專利名稱：一種口蹄疫病毒非結構蛋白基因3abc及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及動物病毒學技術領域。具體涉及一種新的含有口蹄疫病毒非結構蛋白基因3ABC的重組大腸桿菌菌株(Escherichia coli BL21/pKG3ABC)，利用該菌株表達口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC，并建立酶聯免疫吸附試驗(ELISA)鑒別診斷方法，用于區分口蹄疫滅活疫苗免疫動物與野毒感染動物。本發明提供含有口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC基因的融合表達質粒(pKG-3ABC)、重組大腸桿菌菌株(Escherichiacoli BL21/pKG3ABC)、3ABC蛋白的表達與純化方法以及用該蛋白建立的可區分口蹄疫滅活疫苗免疫動物與野毒感染動物的鑒別診斷方法。
背景技術：
口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD，下文稱之為FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease，FMDV，下文稱之為FMDV)感染引起的人及偶蹄動物共患的一種烈急性、高度接觸性、發熱性傳染病。口蹄疫在世界上許多國家流行，近年來在亞洲流行尤為嚴重。發生口蹄疫的國家進出口貿易受到嚴格限制，影響該國家或地區的外匯收入，造成重大的經濟損失和政治影響。國際獸醫局(OIE)和聯合國糧農組織(FAO)將口蹄疫列為A類烈性傳染病之首。
FMDV屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)，口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)，該病毒基因組為單股正鏈RNA，長約8500個核苷酸，由5’非翻譯區(URT)、3’非翻譯區和一個開放閱讀框(ORF)構成。開放閱讀框包含L蛋白基因、結構基因(P1區)和非結構基因(P2、P3區)等。P3區含有3A、3B、3C、3D四種基因和一個終止密碼子，其聚合蛋白裂解后產生3A，3個3B、3C和3D共6個蛋白。
由于FMD是世界各國密切關注的最重要的動物傳染病。不同的國家或地區采取不同的控制政策，發達國家往往通過捕殺感染動物及同居動物、可疑畜群來控制和消滅本病。而發展中國家多采用注射常規疫苗的方法控制該病的流行。
感染FMD后康復和亞臨床感染的動物都可以攜帶病毒而不表現臨床癥狀，但可引起新的口蹄疫爆發。在采取捕殺政策的國家，如何檢測隱性感染動物；在采取注射疫苗預防的國家，如何區分野毒感染動物和注苗動物是控制和消滅該病的關鍵。因而建立有效的鑒別診斷方法以區別注苗動物和野毒感染動物、檢測隱性感染動物就成為口蹄疫防制技術研究的重要課題。
目前用于口蹄疫檢測的方法可以分為抗原檢測和抗體檢測方法兩大類。前者主要包括病毒分離鑒定、RT-PCR、核酸雜交等，該類方法檢測周期長、技術、設備要求高，不適用于臨床大規模檢測；后者主要指血清學檢測方法，主要包括瓊脂擴散試驗(AgarDiffusion Test；ADT)、補體結合試驗(Complement Fixation Test；CFT)、病毒中和試驗(Virus Neutralization Test；VNT)、間接凝集試驗(Indirect Hemagglutination Test；IHA)、全病毒酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-linked Immunosorbent Assay；ELISA)等，該類方法操作較前者簡單易行，適合臨床大規模的抗體監測，其不足是不能區分滅活疫苗免疫動物和野毒感染動物。因為常規的ELISA或病毒中和試驗是檢測口蹄疫病毒的結構蛋白的抗體。結構蛋白的抗體既可以通過免疫獲得，也可以由野毒感染而引起。因此這些方法只能用于動物口蹄疫病毒抗體水平的監測，在及時發現野毒感染，清除野毒感染動物方面顯的無能為力。
現在發展中國家主要用口蹄疫滅活疫苗對本病進行防疫。由于口蹄疫滅活疫苗的成分主要是純化的滅活病毒粒子，疫苗免疫動物后，動物體內不會有病毒增殖，因而也就無病毒非結構蛋白的表達，動物體內也沒有抗非結構蛋白抗體產生。而野毒感染動物體內則有病毒的增殖，病毒在增殖過程中非結構蛋白也得到了表達，其中的一些非結構蛋白具有免疫原性，引起動物體產生抗非結構蛋白的抗體(Tesar等，VirusGenes.1989，3(1)29-44)。.動物體這種抗體差異，為建立檢測隱性帶毒動物，區別注苗動物和野毒感染動物的鑒別診斷方法提供了理論依據。
