專利名稱：脊髓型肌肉萎縮癥的鑒別方法
技術領域：
本發明是關于一種基因檢測方法，尤指一種檢驗脊髓型肌肉萎縮癥基因與帶原者的檢測方法。
背景技術：
運動神經元疾病(motor neuron disease，MND)是一種神經退化性疾病，其中脊髓型肌肉萎縮(Spinal muscular atrophy，SMA)是由于人體第五對染色體(5q13)上基因-運動神經元存活基因(survival motor neuron gene，SMN)發生突變，造成脊髓中的前角細胞，也就是運動神經細胞退化，而形成肌肉萎縮的癥狀，通常癥狀是先由手掌、指間肌肉開始萎縮，慢慢惡化到肩膀、頸部、舌頭、吞咽與呼吸肌肉，最后造成吞咽困難與呼吸衰竭而死亡。在臺灣，平均每一萬名新生兒就有一名罹病，帶原率大約是1％-3％。
人類體染色體為成對的，因此染色體上的每一個基因都有兩份，如果在體染色體上有基因發生變異，產生了缺失，另外一份正常基因仍有可能制作出足夠量的正常蛋白質，于是這種基因異常便不會有明顯的臨床癥狀，此即隱性遺傳疾病；SMA即屬隱性遺傳疾病，帶原者表現于外表型是正常的，其基因型屬于異型合子(heterozygote)，如果親代基因型均屬于異型合子，子代同時由其親代各獲得一份異常的隱性疾病基因，則子代便會有該隱性遺傳疾病的表征，基因型為同型合子(homozygote)，為SMA病患。
一般正常人的兩條第5號染色體有兩個同源性很高的SMN，包括靠近染色體末端(telomeric gene)的SMN1基因與靠近染色體中節(centromic gene)的SMN2基因；少數正常人只有SMN1基因，而無SMN2基因。這兩個基因僅在3’端的區塊有5個堿基對的差異，SMN1及SMN2基因雖然都會進行轉錄，但是SMN1基因轉錄轉譯出來的為穩定且具完整功能的蛋白質；而SMN2基因轉錄出來的mRNA大部分缺少exon 7，故轉錄出來的多為不穩定的蛋白質；因此，正常人如果因為SMN1與SMN2基因的間的刪減或置換，而造成SMN1的缺失，即會發病，而SMN2的表現則與臨床癥狀輕重相關。
目前臨床上最常使用在SMA的檢查的方法為PCR-RFLP(PolymeraseChain Reaction Restriction enzyme Fragment Length Polymorphism)，PCR所放大出的基因片段包含SMN1與SMN2，但只有SMN2基因具有被限制酶(restriction enzyme)辨認而切割的堿基，SMN1基因則無，因此，以限制酶進行基因片段切割處理后，再以電泳檢測所攜帶的SMN1與SMN2基因，然而，這個方法反應所需的時間較長。
此外亦有一種鑒別SMA的方式，就是將含SMN序列的核苷酸進行定序，接著一一比對找出單一核苷酸的差異，此技術在定序方面雖然可以自動化進行，但是檢驗設備與耗材成本較高，結果的判讀也需要一受到完整訓練的技術人員進行，不僅耗時，繁瑣又需花費大量人力與金錢，因而無法大量制式化施行檢驗。
由于SMA的醫療費用高，病患本身與家屬常承受非常大的經濟壓力，而此醫療行為也是社會資源的龐大支出；最重要的是，傳統檢測只能在病人發病后加以確認是否為SMA，且無法找出SMA帶原者；為此，如能有快速、準確、且經濟的方法得以正確診斷出SMA基因的變異，或是給予產前遺傳咨詢或帶原檢驗等，將有助于預防此罕見疾病的發生。

發明內容
本發明利用DNA突變分析儀(Denaturing High Performance LiquidChromatography，DHPLC)，來檢測與脊髓型肌肉萎縮癥相關的基因變異。DNA突變分析儀由美國史丹佛大學Peter Oefner教授研究團隊所發展出的一新技術，利用自動化的偵測來找出微小甚至是單一核苷酸的突變，用以確認及辨認單一核苷酸的變化。此技術的原理為直接將PCR產物以加熱的方式將DNA雙螺旋松解，使得具錯誤配對的核苷酸能夠與正常股得到區分，而經由HPLC管柱的分離而得到不同的管壁滯留時間(retentiontime)，之后經由UV的偵測可得到結果。
本發明提供一種脊髓型肌肉萎縮癥鑒別方法，步驟包括(a)提供一基因組核苷酸；(b)將基因組核苷酸與一引子對進行核酸序列的放大；以及(c)將放大后的一產物送入一DNA突變分析儀(Denaturing HighPerformance Liquid Chromatography，DHPLC)中。
