 and Deltal.Curr.Biol.9，1448-1457(1999).
36.Akerud，P.等Differential effects of glial cell line-derivedneurotrophic factor and neurturin on developing and adult substantianigra dopaminergic neurons.J.Neurochem.73，70-78(1999).
37.Sakurada，K.，Ohshima-Sakurada，M.，Palmer，T.D.&Gage，F.H.Nurr1，an orphan nuclear receptor，is a transcriptional activatorof endogenous tyrosine hydroxylase in neural progenitor cells derivedfrom the adult brain.Development 126，4017-4026(1999).
38.Kim，J.H.等Dopamine neurons derived from embryonicstem cells function in an animal model of Parkinson’s disease.Nature418，50-56(2002).
39.Weinmaster，G.，Roberts，V.J.&Lemke，G. A homolog ofDrosophila Notch expressed during mammalian development.Development 113，199-205(1991).
40.Peyton，M.等BETA3，a novel helix-loop-helix protein，canact as a negative regulator of BETA2 and MyoD-responsive genes.Mol.Cell Biol.16，626-33(1996).
41.Rozovsky，I.等Estradiol(E2)enhances neurite outgrowthby repressing glial fibrillary acidic protein expression andreorganizing laminin.Endocrinology 143，636-646(2002).
42.Seta，Y.，Toyono，T.，Takeda，S.&Toyoshima，K.Expressionof Mash1 in basal cells of rat circumvallate taste buds is dependentupon gustatory innervation.FEBS Lett.444，43-46(1999)43.Schwaiger，F.W.等Peripheral but not central axotomyinduces changes in Janus kinases(JAK)and signal transducers andactivators of transcription(STAT).Eur.J.Neurosci.12，1165-1176(2000).
44.Kawasaki，H.等Induction of midbrain dopaminergicneurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity.Neuron 28，31-40(2000).
45.Tanaka，H.等Role of serotonergic neurons inL-DOPA-derived extracellular dopamine in the striatum of6-OHDA-lesioned rats.Neuroreport 10，631-634(1999).
權利要求
1.一種將骨髓基質細胞(BMSC)體外誘導分化為神經細胞或骨骼肌細胞的方法，包括將Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因導入所述BMSC，其中所得分化細胞是導入了Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因的BMSC的子代。
2.一種將BMSC體外誘導分化為神經前體細胞的方法，包括如下步驟(1)從骨髓分離BMSC，和在添加了血清的標準基本培養基中培養所述細胞；和(2)將Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因導入所述細胞，和進一步培養所述細胞以生成神經前體細胞。
