專利名稱：原核dna的富集方法
技術領域：
本發明涉及一種富集原核DNA的方法，以及用于實施所述方法的試劑盒。
由細菌引起的感染是炎性疾病的最常見起因之一。對于臨床病程的預后，以及尤其是對于合適治療措施的及時選擇，細菌病原體的早期檢測具有決定性的重要性。
在細菌病原體的檢測中，首要利用的是不同的細胞培養方法。然而，基于病原體特異性核酸檢測的分子生物學方法近來也變得更為重要。這些方法除了高特異性外，勝于常規方法的基本優點必須提及的是其所需的時間極少。然而迄今為止，與微生物培養相比較，直接來自體液或來自未經預處理的試驗材料的原核DNA的檢測靈敏度太低。如果存在的話，16S-mRNA分子區域可以達到直接足以從未經預處理的試驗材料中檢測病原體的細菌核酸量。然而，這就需要待檢測細菌處于代謝階段并且表達足量的16S-mRNA。
然而通常并不是這樣的情形，尤其是經受抗生素治療的患者。此外，細菌的某些致病性因子并不是每時都表達，雖然相應的基因存在于細菌基因組中。因而，染色體水平檢測致病性因子和細菌耐受性對于膿毒性病狀的診斷是必需的。
還可應用的范圍更廣，因為在此水平上，可以進行致病性和共生細菌之間的區分。
最常見地，通過聚合酶鏈反應(PCR)或連接酶鏈反應(LCR)進行原核DNA的擴增，可實現病原體特異性核酸的檢測。由對干擾的敏感性或通過臨床樣品的強抑制因子，可對照出結果的高特異性和快速可得性。
在常規PCR檢測方法中，血液中病原體的的成功檢測需要從至少1-5ml血液中分離出總DNA。然而，因總DNA濃度太高而不能直接用于PCR反應。
對于用于膿毒性病原體檢測的血液培養物，情況則有所不同。在此情況下，較低的檢測極限是每毫升低于10個細菌。目前這種檢測極限只能通過PCR方法達到，所述PCR的靶序列位于16S-RNA區域中，因而依賴于所述靶序列的表達。對于靶序列位于微生物染色體內的PCR方法，預計可有更高的診斷可靠性。不同基因的表達行為可受到相當的改變或限制，尤其是在進行中的抗生素治療的影響下，即使所使用的抗生素最終并無影響。這種情況通常特別地發現于加強治療病房中，其中大部分病人接受抗生素治療，鑒于此因因而從血液培養物或其他樣品不能生長出任何的相關細菌。
由于靈敏度不夠，只在試驗材料中具有足夠高的細菌數量時不采用擴增步驟而通過原核DNA的直接檢測的病原體特異性核酸的檢測(探針技術、FISH技術)才具有診斷意義。
用于鑒定體液中細菌病原體的原核DNA檢測的基本問題，除試驗材料中PCR-抑制成分外，主要在于真核DNA超過原核DNA。在這一點上，DNA分析中的競爭性過程以及原核DNA的低含量可認為是對病原體的定性和定量檢測的妨礙。
DNA分離的常用方法可富集體液的總DNA，使得宿主DNA與微生物DNA的比例處于1∶10-6到1∶10-8之間。這一差別使得檢測體液中微生物DNA的困難相當清晰。
因而，本發明的一個目的是提供一種從來自于感染患者的帶有高含量真核DNA的試驗樣品中分離和/或富集微生物DNA的方法，用于病原體的快速和簡易檢測，所述檢測能夠早期診斷出由細菌病原體引起的感染。
根據本發明，該目的通過富集原核DNA的方法實現，所述方法包含如下步驟a)將溶液中的至少一種原核DNA與能夠特異性結合原核DNA的至少一種蛋白質或多肽接觸，由此形成蛋白質或多肽DNA復合物，以及b)分離所述復合物。
在此情況下，術語原核DNA同時涉及病毒和細菌DNA。所述DNA可被純化并再次溶解，或可直接存在于初始來源(例如體液，如血液、血清等)中。
通過本領域人員熟知的分離或富集DNA蛋白復合物或DNA多肽復合物的不同方法手段，可實現分離。在這種情況下，優選采用將DNA結合蛋白固定于載體基質上的方法，從而從樣品溶液中富集DNA。
根據優選實施方案，分離之后進行分離DNA和蛋白質/多肽的步驟。這可通過諸如本領域人員已知的常規DNA純化的常規方法而實現。在最簡單情況下，分離是基于基質/緩沖液的pH值或鹽濃度的改變，或者基于離液試劑的加入，等等；即導致蛋白質-DNA復合物分離的合適參數。此類方法為本領域人員所已知。