于本發明中，放大基因組核苷酸基因以脊髓型肌肉萎縮癥的相關基因片段-運動神經元存活基因(survival motor neuron gene，SMN)為主。為成功放大出目標基因，本發明方法步驟(b)中所使用的引子對含一正向引子，SEQ ID NO1以及一負向引子，SEQ ID NO2，或是任何一組可使放大后的產物含運動神經元存活基因的引子對；且步驟(b)的放大反應是聚合酶連鎖反應。
本發明方法較佳可在步驟(c)之后還包括一步驟(d)，取自該DNA突變分析儀的結果與一運動神經元存活基因的標準品圖譜進行比對，由于利用DNA突變分析儀可區分出只有少數堿基差異的SMN1與SMN2，因此標準品的制備是分別利用SMN1與SMN2進行DNA突變分析儀的分析，并以滯留時間(retention time)的差異來作比對的基礎。
由于利用本發明方法先專一性的放大含SMN基因片段的核苷酸，再利用DNA突變分析儀的分析，可成功的區分出極小差異的SMN1與SMN2，而SMN1與SMN2的存在與否，或是兩基因存在的比例，是影響一個體健康與否的主因，因此本發明方法不僅可用以區分受檢者是否帶有此疾病，還可用以鑒別脊髓型肌肉萎縮癥的帶原者。


圖1是SMN1與SMN2標準品的DHPLC圖譜。
圖2是單一堿基突變DHPLC圖譜與定序結果比較圖。
圖3是SMN1與SMN2基因拷貝量分析的DHPLC圖譜。
圖4是帶有SMA遺傳疾病的家族譜系分析圖。
圖5是另一帶有SMA遺傳疾病的家族譜系分析圖。
具體實施例方式
實施例一以受檢者血液為檢體，利用Puregene核酸萃取套組(Gentra Systems)抽取血液中的基因組DNA。
實施例二利用聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)將SMN片段自基因組DNA中大量復制，以利檢驗的進行。
已知SMN1與SMN2的序列只有5個堿基對不同，因此由PCR反應放大出的產物將同時包含有SMN1與SMN2的序列，但是光以PCR產物，是無法分辨出受檢者是含SMN1序列的健康個體，或是只有SMN2序列的患病個體。由于健康者所攜帶的SMN1基因轉錄出的蛋白質產物包含有exon7，因此exon7的存在是受檢者患病與否的關鍵，所以本實施例中所用以進行PCR的引子對(primers)設計在SMN exon7附近，正向引子為SEQ ID NO1，負向引子則為SEQ ID NO2，由此增幅后的SMN基因片段，進行是否含有單一堿基突變的進一步分析。
PCR反應液中含有基因組DNA 100ng，引子對(SEQ ID NO1與SEQID NO2)0.12μM，dNTPs 100μM，聚合酶0.5單位(AmpliTaq GoldTM，PEApplied Biosystems)，10X緩沖液II(10mM Tris-HCl，pH＝8.3，50mM KCl)以及2mM MgCI2的GeneAmp 2.5μL；所使用的聚合酶連鎖反應儀為MBSthermocycler(ThermoHybaid)；進行聚合反應的條件為首先于95℃環境下處理10分鐘，接著進行35個循環，每個循環條件包括94℃-30秒，53℃-45秒，72℃-45秒，最后再增加一使DNA延展的時間，在72℃下處理10分鐘。
實施例三DNA突變分析儀(DHPLC)使用的是Transgenomic Wave核苷酸片段分析系統(Transgenomic Inc.)，其是在一自動化HPLC儀器上裝配一DNASep管柱(Transgenomic Inc.)，管柱中含有2mm直徑，非多孔性的苯乙烯-二乙烯基苯(Styrene divinylbenzene)粒子。因為堿基不同而有不同構型的DNA，在經HPLC分離后，可得到不同的管壁留置時間，之后經由UV偵測儀于260nm的吸光下進行分析；DHPLC儀器中使用的流動相(mobile phase)均為DHPLC級試劑，其中沖提液(eluent)A含0.1M三乙基醋酸銨(TEAA，TransgenomicTM)與500μl乙腈(acetonitrile，9017-03 J.T.Baker)，沖提液B為含25％乙腈的0.1M TEAA。
取實施例二中完成增幅的DNA片段20μl，直接注射入DHPLC儀器中，條件設定一開始為5分鐘的加熱(95℃)，接著再以漸進式梯度降溫的方式，在70分鐘的內從95℃降至25℃，其中，沖提液B以0.9ml/min的速率漸進式的每分鐘增加2％，共持續4.5分鐘；一個測試約需10分鐘。
實施例四利用實施例三的DHPLC，先制備出標準品圖譜，即SMN1與SMN2的個別的圖譜，以利于與檢體比對。