3.根據權利要求2的方法，其中所述分離的BMSC源自人類。
4.用根據權利要求2或3的方法制備的神經前體細胞。
5.表達神經前體細胞標記物GLAST，3PGDH和巢蛋白的神經前體細胞。
6.一種將BMSC體外誘導分化為神經細胞的方法，包括如下步驟(1)從骨髓分離BMSC，和在添加了血清的標準基本培養基中培養所述細胞；(2)將Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因導入所述細胞，和進一步培養所述細胞，和(3)在所述培養基中加入環腺苷酸(cAMP)-增多劑或cAMP類似物，和/或細胞分化刺激因子，和進一步培養所述細胞以生成所述神經細胞，其中所得分化細胞是導入了Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因的BMSC的子代。
7.根據權利要求6的方法，其中所述標準基本培養基是伊格爾氏α改良的最低必需培養基。
8.根據權利要求6的方法，其中所述血清是胎牛血清。
9.根據權利要求6的方法，其中所述導入所述Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因通過使用能在哺乳動物表達的載體的脂轉染法實施。
10.根據權利要求6的方法，還包括，在步驟(2)和(3)間，在一個預定的時期選擇已經導入了基因的細胞的步驟。
11.根據權利要求6的方法，其中所述cAMP-增多劑或cAMP類似物是毛喉素。
12.根據權利要求6的方法，其中所述cAMP-增多劑或環cAMP類似物濃度是0.001nM～100μM。
13.根據權利要求6的方法，其中所述細胞分化刺激因子選自堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、睫狀神經營養因子(CNTF)及其混合物。
14.根據權利要求6的方法，其中所述細胞分化刺激因子的濃度是0.001ng/ml～100μg/ml。
15.根據權利要求6～14任一項的方法，其中所述分離的BMSC源自人類。
16.用根據權利要求6～14任一項的方法制備的神經細胞。
17.用根據權利要求15的方法制備的神經細胞。
18.表達神經細胞標記物β-微管蛋白同種型3和TuJ-1的神經細胞。
19.一種將BMSC體外誘導分化為多巴胺能神經元的方法，包括如下步驟(1)從骨髓分離BMSC，和在添加了血清的標準基本培養基中培養所述細胞；(2)將Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因導入所述細胞，和進一步培養所述細胞，(3)在所述培養基中加入環腺苷酸(cAMP)增多劑或cAMP類似物，和/或細胞分化刺激因子，和進一步培養所述細胞以生成所述神經細胞；(4)在添加了血清的標準基本培養基中培養步驟(3)中得到的神經細胞；和(5)在所述培養基中加入神經膠質源性神經營養因子(GDNF)，和cAMP增多劑或cAMP類似物，和/或除所述GDNF外的細胞分化刺激因子，和進一步培養所述細胞以獲得所述多巴胺能神經元，其中所得多巴胺能神經元是導入了所述Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因的BMSC的子代。
20.根據權利要求19的方法，其中步驟(4)中的所述標準基本培養基是伊格爾氏α改良的最低必需培養基。
21.根據權利要求19的方法，其中步驟(4)中的所述血清是胎牛血清。
22.根據權利要求19的方法，其中步驟(5)中的所述cAMP增多劑或cAMP類似物是毛喉素。
23.根據權利要求19的方法，其中步驟(5)中的所述cAMP-增多劑或cAMP類似物的濃度是0.001nM～100μM。
24.根據權利要求19的方法，其中步驟(5)中除所述GDNF以外的所述細胞分化刺激因子選自堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血小板衍生生長因子-AA(PDGF-AA)及其混合物。
25.根據權利要求19的方法，其中步驟(5)中所述GDNF的濃度是0.001ng/ml～100μg/ml。
26.根據權利要求19的方法，其中步驟(5)中所述GDNF的濃度是1ng/ml～100ng/ml。
27.根據權利要求19的方法，其中步驟(5)中除GDNF以外的所述細胞分化刺激因子的濃度是0.001ng/ml～100μg/ml。
28.根據權利要求19～27任一項的方法，其中所述分離的BMSC源自人類。
29.用根據權利要求19～27任一項的方法制備的多巴胺能神經元。
30.用根據權利要求28的方法制備的多巴胺能神經元。