在口蹄疫病毒的非結構蛋白中，L蛋白的免疫力較弱，并不是所有感染動物都產生L蛋白的抗體，即使產生抗體的動物，其體內L蛋白抗體的存留期也比較短(Mackay等，Vaccine.1998，16(5)446-459)。利用其他非結構蛋白的抗體來鑒別免疫動物與感染動物已有不少報道。有的是采用幾種非結構NS蛋白聯合使用(Bergmann等，Am.J.Vet.Res.1993，54825-831；Berger等，Vaccine.1990，8(3)213-216；Mackay等，)；有的是用單一非結構蛋白，如2C(Lubroth等，Vet Q.1998b，20 Suppl 2S9-11)或單一多聚蛋白如3ABC(Rodriguez.A.等，Virology.1992，189(1)363-367；DeDiego M等，Arch Virol.1997；142(10)2021-2033)等。
Lubroth和Brown曾認為2C是區分注苗動物和感染動物的標志；Meyer等(JVirol Methods.1997，65(1)33-43)用昆蟲桿狀病毒表達的2C進行ELISA檢測也得到了較好的效果；但是Mezenico等(Vet Q，1998，20Suppl 211-13)研究表明2C抗體在動物體內(牛、豬)的衰減要比3ABC抗體快，而且偶爾也在注苗牛體內檢測到2C的抗體。2B可引起感染動物產生抗體，并證明它含有一個B細胞抗原位點。但沒有建立可重復的方法來檢測2B的抗體。
在單個NS蛋白中，多聚蛋白3ABC的抗體是檢測FMDV感染的最可靠指標。由于不同毒株的3ABC基因變異較小，以3ABC聚蛋白作為診斷抗原，檢出的機率大，結果更可靠。許多研究都集中于建立檢測3ABC抗體的方法。幾乎所有的文章都一致認同3ABC抗體作為感染標記的可靠性。Mezenico等(Vet Q，1998，20Suppl2s11-13)實驗證明，感染過FMDV的牛至少一年以后都能檢測出3ABC的抗體；Sorensen等(Vet Q，1998，20Suppl 217-20)在感染過的牛中進一步確證了這個結果；Malirat等(Vet Q，1998，20Suppl 224-26)比較了3ABC-ELISA和EITB(Enzymelinked Immunoelectrotransfer Blot；EITB)鑒別感染動物的效果，證明3ABC-ELISA方法是可靠的，認為3ABC-ELISA是進行大規模檢測的有效方法，陽性或可疑樣品可通過其他方法進一步證實。Brocchi等(Vet Q，1998，20Suppl 2S20-24)在A型口蹄疫流行時的實驗表明，3ABC抗體陽性的動物都表現出臨床癥狀，而注射疫苗的動物，無論何種疫苗何種佐劑、免疫過幾次，3ABC抗體都是陰性。
目前我國在口蹄疫的臨床抗體檢測中用的ELISA檢測方法是用滅活的口蹄疫全病毒包被酶標板制備酶標抗原。該方法存在病毒滅活不徹底，從而造成活病毒逃逸、擴散的潛在危險。
鑒于口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC的上述特性，利用該蛋白研制出快速、準確、安全、廉價的鑒別口蹄疫免疫動物與野毒感染動物的診斷試劑盒，將為口蹄疫的防制和消滅提供有效工具。

發明內容
本發明目的之一是提供編碼口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC基因的cDNA序列。
本發明目的之二是提供一種可以特異性表達口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC的重組大腸桿菌。該菌株由原核表達載體經轉化大腸桿菌感受態細胞后篩選得到，它經異丙基硫代-β-D-半乳糖苷誘導后可以特異性表達口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC，為ELISA鑒別診斷方法提供抗原。
本發明的目的之三是提供一種表達及純化口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC的方法。
本發明的目的之四是提供一種快速、準確、安全、廉價的區分口蹄疫免疫動物與野毒感染動物ELISA鑒別診斷方法及鑒別診斷試劑盒的制備方法，為我國口蹄疫的防制和消滅提供一種新型工具。