根據進一步優選實施方案，蛋白質或多肽被偶聯至載體上。該實施方案代表了富集原核DNA的一個尤其簡單的方式，因為從溶液中分離是特別簡單的，例如從溶液中物理去除帶電載體(例如通過離心作用)。
作為原核DNA的溶液，任何合適的溶劑都基本上是合適的。然而，該方法對于從含有不同生物分子種類，尤其是不同DNA種類的溶液中富集原核DNA是特別有用的。本發明優選地涉及一種從原核或病毒DNA的混合物中分離和富集原核或病毒DNA和真核DNA的方法。在這種情況下，例如存在于體液中的原核DNA通過特異性結合至蛋白質或多肽而與真核DNA分離，并被富集。在分子生物學方法的幫助下，以此方式富集的原核DNA促進了原核病原體的檢測，并且可有助于由致病病原體引起的疾病的診斷。
尤其是，DNA結合蛋白或多肽固定于載體表面的實施方案適合于來自于體液，優選為血液的原核DNA的吸附。此外，該方法可以使存在于血液或其他體液中的微生物DNA從所述體液中除去。然后以此方式從中純化微生物DNA的體液(例如全血，血清或液劑)可輸回體內，所述微生物DNA自身也能引起患者體內嚴重的炎癥反應。
本發明意義上的體液可理解為源自包括人體的哺乳動物肌體的所有液體，其中可存在疾病病原體，諸如血液，脲，液劑，胸膜，心包，腹膜以及滑膜液體。涉及人體血液的本發明描述不應解釋為對發明的限制，而僅僅是作為示例性應用。
本發明意義上的蛋白質或多肽可理解為能夠特異性結合原核DNA的所有真核和原核蛋白質。能夠特異性結合非甲基化CpG-基元的蛋白質或多肽尤其適合于該目的。
細菌病原體優選地理解為膿毒病病原體，但也可以是感染的任何其他細菌病原體。它們可不同于共生病原體，所述共生病原體有時候也發現于來自患者的試驗樣品中，但不會有任何的致病意義。
在從感染體液分離總DNA中，宿主DNA與病原體DNA的比率在很多情況下可以是1∶10-6至1∶10-8或更低。通過原核DNA對帶有此類選擇性屬性的蛋白質或多肽的特異性結合，本發明的方法可實現3個指數單位或更多的富集。
蛋白質或多肽可直接或間接偶聯至載體。偶聯的類型依賴于載體和載體材料。合適的載體尤其包括膜、微粒和樹脂，或者用于親和基質的類似材料。用于蛋白質或多肽結合以及用于實施此類結合(依賴于材料類型)的合適材料，是本領域人員所熟知的。對于間接偶聯而言，例如針對蛋白質或者多肽的這種特異性抗體是合適的，所述抗體通過已知方法依次結合至載體。
本發明方法的一個應用包括原核DNA的富集。進一步應用包括，通過將原核DNA結合至已固定至基質的特異性蛋白或多肽，從而從真核和原核DNA的混合物中分離出原核DNA。通過合適的方法手段，將肌體自身DNA和原核DNA的混合物與親和基質接觸，在這種情況下原核DNA結合至固定的蛋白質；原核DNA穿過例如分離柱，可被單獨收集。親和基質可以是，例如聚多糖，如瓊脂糖，其他生物聚合物，合成聚合物，或帶有硅酸鹽主鏈的載體，如多孔玻璃或其他固態或柔性載體，其上固定有DNA結合蛋白或多肽。原核DNA與真核DNA的分離后，用合適的試劑洗滌親和基質，從而使帶有偶聯的原核DNA的結合蛋白與基質分離出來，和/或將原核DNA與結合蛋白分離，并可以充分量進行進一步的加工步驟。
本發明方法的進一步應用包括通過將原核DNA結合至固定于微粒上的特異性蛋白質，從而使原核DNA與真核DNA分離并進行富集。在這點上，可使DNA結合蛋白或多肽被固定的所有微粒均合適。此類微粒可包括膠乳、塑料(例如，苯乙烯泡沫、聚合物)、金屬或鐵磁性物質。此外，也可利用熒光微粒，諸如可購自Luminex Company的產品。原核DNA結合至固定于微粒上的蛋白質之后，通過合適方法將所述微粒從物質混合物分離出，所述方法例如為過濾、離心、沉淀、通過檢測熒光強度的分類、或者通過磁性方法。原核DNA從微粒分離后，即可用于進一步處理。
本發明方法的另一應用包括通過將原核DNA結合至特異性蛋白或多肽，將原核DNA與真核DNA分離并富集，然后通過電泳與混合物的其他成分分離。