首先分別將SMN1與SMN2基因片段以PCR方式取得后，取5μlPCR產物，與pGEM-TEasy Vector混合成一10μl的混合物后，置于4℃中一夜，進行基因片段與質體的接合(ligation)，接著取5接合后產物進行轉形(transformation)實驗，將接合完成的質體送入大腸桿菌(E.coli)中，再將菌種培養于含20μl篩選藥物(ampicllin 50g/L)的培養基上，于37℃中培養一夜。經培養基的存活篩選后，長出的菌種即為質體接合成功者；接著將菌種培養增殖后，以Mini-MTM質體抽取系統(Viogene)將菌種體內成功接合的質體抽取出，再依照實施例三的DHPLC條件，制備出SMN1與SMN2的個別的圖譜，作為標準品。
SMN1與SMN2標準品圖譜請見圖1，圖1a為SMN2標準品，留置時間還不到6分鐘，圖1b為SMN1標準品，留置時間大概在第6分鐘左右。
實施例五將實施例二的PCR產物進行定序，所使用的是PE Biosystems TaqDyeDeoxy terminator cycle sequencing kit，并于PE Biosystems 373A/3100定序儀中進行序列分析，以由定序結果來與實施例三的DHPLC圖譜做比對。
實施例六為進一步證實利用DHPLC亦可達成檢測SMN1與SMN2基因拷貝數的目的，本實施例利用傳統的TaqManTM技術，以實時定量聚合酶連鎖反應(real-time PCR)法，將檢體于96孔盤(MicroAmp optical plate，AppliedBiosystems)中以ABI Prism 7000的序列檢測儀進行分析。
其中所用以放大SMN基因的引子對中，正向引子為SEQ ID NO3，負向引子則為SEQ ID NO4；并使用MGB(minor groove binder)探針，分別接上熒光染劑(5’-FAM)，以區分SMN1與SMN2基因中exon片段中第6個堿基位置的差異；SMN1的MGB探針序列為SEQ ID NO5，SMN2的MGB探針序列為SEQ ID NO6。
PCR反應液中含有基因組DNA 50ng，引子對(SEQ ID NO3與SEQID NO4)0.3μM，PlatinumqPCR Supermix-UDG(Invitrogne)13μl，ROX(Invitrogne)0.5mM，2mM MgCl2以及100nmol的MGB探針(SEQ ID NO5與SEQ ID NO6)。進行聚合反應的條件為首先于50℃環境下處理2分鐘，95℃環境下10分鐘，接著進行40個循環，每個循環條件包括95℃-15秒，60℃-1分鐘。分析軟件為ABI37000SDS(Applied Biosystems)。
實施例七在不同留置時間所出現的波峰，分別代表不同構型的DNA，透過控制DHPLC的加熱溫度，使DNA分子間結合力產生差異，而可明確的區分出序列不同的DNA分子，因此可輕易檢測出SMN1與SMN2的單一堿基的差異。
請參考圖2，與實施例五的定序結果相比較，可發現圖2a圖譜中同時帶有SMN1與SMN2基因，且可從相對應的定序圖中確認該波峰為單一堿基突變(胞嘧啶C/胸腺嘧啶T的點突變)所造成，屬于異源雙股DNA(heteroduplex)，而圖2b(來自SMN2質體)與圖2c(來自人類DNA檢體)的圖譜，則顯示該檢體DNA為只有胸腺嘧啶T的同源雙股DNA(homoduplex)，即該DNA為SMN2基因片段；圖2d(來自SMN1質體)與圖2e(來自人類DNA檢體)的圖譜，則為只有胞嘧啶C的同源雙股DNA(homoduplex)，即該DNA為SMN1基因片段。
實施例八同時，在進行多個檢體的DHPLC分析后，發現有許多結果是同時出現SMN1與SMN2基因的，而且各個檢體呈現的波峰下的面積比例也與該檢體進行定量PCR的結果相符，顯示利用DHPLC的分析，也可以達到與定量PCR相同的效果，亦即可推知SMN1與SMN2的相對的基因拷貝量；本實驗經多次重復，確認在DHPLC恒溫器設定在52.5℃時，可清楚分析出SMN1與SMN2基因拷貝量。
請參考圖3，由圖3a-e可明顯的判讀出不同基因拷貝量的SMN1與SMN2，如圖3a顯示SMN1與SMN2的基因拷貝量比例相同，圖3b的SMN1∶SMN2＝1∶2，圖3c的SMN1∶SMN2＝1∶3，圖3d的SMN1∶SMN2＝2∶1，圖3e的SMN1∶SMN2＝3∶1。