本發明通過以下技術方案實現一種包含口蹄疫病毒非結構蛋白基因3ABC并能表達該基因的重組的大腸桿菌株Escherichia coli BL21/pKG3ABC，保藏在CCTCC，保藏日期2003年9月12日，保藏編號M203068，其中所說的非結構蛋白基因3ABC含有如序列表SEQ ID No1所示的cDNA序列。
一種口蹄疫病毒的非結構蛋白基因3ABC的cDNA序列，其特征在于，它的cDNA序列如序列表SEQ ID No1所示。
所述的一種包含口蹄疫病毒非結構蛋白基因3ABC并能表達該基因的重組大腸桿菌的制備方法，它包括下列步驟1)以分離的口蹄疫病毒基因組為模板，通過RT-PCR方法擴增得到口蹄疫病毒非結構蛋白基因3ABC的cDNA序列；2)原核表達載體pGEX-KG(Vet Q，1998，20Suppl 224-26)的BamHI和Xba I多克隆位點定向插入口蹄疫病毒非結構蛋白基因3ABC的cDNA序列，構建得到原核表達載體pKG-3ABC；3)將步驟2)所說的原核表達載體pKG-3ABC轉化至大腸桿菌BL21感受態細胞，用氨芐青霉素抗性篩選單個重細菌，該菌株經誘導可以特異性地表達口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC；4)將步驟3)所述的表達的3ABC蛋白質進行純化。
所說的口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC純化的具體步驟包括挑取單個重組大腸桿菌BL21/pKG-3ABC菌落至LB培養基，加氨芐青霉素至終濃度為50μg/mL，37℃搖床培養12小時后放4℃冰箱過夜；用含50μg/mL氨芐青霉素的LB培養基將該菌液按1∶100比例稀釋后，分裝至細菌培養瓶中，置37℃搖床培養至OD600≅0.6,]]>用0.4mmol/L的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷進行誘導，每30分鐘取樣100μl，誘導3.5小時后進行SDS-PAGE電泳分析，誘導的菌體經離心、超聲波破碎后提取包涵體，經PEG純化、透析后分裝于-20℃保存備用。
所述的一種包含口蹄疫病毒非結構蛋白基因3ABC并能表達該基因的重組大腸桿菌，其特征在于所述的口蹄疫病毒非結構蛋白基因3ABC特異性蛋白在口蹄疫上的防治。
區分口蹄疫野毒感染動物與滅活疫苗免疫動物的鑒別診斷方法的應用2)利用所說的口蹄疫非結構蛋白3ABC建立酶聯免疫吸附試驗；3)用步驟1)所說的方法制備用于口蹄疫鑒別診斷的試劑盒。
更詳細的技術方案如下所述1、口蹄疫病毒非結構蛋白基因3ABC的克隆以分離的口蹄疫病毒基因組為模板，通過RT-PCR擴增得到3ABC基因的cDNA，經測序分析確定該3ABC基因的cDNA序列如序列表SEQ IDNo1所示。
2、原核表達載體pKG-3ABC的構建將口蹄疫病毒非結構蛋白基因3ABC的cDNA序列定向插入到原核表達載體pGEX-KG(Vet Q，1998，20Suppl 224-26)的BamHI和Xba I多克隆位點定。
3、重組大腸桿菌Escherichia coli BL21/pKG3ABC的構建將2所述的原核表達載體轉化至大腸桿菌BL21感受態細胞，經氨芐青霉素抗性篩選得到陽性重組菌株。該菌株保藏在保藏在CCTCC，保藏日期2003年9月12日，保藏編號M203068。
4、口蹄疫病毒非結構蛋白基因在大腸桿菌BL21中的表達及表達蛋白的純化方法將3所述的重組大腸桿菌Escherichia coli BL21/pKG3ABC在LB液體培養基中培養，經異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導，Western-blot分析，證實該重組大腸桿菌可以特異性地表達口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC，表達的蛋白以包涵體的形式存在大腸桿菌BL21中，且具有免疫學活性。
5、區分口蹄疫野毒感染動物與滅活疫苗免疫動物的3ABC-ELISA鑒別診斷方法的建立與鑒別診斷試劑盒的制備經離心破碎BL21細胞，從4中所述的包涵體中純化3ABC表達蛋白。用該蛋白包被ELISA酶標板制備ELISA抗原酶標板。用空白對照菌(Escherichia coli BL21/pKG)誘導產物制備血清稀釋液，按照普通ELISA方法檢測待檢血清。根據反應后的吸光值確定陰性、可疑、陽性的判斷臨界值。按照如下的配方配置包被液、洗滌液、封閉液、底物緩沖液、TMB母液、終止液。按以下配比制備包被液(25mmol/L碳酸鹽緩沖液)Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，ddH2O加至1000mL(pH9.6)。