本發明方法的另一應用包括通過將原核DNA結合至蛋白質或多肽將原核DNA與真核DNA分離并富集。所述蛋白質隨后結合至相應的抗體。該抗體可結合至固體或柔性基質，諸如玻璃、塑料、硅、微粒、膜，或可存在于溶液中。原核DNA結合至蛋白質或多肽，且后者結合至特異性抗體后，通過本領域人員已知方法可實現從物質混合物的分離。
作為蛋白質或多肽，任何例如結合帶有非甲基化CpG基元的原核DNA的蛋白質或多肽均尤其適合。為此目的，例如針對原核DNA的特異性抗體或抗血清均是適合的。其制備和分離均為本領域人員已知的。
例如因為非甲基化CpG基元的存在，原核DNA不同于真核DNA。由此，蛋白質/多肽可以方便地特異性識別并結合非甲基化CpG基元。方便起見，這也包括特異性抗體或對應的抗血清。根據進一步優選實施方案，該蛋白質或多肽是由TLR9基因或CGBP基因編碼的蛋白質或多肽。
本發明的此實施方案是基于如下發現原核DNA和真核DNA的區別在于CpG基元的含量不同。在原核DNA中，胞嘧啶-鳥苷-二核苷酸(CpG基元)存在量超過真核DNA的20倍。在原核DNA中，這些基元是非甲基化的，而在真核DNA中則大部分是甲基化的，這就進一步增加了其差異。非甲基化CpG基元是原核基因組或其片段內的非甲基化脫氧胞苷酸-脫氧鳥苷酸-二核苷酸。
其次，本發明的該優選實施方案是基于如下發現存在有特異性結合至DNA的非甲基化CpG基元的蛋白質或多肽。根據本發明，一方面利用這些蛋白質/多肽的結合屬性用以從主要含真核DNA的樣品中結合原核DNA，另一方面使原核DNA富集。
利用真核DNA中存在甲基化CpG基元而分離cDNA的一個應用描述于Cross等的，Nature Genetics6(1994)236-244中。帶有相應CpG基元的單鏈寡脫氧核糖核苷酸(ODN)的免疫刺激應用已出現數次(Hcker等，Immunology 105(2002)245-251，US 6,239,116)。作為原核CpG基元的識別分子，目前已鑒定出兩個受體蛋白。Toll樣受體9已知在WO02/06482中作為一種識別非甲基化CpG基元的分子。Voo等人的，Molecular and Cellular Biology(2000)2108-2121描述了其它受體蛋白，即人CpG結合蛋白(hCGBP)，所述蛋白用于分析方法中，作為識別分子用于檢測原核DNA中的非甲基化基元。在上述兩個出版物中，CpG結合蛋白均沒有用于分離或富集原核DNA。
由序列與基因文庫登錄號NM-014593(Version NM-014593 1，GI7656794；NCBI數據庫)的序列具有至少80％，優選至少90％，尤其是優選至少95％同源性的cDNA編碼的蛋白質或多肽為特別適合。這些是與CGBP對應或者由其衍生，并特異性識別并結合CpG基元的蛋白質或多肽。
根據進一步優選的實施方案，所述蛋白質或多肽由序列與基因文庫登錄號AB 045180(TLR9的編碼序列；NCBI數據庫，versionAB045180.1；GI11761320)或其片段的序列具有至少80％，優選至少90％同源性的cDNA編碼，優選為與轉錄變體A(基因文庫訪問號.NM-138688；version NM-017442.1；GI20302169；NCBI數據庫)或轉錄變體B(基因文庫訪問號.NM-017442；version NM-138688.1；GI20302170；NCBI數據庫)具有至少80％，尤其優選90％同源性的cDNA。
此外，本發明涉及一種純化體液用以除去原核DNA的方法。在這點上，便利地是在無菌條件下于體外實現分離，從而可使體液再次輸回體內，從而通過除去所述體液中含有的原核DNA，可輔助軀體的自身免疫系統消除感染。
任何合適的化學、機械或電化學過程均可考慮用于從體液中體外去除原核DNA。此外，與諸如血液灌流、心肺機或內毒素吸收器的其他體外治療方法的結合，代表了進一步的便利應用。這種列舉并不代表對本發明的限制。