31.一種將BMSC體外誘導分化為乙酰膽堿能神經元的方法，包括如下步驟(1)從骨髓分離BMSC，和在添加了血清的標準基本培養基中培養所述細胞；(2)將Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因導入所述細胞，和進一步培養所述細胞；(3)在所述培養基中加入環腺苷酸(cAMP)-增多劑或cAMP類似物，和/或細胞分化刺激因子，和進一步培養所述細胞以生成所述神經細胞；(4)在添加了血清的標準基本培養基中培養步驟(3)中得到的神經細胞；和(5)在所述培養基中加入神經生長因子(NGF)和cAMP-增多劑或cAMP類似物和/或除NGF外的細胞分化刺激因子，和進一步培養所述細胞以獲得所述乙酰膽堿能神經元，其中所得乙酰膽堿能神經元是導入了所述Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因的BMSC的子代。
32.根據權利要求31的方法，其中步驟(4)中所述標準基本培養基是伊格爾氏α改良的最低必需培養基。
33.根據權利要求31的方法，其中步驟(4)中所述血清是胎牛血清。
34.根據權利要求31的方法，其中步驟(5)中所述cAMP-增多劑或cAMP類似物是毛喉素。
35.根據權利要求31的方法，其中步驟(5)中所述cAMP-增多劑或cAMP類似物的濃度是0.001nM～100μM。
36.根據權利要求31的方法，其中步驟(5)中所述除NGF以外的細胞分化刺激因子選自堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血小板衍生生長因子-AA(PDGF-AA)及其混合物。
37.根據權利要求31的方法，其中步驟(5)中所述NGF的濃度是0.001ng/ml～100μg/ml。
38.根據權利要求37的方法，其中步驟(5)中所述NGF的濃度為1ng/ml～100ng/ml。
39.根據權利要求31的方法，其中步驟(5)中所述除NGF以外的細胞分化刺激因子的濃度是0.001ng/ml～100μg/ml。
40.根據權利要求31～39任一項的方法，其中所述分離的BMSC源自人類。
41.用根據權利要求31～39任一項的方法制備的乙酰膽堿能神經元。
42.用根據權利要求40的方法制備的乙酰膽堿能神經元。
43.一種將BMSC體外誘導分化為骨骼肌細胞的方法，包括如下步驟(1)從骨髓分離BMSC，和在添加了血清的標準基本培養基中培養所述細胞；(2)在所述培養基中加入脫甲基劑，和進一步培養所述細胞；(3)在所述培養基中加入cAMP-增多劑或cAMP類似物，和/或細胞分化刺激因子，和進一步培養所述細胞；(4)將Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因導入所述細胞，和進一步培養所述細胞，和(5)將導入了所述基因的所述細胞與沒有導入所述基因的未處理的BMSC共培養；和(6)在所述培養基中加入cAMP-增多劑或cAMP類似物，和進一步培養所述細胞以獲得所述骨骼肌細胞，其中所得分化細胞是導入了所述Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因的BMSC的子代。
44.根據權利要求43的方法，其中所述標準基本培養基是伊格爾氏α改良的最低必需培養基。
45.根據權利要求43的方法，其中所述血清是胎牛血清。
46.根據權利要求43的方法，其中所述脫甲基劑是5-氮胞苷。
47.根據權利要求43的方法，其中所述5-氮胞苷的濃度為30nmol/l～300μmol/l。
48.根據權利要求43的方法，其中步驟(3)中所述cAMP-增多劑或cAMP類似物是毛喉素。
49.根據權利要求43的方法，其中步驟(3)中所述的cAMP-增多劑或cAMP類似物濃度是0.001nM～100μM。
50.根據權利要求43的方法，其中所述細胞分化刺激因子選自堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血小板衍生生長因子-AA(PDGF-AA)、Heregulin，及其混合物。
51.根據權利要求43的方法，其中所述細胞分化刺激因子的濃度是0.001ng/ml～100μg/ml。
52.根據權利要求43的方法，其中所述導入所述Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因通過使用能在哺乳動物中表達的載體的脂轉染法實施。
53.根據權利要求43的方法，其中還包括，在步驟(4)和(5)間，在一個預定的時期選擇已導入了所述基因的細胞的步驟。