洗滌液(含0.05％Tween-20的PBS溶液)NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO40.2g，Tween-20 0.5mL，ddH2O加至1000mL(pH7.4)。
封閉液0.2g牛血清白蛋白(BSA)溶于100mL洗滌液。
底物緩沖液(磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液)0.2mol/L Na2HPO425.7mL，，0.1mol/L檸檬酸24.3mL加ddH2O 50mL(pH5.0)。
TMB母液0.2g TMB干粉溶于100mL的無水乙醇中配制而成。
底物液(TMB)(新鮮配制)TMB母液用底物緩沖液按1∶20的比例稀釋，每毫升底物液加入0.2μL 30％H2O2。
終止液(0.025％HF)HF(40％)625μL，ddH2O 100mL將3ABC抗原酶標板、口蹄疫野毒感染標準陽性血清、滅活疫苗免疫標準陰性血清、包被液、洗滌液、封閉液、底物緩沖液、TMB母液、終止液組裝成3ABC-ELISA鑒別診斷試劑盒。
本發明的有益效果1、本發明的有益效果之一是生物安全性高。本發明所涉及到的原核表達載體pGEX-KG是分子生物學中常用的原核表達載體，沒有生物危險性，在此基礎上構建的原核表達載體pKG-3ABC也沒有任何生物危險性。重組大腸桿菌BL21/pKG-3ABC是將原核表達載體pKG-3ABC轉化至分子生物學中常用的大腸桿菌BL21感受態細胞后經氨芐青霉素抗性篩選獲得，也不具生物危險性。本發明所用的抗原酶標板是用口蹄疫病毒的非結構蛋白制備的，制備過程中不涉及口蹄疫活病毒，因此沒有口蹄疫活病毒逃逸、擴散的潛在危險。
2、本發明的有益效果之二是生產成本低。本發明所提供的口蹄疫鑒別診斷方法和診斷試劑盒所需抗原是口蹄疫病毒的非結構蛋白。該蛋白可以通過重組大腸桿菌BL21/pKG-3ABC在體外得到大量的表達，適合大規模的生產。而目前常用的口蹄疫全病毒ELISA診斷方法和診斷試劑盒的抗原是用口蹄疫全病毒制備的，需要大量的增殖活病毒，所需生產設備、生產工藝和生產成本較高。
3、本發明的有益效果之三是可以提供區分口蹄疫野毒感染動物和滅活疫苗免疫動物鑒別診斷方法和鑒別診斷試劑盒。本發明ELISA鑒別診斷方法和試劑盒所用抗原為口蹄疫病毒非結構蛋白。由于口蹄疫滅活疫苗免疫未感染口蹄疫病毒的動物后，被免疫動物體內無活病毒的增殖，故無口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC的產生，也就無抗非結構蛋白3ABC抗體的產生，而口蹄疫野毒感染動物體內有口蹄疫活病毒的增殖，病毒在增殖的過程中會轉錄翻譯出非結構蛋白3ABC，動物機體就會產生抗非結構蛋白3ABC的抗體。因此用口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC作為ELISA酶標抗原可以與抗非結構蛋白3ABC抗體發生特異性結合，從而達到鑒別診斷口蹄疫滅活疫苗免疫動物和野毒感染動物的效果。目前我國臨床上使用的常規ELISA診斷方法和試劑盒其ELISA抗原是用滅活的口蹄疫全病毒制備的。該方法檢測的是口蹄疫病毒的抗體。由于無論是滅活疫苗免疫動物還是野毒感染動物，都會產生抗口蹄疫病毒的抗體。因此常規的ELISA診斷方法和試劑盒不能達到本發明鑒別診斷的目的。
4、本發明的有益效果之四是提供的鑒別診斷試劑盒使用方便。本發明在提供了鑒別診斷方法的基礎上，還將該方法所需的各種試劑組裝成試劑盒，操作簡單易行，非常適合口蹄疫的臨床大規模檢測。
序列表、附圖及說明序列表SEQ ID No1是本發明的口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC的cDNA序列。


圖1顯示了表達口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC基因表達載體pKG-3ABC物理圖譜及構建流程圖。
圖2顯示的是誘導表達的口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC的SDS-PAGE電泳圖。
圖3顯示的是誘導表達的口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC的Western-blot檢測結果。