根據特別優選的實施方案，本發明涉及一種檢測原核DNA的方法。在此情況下，原核DNA富集之后是擴增所述原核DNA的步驟，用于該目的的所有通用擴增方法均適合(PCR，LCR；LM-PCR等)。
此外，本發明涉及一種通過上述方法之一富集原核DNA的試劑盒，所述試劑盒至少含有蛋白質/多肽，優選含有適合實施所述方法的其他試劑。
根據優選實施方案，所述試劑盒除含蛋白質/多肽外，還含有至少一組引物，所述引物適合于在標準條件下擴增某些原核生物的基因組DNA。
本發明具有的優點為，通過將富含CpG基元的非甲基化原核DNA特異性結合至對該結構具有特異性親和性的蛋白質，源自感染宿主總DNA的原核DNA成功地得以濃縮，由此，體液中病原體DNA的檢測靈敏度大大增強。
采用特異性結合蛋白將原核DNA與真核DNA分離的可能性，較之分離總DNA的已知方法不再耗時。然而，隨后的檢測只能經由PCR反應實現。在大多數情況下不需要嵌套PCR，從而使得診斷中可節省相當量的時間。
下面通過實施例對本發明進行更詳細的解釋，但并沒有限制其范圍。


圖1顯示了人血液中鏈球菌DNA的PCR結果，以及圖2顯示了根據圖1的PCR產物進行的嵌套PCR結果。
實施例1檢測的現有技術方法將含有103/ml集落形成單位的病原體的化膿性鏈球菌的新鮮肝素化人體血液用于病原體的檢測。采用用于從體液分離總DNA的市售試劑盒，根據廠商的修正說明書，使DNA通過吸附至DNA結合基質而得到分離。為此目的，將含有蛋白酶K和SDS的200μl總溶菌緩沖液，加入至Eppendorf管中的100μl感染血液中。混合物在37℃下培育30分鐘，然后加熱至95℃并持續20分鐘。冷卻后，加入20μg的mutanolysine，并在37℃下另培育60分鐘。離心后，將上清液上樣到采用DNA結合基質的離心柱，并根據廠商說明書純化DNA。將純化出的DNA置于終體積為100μl的0.01mol、pH7.5的tris緩沖液中，或置于等量的來自于廠商的洗脫緩沖液。為了檢測病原體，選擇引物用以鑒定鏈球菌溶血素O基因(slo)。
1.PCR465bp片段的擴增正向引物15’-AGCATACAAGCAAATTTTTTACACCG反向引物25’-GTTCTGTTATTGACACCCGCAATT引物濃度1mg/ml起始材料5μl分離的DNA
0.5μl正向引物10.5μl反向引物214μl無菌水總量25μl，于即用(Ready to go)試劑盒(Amersham-Biosciences)反應1× 5min 95℃40個循環，各循環條件 30sec.95℃30sec.51℃3min 72℃1× 7min 72℃人體血液中鏈球菌DNA的PCR結果示于圖1中。分離25μl起始材料中的10μl。1)含5μl模板DNA的PCR起始材料；2)含5μl模板的起始材料，以1∶10稀釋。3)陽性對照0.2μl鏈球菌DNA作為模板，不含來自血液的真核DNA。ST)分子量標準物。
結果初級PCR并沒有得到可見的PCR產物。因而，按如下實施2.PCR(嵌套PCR)。
2.PCR(嵌套)含于上面slo片段中的一個348bp片段的擴增。
正向引物35’-CCTTCCTAATAATCCTGCGGATGT-3’反向引物45’-CTGAAGGTAGCATTAGTCTTTGATAACG-3’引物濃度1mg/ml起始材料5μl來自于圖1中PCR1的樣品10.5μl正向引物10.5μl反向引物214μl蒸餾水總量25μl，于即用(Ready to go)試劑盒中(Amersham-Biosciences)反應
1×5min 95℃50個循環，各循環條件 30sec.95℃30sec.54℃3min 72℃1× 7min 72℃圖2所示為以根據圖1的PCR產物作為模板進行的嵌套PCR。樣品對應于圖1中的樣品。
結果在嵌套PCR中，所期望的slo-DNA片段以每100μl血液病原體數為100個鏈球菌細胞進行擴增(樣品1)。對于第一次PCR(圖1)中的5μl模板DNA，這對應于約5至10個模板分子。以1∶10進行稀釋時(樣品2)，此時靈敏度已耗盡(0.5至1個模板分子)。