54.根據權利要求43的方法，其中步驟(5)中所述cAMP-增多劑或cAMP類似物是毛喉素。
55.根據權利要求43的方法，其中步驟(5)中所述cAMP-增多劑或cAMP類似物的濃度是0.001nm～100μm。
56.根據權利要求43～55任一項的方法，其中所述分離的BMSC源自人類。
57.用根據權利要求43～55任一項的方法制備的骨骼肌細胞。
58.用根據權利要求56的方法制備的骨骼肌細胞。
59.一種治療患有涉及中樞神經系統的疾病、紊亂或病癥的患者的方法，所述方法包括將治療有效量的權利要求4中的神經前體細胞施用于發現有所述疾病、紊亂或病癥的患者的中樞神經系統區域，其中神經前體細胞的存在對所述疾病、紊亂或病癥具有治療效果。
60.治療有效量的權利要求4中的神經前體細胞在制備用于治療患有涉及中樞神經系統的疾病、紊亂或病癥的患者的藥物組合物中的用途。
61.治療有效量的權利要求5中的神經前體細胞在制備用于治療患有涉及中樞神經系統的疾病、紊亂或病癥的患者的藥物組合物中的用途。
62.一種治療患有涉及中樞神經系統的疾病、紊亂或病癥的患者的方法，所述方法包括將治療有效量的權利要求17中的神經細胞施用于發現患有涉及疾病、紊亂或病癥的患者的中樞神經系統區域，其中神經細胞的存在對所述疾病、紊亂或病癥具有治療效果。
63.治療有效量的權利要求17中的神經細胞在制備用于治療患有涉及中樞神經系統的疾病、紊亂或病癥的患者的藥物組合物中的用途。
64.一種治療患有涉及中樞神經系統的疾病、紊亂或病癥的患者的方法，所述方法包括將治療有效量的權利要求18中的神經細胞施用于發現有所述疾病、紊亂或病癥的患者的中樞神經系統區域，其中所述神經細胞的存在對所述疾病、紊亂或病癥具有治療效果。
65.治療有效量的權利要求18中的神經細胞在制備用于治療患有涉及中樞神經系統的疾病、紊亂或病癥的患者的藥物組合物中的用途。
66.一種治療患有涉及中樞神經系統疾病、紊亂或病癥的患者的方法，所述方法包括將治療有效量的權利要求30中的多巴胺能神經元施用于發現有所述疾病、紊亂或病癥的患者的中樞神經系統區域，其中所述神經細胞的存在對所述疾病、紊亂或病癥具有治療效果。
67.根據權利要求66中的方法，其中所述疾病、紊亂或病癥是帕金森氏病。
68.治療有效量的權利要求30中的多巴胺能神經元在制備用于治療患有涉及中樞神經系統的疾病、紊亂或病癥的患者的藥物組合物中的用途。
69.根據權利要求68中的用途，其中所述疾病、紊亂或病癥是帕金森氏病。
70.一種治療患有涉及中樞神經系統的疾病、紊亂或病癥的患者的方法，所述方法包括將治療有效量的權利要求42中的乙酰膽堿能神經元施用于發現有所述疾病、紊亂或病癥的患者的中樞神經系統區域，其中所述神經細胞的存在對所述疾病、紊亂或病癥具有治療效果。
71.根據權利要求70中的方法，其中所述疾病、紊亂或病癥選自肌萎縮性側索硬化癥(ALS)和阿耳茨海默氏病。
72.治療有效量的權利要求42中的乙酰膽堿能神經元在制備用于治療患有涉及中樞神經系統的疾病、紊亂或病癥的患者的藥物組合物中的用途。
73.根據權利要求72中的用途，其中所述疾病、紊亂或病癥選自肌萎縮性側索硬化癥(ALS)和阿耳茨海默氏病。
74.一種治療患有與肌肉退化相關的疾病、紊亂或病癥的患者的方法，所述方法包括將治療有效量的權利要求58中的骨骼肌細胞施用于患者的肌肉退化區域，其中所述骨骼肌細胞的存在對所述疾病、紊亂或病癥具有治療效果。
75.根據權利要求74中的方法，其中所述疾病、紊亂或病癥是肌肉萎縮癥。
76.治療有效量的權利要求58中的骨骼肌細胞在制備用于治療患有與肌肉退化相關的疾病、紊亂或病癥的患者的藥物組合物中的用途。
77.根據權利要求76中的用途，其中所述疾病、紊亂或病癥是肌肉萎縮癥。
全文摘要
本發明提供了一種通過導入Notch基因將骨髓間質細胞誘導/分化神經細胞和骨骼肌細胞的方法。即，本發明提供了一種通過導入Notch基因將骨髓間質細胞體外誘導分化為神經細胞或骨骼肌細胞的方法，所述方法包括將Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因導入所述細胞，其中所得分化/誘導的細胞是導入了Notch基因和/或Notch信號傳導相關基因的骨髓間質細胞的細胞分裂子代。本發明還提供了將分化/誘導的神經細胞進一步誘導/分化為多巴胺能神經元或乙酰膽堿能神經元。本發明還涉及用本發明的方法所獲得的神經前體細胞、神經細胞或骨骼肌細胞治療神經退化性疾病或肌退化性疾病的方法。
文檔編號C12N5/077GK1639335SQ0380559
公開日2005年7月13日 申請日期2003年2月6日 優先權日2002年2月6日
發明者出澤真理, 澤田元, 菅野洋, 高野雅彥 申請人:桑比歐公司