圖4顯示的是在同一塊酶標板上進行的陰陽血清方陣滴定的效果照片。
具體實施例方式
實施例1口蹄疫病毒非結構蛋白基因3ABC cNDA序列的克隆在長滿單層的倉鼠腎傳代細胞(BHK)上接種口蹄疫病毒，待80％細胞出現細胞病變時收集病毒。以提取的口蹄疫病毒RNA為模板，通過RT-PCR擴增口蹄疫病毒非結構蛋白基因3ABC cDNA。RT-PCR所用引物根據D.K.J Mackay等(Vaccine.1998，16(5)446-459)報道的FMDV的基因組序列設計，其序列如下P15’-TGGATCCATGATTTCAATCCCTTCC-3’(上游引物)P25’-GCGAATTCATCACTCGTGGTGTGG-3’(下游引物)RT-PCR反應體系為模板RNA 8μL，2×Reaction buffer 25μL，P1、P2引物各1.0(終濃度為10pmol/L)，Taq/mix 1.0μL，加DEPC處理水至50μL。RT-PCR反應條件為50□30分鐘，94□1分鐘；然后65□退火1分鐘，72□延伸1分30秒，共35個循環，最后72□延伸10分鐘。將RT-PCR產物回收、純化，與克隆載體pMD18-T連接后，轉化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆子(命名為pT-3ABC)，小量提取質粒，經酶切鑒定后測序得到3ABC的cDNA全序列(如序列表SEQ ID No1所示)。
實施例2口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC基因原核表達載體的構建用BamHI和Xba I分別酶切pT-3ABC和載體pGEX-KG，回收3ABC基因和載體pGEX-KG；然后用T4 DNA ligase連接，16□水浴過夜，轉化DH5α感受態細菌，37□培養，從中隨機挑選多個單菌落，分別放入LB液體培養基中37℃培養12小時后從中提取質粒，經酶切鑒定后篩選得到陽性重組質粒，并命名為pKG-3ABC。
實施例3重組大腸桿菌Escherichia coli BL21/pKG3ABC和Escherichia coli BL21/pKG的構建將重組表達載體pKG-3ABC轉化至大腸桿菌BL21感受態細胞，涂布LB/氨芐青霉素(Amp)平皿，挑選多個單菌落放入LB液體培養基中37℃培養12小時后分別用異丙基硫代-D-D-半乳糖苷(IPTG)誘導表達，然后進行SDS-PAGE和Western-blot檢測，從中篩選出能夠在大腸桿菌BL21中誘導表達口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC的重組大腸桿菌Escherichiacoli BL21/pKG3ABC。
同時，將載體pGEX-KG同步轉化至大腸桿菌BL21細胞，按以上方法在大腸桿菌BL21中誘導表達，篩選出無口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC表達的空白對照重組大腸桿菌菌Escherichia coli BL21/pKG。
實施例4最佳誘導物濃度及最佳誘導時間的確定挑取單個重組大腸桿菌Escherichia coli BL21/pKG3ABC菌落至3mL LB培養基，加氨芐青霉素(Amp)至終濃度為50μg/mL，37℃搖床培養12小時后放4℃冰箱過夜。用含50μg/mL氨芐青霉素(Amp)的LB培養基將該菌液按1∶100比例稀釋后，分裝至5支細菌培養瓶中(3mL/瓶)，置37℃搖床培養至OD600≅0.6,]]>加入誘導劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mmol/L，繼續培養3h后，等量取樣進行SDS-PAGE。根據3ABC蛋白表達情況確定IPTG最佳誘導濃度為0.4mmol/L。
挑取單個重組大腸桿菌BL21/pKG-3ABC菌落至3mL LB培養基，加氨芐青霉素(Amp)至終濃度為50pg/mL，37℃搖床培養12小時后放4℃冰箱過夜。用含50μg/mL氨芐青霉素(Amp)的LB培養基將該菌液按1∶100比例稀釋后，分裝至5支細菌培養瓶中(3mL/瓶)，置37℃搖床培養至OD600≅0.6,]]>以最佳誘導物濃度(IPTG濃度為0.4mmol/L)進行誘導，每30分鐘取樣100μl，共誘導5小時后進行SDS-PAGE電泳分析，根據3ABC表達情況確定最佳誘導時間為3.5小時。