實施例九利用本發明檢驗與判讀方法，進行2個已知帶有SMA遺傳疾病的家族進行譜系分析，結果如圖4與圖5。圖4中父為帶原者 母亦為帶原者 所生出的兩名男孩均為SMA的病患(■)，經由DHPLC的分析，可發現父的SMN1∶SMN2＝1∶3，母的SMN1∶SMN2＝1∶3，兩名男孩的SMN1∶SMN2＝0∶4，因為SMN1基因的缺失而發病。
另一家族的譜系圖請見圖5，圖5中父為帶原者 母亦為帶原者 所生出的四名子女中，兩名男孩為SMA的病患(■)，另兩名女孩中，一名為健康者(○)，另一名為帶原者 此外，與健康女孩婚配的男孩亦為健康者；經由DHPLC的分析，可發現父的SMN1∶SMN2＝1∶3，母的SMN1∶SMN2＝1∶3，兩名男孩的SMN1∶SMN2＝0∶4，帶原者女孩的SMN1∶SMN2＝1∶3，健康女孩的SMN1∶SMN2＝2∶2，健康女孩婚配對象的SMN1∶SMN2＝2∶2。
本發明經過測試，將原本用以檢測單一核苷酸變異的DNA突變分析儀成功運用于檢測SMA病人與帶原者。在測試結果圖譜中，單一峰值的結果代表了同型合子的存在，而留置時間的變化，也就是峰值的變化，即表示異型的合子的存在。利用此方法可以有效區分同型合子及異型合子的存在，彌補直接序列分析在這方面耗時及昂貴的缺憾，可以在短時間內有效率、經濟及準確地篩檢出重癥患者及帶原者，相較于現行的方法，除了對于檢驗重癥患者具有快速，準確及高敏感度的特性，對于帶原者而言，可進一步對于帶原者做快速準確的檢驗。
上述實施例僅為了方便說明而舉例而已，本發明所主張的權利范圍自應以申請專利范圍所述為準，而非僅限于上述實施例。
序列表<110>蘇怡寧<120>脊髓型肌肉萎縮癥基因及其帶原者之檢測方法<130>P7932/0619<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>22<212>DNA<213>人類<400>1tgtcttgtga aacaaaatgc tt 22<210>2<211>21<212>DNA<213>人類<400>2aaaagtctgc tggtctgcct a21<210>3<211>27<212>DNA<213>人類<400>3aatgcttttt aacatccata taaagct 27<210>4<211>25<212>DNA<213>人類<400>4ccttaattta aggaatgtga gcacc25<210>5<211>16<212>DNA<213>人工合成<220>
<223>人工合成MGB探針<400>5cagggtttca gacaaa 16<210>6<211>18<212>DNA<213>人工合成<220>
<223>人工合成MGB探針<400>6tgattttgtc taaaaccc18
權利要求
1.一種脊髓型肌肉萎縮癥的鑒別方法，包括a)提供一基因組核苷酸；b)將該基因組核苷酸與一引子對進行核酸序列的放大；以及c)將放大后的一產物送入一DNA突變分析儀中。
2.如權利要求1所述的檢驗方法，其特征在于，其中步驟(b)中該引子對含一正向引子，為SEQ ID NO1。
3.如權利要求1所述的檢驗方法，其特征在于，其中該步驟(b)中引子對含一負向引子，為SEQ ID NO2。
4.如權利要求1所述的檢驗方法，其特征在于，其中該步驟(b)的放大反應是聚合酶連鎖反應。
5.如權利要求1所述的檢驗方法，其特征在于，其中步驟(c)的該產物是包括脊髓型肌肉萎縮癥的相關基因片段。
6.如權利要求5所述的檢驗方法，其特征在于，其中該脊髓型肌肉萎縮癥的相關基因片段是運動神經元存活基因。
7.如權利要求1所述的檢驗方法，其特征在于，其中于步驟(c)之后還包括一步驟(d)，取自該DNA突變分析儀的結果與一運動神經元存活基因的標準品圖譜進行比對。
8.如權利要求1所述的檢驗方法，其特征在于，其用于鑒別脊髓型肌肉萎縮癥的帶原者。
全文摘要
本發明是有關于一種脊髓型肌肉萎縮癥的鑒別方法，步驟包括(a)提供一基因組核苷酸；(b)將基因組核苷酸與一引子對進行核酸序列的放大；以及(c)將放大后的一產物送入一DNA突變分析儀(Denaturing HighPer formance Liquid Chromato graphy，DHPLC)中；本發明方法不僅可用以區分受檢者是否帶有此疾病，更可用以鑒別脊髓型肌肉萎縮癥的帶原者。
文檔編號C12Q1/68GK1769486SQ200410089810
公開日2006年5月10日 申請日期2004年11月1日 優先權日2004年11月1日
發明者蘇怡寧 申請人:蘇怡寧