實施例2實施根據本發明的方法將來自細胞溶解產物的DNA，如上所述用于前面PCR方法進行溶解。不同之處在于采用1ml至5ml之間的試驗材料。
將含有102/ml集落形成單位的化膿性鏈球菌作為病原體的3ml新鮮、肝素化或加有檸檬酸鹽的人體血液用于病原體的檢測。采用用以從體液中分離總DNA的市售試劑盒，根據廠商的修正指導書，通過含有SDS和蛋白酶K的溶菌緩沖液而使DNA得以分離。為此目的，將含有蛋白酶K和SDS的6ml的總溶菌緩沖液，加入至6ml的感染血液中。將混合物在37℃下培育30min。然后加熱至95℃并持續20min。冷卻后，加入200μg的mutanolysine，并在37℃下另培育60分鐘。離心后，將混合物用乙醇沉淀至終濃度為70％，并在離心后以2ml的70％乙醇對沉積物進行洗滌。在真空離心機中除去乙醇殘留物，將沉淀的DNA收集于500μl的TE緩沖液中。然后將DNA應用至含有0.5ml瓊脂糖的柱子上，DNA被固定于1mg的TLR9上。以5個體積的TE緩沖液洗滌柱子。以高濃度的離液離子實施洗脫，如0.7ml的6mole NaJ或KSCN溶液。該洗脫液可直接應用于市售的DNA分離離心柱，如初始實施例一樣，根據說明書即可分離出20-100μl之間的小體積的富含CpG的DNA，并用作進一步分析，如病原體PCR。
權利要求
1.一種富集原核DNA的方法，所述方法包含如下步驟a)將溶液中的至少一種原核DNA與至少一種能特異性結合原核DNA的蛋白質或多肽接觸，由此形成蛋白質或多肽DNA復合物，以及b)分離所述復合物。
2.權利要求1所述的方法，其中分離之后的步驟為將DNA和蛋白質分離。
3.上述權利要求任一項所述的方法，其中的蛋白質或多肽偶聯至載體。
4.權利要求3所述的方法，其中的蛋白質或多肽直接偶聯至所述載體。
5.權利要求3所述的方法，其中的蛋白質或多肽經針對該蛋白或多肽的抗體而偶聯至載體上。
6.權利要求3至5任一項所述的方法，其中所提供的載體為基質，微粒或薄膜。
7.權利要求1或2任一項所述的方法，其中通過針對蛋白質或多肽的抗體或抗血清實現分離。
8.權利要求1所述的方法，其中通過電泳實現分離。
9.前述權利要求任一項所述的方法，其中的蛋白質或多肽是針對非甲基化CpG基元的抗體，或者是相應的抗血清。
10.權利要求1至8任一項所述的方法，其中的蛋白質或多肽由TLR9基因或CGBP基因編碼。
11.權利要求10所述的方法，其中的蛋白質或多肽的編碼cDNA序列與基因文庫登錄號XM-165661的序列具有至少80％，優選至少90％同源性。
12.權利要求10所述的方法，其中的蛋白質或多肽的編碼cDNA序列與基因文庫登錄號AB 045180或其片段的的序列具有至少80％，優選至少90％同源性，優選與轉錄變體A(基因文庫登錄號NM-138688)或轉錄變體B(基因文庫登錄號NM-017442)具有至少80％，尤其優選至少90％同源性。
13.權利要求1所述的方法，其中的溶液含有真核與原核DNA的混合物。
14.權利要求13所述的方法，其中的溶液是體液。
15.權利要求14所述的從體液純化原核DNA的方法，其中于體外無菌條件下實現分離。
16.權利要求1至14任一項所述的檢測原核DNA的方法，其中緊接著原核DNA的擴增步驟。
17.通過權利要求1至14任一項所述的方法富集原核DNA的試劑盒。
18.通過權利要求16項所述的方法檢測原核DNA的測試試劑盒，包含一組或多組特異性引物。
全文摘要
本發明描述了一種富集原核DNA的方法，所述方法包括如下步驟將至少一種原核DNA與至少一種能特異性結合非甲基化CpG基元的蛋白質或多肽接觸，以及分離蛋白質/多肽－DNA復合物。此外，本申請涉及一種用于實施所述方法的試劑盒。
文檔編號C12N15/10GK1681925SQ03822233
公開日2005年10月12日 申請日期2003年8月8日 優先權日2002年9月18日
發明者卡爾－赫爾曼·施米特, 埃伯哈德·斯特勞貝, 斯特凡·魯斯武爾姆 申請人:斯爾思實驗室有限公司