實施例5口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC的大量誘導表達和蛋白純化挑取單個重組大腸桿菌Escherichia coli BL21/pKG3ABC菌落至3mL LB培養基，加氨芐青霉素至終濃度為50μg/mL，37□搖床培養至混濁，放4□冰箱過夜。取該菌液2mL加入200mL含50μg/mL氨芐青霉素的LB培養基中，置37□搖床培養至OD600≅0.6,]]>加入誘導劑IPTG至終濃度為0.4mmol/L，繼續誘導培養3.5小時。
離心收集誘導后的菌體，用細菌裂解液重懸，-40℃速凍1小時，超聲波破碎2-3分鐘，至溶液為透明。4℃離心后棄上清，用少許TE溶液(pH7.4)輕輕洗滌沉淀。
加入原細菌培養液體積1/10的包涵體變性溶液，用吸管吹打沉淀或攪拌，靜置1-2h，使其沉淀緩慢溶解。4℃ 12000轉離心10min，棄沉淀，取上清，加入PEG4000至0.2％(W/V)、氧化型谷光苷肽至1mM、還原性谷光苷肽2mM，靜置至少30min后，轉至處理好的透析袋中，于TE溶液(pH7.4)或PBS溶液(pH7.4)中透析2-3d，取出立即使用或分裝至1.5mL管，-20℃或-40℃保存備用細菌裂解液配方Tris-Cl 50mM/L、EDTA 0.5mM/L、NaCl 50mM/L、Glycerol 5％(W/V)、DTT 0.5mM/L(使用前加入)。
包涵體變性溶液細菌裂解液+SKL 0.3％(W/V)。
實施例6口蹄疫病毒3ABC-ELISA鑒別診斷試劑盒構成及制備方法1、3ABC-ELISA試劑盒包括抗原酶標板2塊、10×洗滌液50mL、陰陽血清各500μL、10×血清稀釋液50mL、底物液各50mL、終止液25mL、二抗工作液50mL。
2、ELISA 相關溶液配方包被液(25mmol/L碳酸鹽緩沖液)Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，ddH2O加至1000mL(pH9.6)。
洗滌液(含0.05％Tween-20的PBS溶液)NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO40.2g，Tween-20 0.5mL，ddH2O加至1000mL(pH7.4)。
封閉液0.2g牛血清白蛋白(BSA)溶于100mL洗滌液。
底物緩沖液(磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液)0.2mol/L Na2HPO425.7mL，，0.1mol/L檸檬酸24.3mL加ddH2O 50mL(pH5.0)。
TMB母液0.2g TMB干粉溶于100mL的無水乙醇中配制而成。
底物液(TMB)(新鮮配制)TMB母液用底物緩沖液按1∶20的比例稀釋，每毫升底物液加入0.2μL 30％H2O2。
終止液(0.025％HF)HF(40％)625μL，ddH2O 100mL3、抗原酶標板的制備將上述實施例5制備的3ABC蛋白用所說的包被液按1∶40稀釋，按100μL/孔加入到酶標板中，置37℃1h后放入4℃冰箱過夜；棄包被液，加入所說的封閉液(200μL/孔)于37℃封閉1h；棄封閉液，于37□1h；棄封閉液，風干；將酶標板放入專用錫泊袋，加一小袋干燥劑，抽真空，熱壓封口。
4、血清稀釋劑的制備將空白對照菌(BL21/pGEX-KG)作同步誘導，離心收集菌體，TEN溶液(pH7.4)洗滌1次，加入原培養物體積1/10的PBS溶液(pH7.4)重懸，-40℃速凍1h，超聲波破碎至透明(2-3min)；取該溶液20mL，加入封閉液80mL，即為血清稀釋液。
實施例7口蹄疫病毒3ABC-ELISA檢測步驟及判斷標準從4℃冰箱中取出試劑盒，平衡各組分至室溫。按需要量將10×洗滌液和10×血清稀釋液用雙蒸是水稀釋為工作液。將待檢血清、陰性血清及陽性血清用血清稀釋液按1∶40稀釋后加入到酶標板中(100μL/孔)置37℃45min。用所說的洗滌劑洗滌酶標板4次，每次200μL，甩干。加入酶標二抗，每孔100μL，置37℃30min。用洗滌劑洗滌酶標板6次，每次200μL，甩干。每孔加入底物液100μL，37℃作用10min。每孔加入50μL所說的終止液，輕輕振蕩終止反應，置酶標儀，0D630測吸光值。判斷標準OD630≥3.5為陽性，疑為口蹄疫感染；OD630＜3.5為陰性。
試驗結果顯示，利用口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC基因表達抗原，建立的ELISA檢測方法可以快速、準確地區分口蹄疫免疫動物與野毒感染動物。
盡管本發明的內容是結合本實施例進行說明，但是不能認為是對本發明范圍的限制，本發明的范圍由所附權利要求書限定。另外，本領域的技術人員在所附權利要求書限定的范圍內對本發明進行各種改動或修飾，這些改動或修飾形式同樣落在本發明的保護范圍內。
口蹄疫病毒非結構蛋白基因3ABC的cDNA序列<110>華中農業大學<120>一種口蹄疫病毒非結構蛋白基因3ABC及其制備方法與應用<130>
<141>2003-09-28<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1317<212>DNA<213>口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)
<220>
<221>gene<222>(1)..(1317)<223>
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1.一種包含口蹄疫病毒非結構蛋白基因3ABC并能表達該基因的重組的大腸桿菌株Escherichia coli BL21/pKG3ABC，保藏在CCTCC，保藏日期2003年9月12日，保藏編號M203068，其中所說的非結構蛋白基因3ABC含有如序列表SEQ ID No1所示的cDNA序列。
2.一種口蹄疫病毒的非結構蛋白基因3ABC的cDNA序列，其特征在于，它的cDNA序列如序列表SEQ ID No1所示。
3.實現權利要求l所述的一種包含口蹄疫病毒非結構蛋白基因3ABC并能表達該基因的重組大腸桿菌的制備方法，其特征在于1)以分離的口蹄疫病毒基因組為模板，通過RT-PCR方法擴增得到口蹄疫病毒非結構蛋白基因3ABC的cDNA序列2)在原核表達載體pGEX-KG的BamHI和XbaI多克隆位點定向插入口蹄疫病毒非結構蛋白基因3ABC的cDNA序列，構建得到原核表達載體pKG-3ABC；3)將步驟2)所說的原核表達載體pKG-3ABC轉化至大腸桿菌BL21感受態細胞，用氨芐青霉素抗性篩選單個重組菌，該菌株經誘導可以特異性地表達口蹄疫病毒非結構蛋白基因3ABC4)將步驟3)所述的表達的3ABC蛋白質進行純化。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，表達蛋白質純化的具體步驟包括挑取單個重組大腸桿菌BL21/pKG-3ABC菌落至LB培養基，加氨芐青霉素至終濃度為50μg/mL，37℃搖床培養12小時后放4℃冰箱過夜用含50μg/mL氨芐青霉素的LB培養基將該菌液按1∶100比例稀釋后，分裝至細菌培養瓶中，置37℃搖床培養至OD600≅0.6,]]>用0.4mmol/L的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷進行誘導，每30分鐘取樣100μl，誘導3.5小時后進行SDS-PAGE電泳分析，誘導的菌體經離心、超聲波破碎后提取包涵體，經PEG純化、透析后分裝于-20℃保存備用。
5.權利要求1或2所述的一種包含口蹄疫病毒非結構蛋白基因3ABC并能表達該基因的重組大腸桿菌，其特征在于所述的口蹄疫病毒非結構蛋白基因3ABC特異性蛋白在口蹄疫上的防治。
6.權利要求l的區分口蹄疫野毒感染動物與滅活疫苗免疫動物的鑒別診斷方法，其特征在于1)利用所說的口蹄疫非結構蛋白3ABC建立酶聯免疫吸附試驗；2)用步驟1)所說的方法制備用于口蹄疫鑒別診斷的試劑盒。
全文摘要
本發明涉及口蹄疫病毒的非結構蛋白基因3ABC；用該基因構建的原核表達載體；將該載體轉化至大腸桿菌BL21而篩選得到的重組表達菌株(Escherichia coli BL21/pKG3ABC)；利用該表達菌株表達口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC及其表達蛋白的純化方法；利用表達蛋白建立的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)鑒別診斷方法。發明所包括的重組表達菌株Escherichia coli BL21/pKG3ABC，保藏在CCTCC，保藏日期2003年9月12日，保藏編號CCTCCM203068。
文檔編號C12N1/21GK1605629SQ20031010011
公開日2005年4月13日 申請日期2003年10月9日 優先權日2003年10月9日
發明者陳煥春, 顧貧, 曹勝波, 錢平, 唐勇, 金梅林, 吳斌, 方六榮, 劉正飛, 呂建強 申請人:華中農業大學