專利名稱：鑒別基因功能的方法和組合物的制作方法
本申請要求提交于2003年9月30日的美國臨時申請號60/507,437的優先權，該申請在此引入作為用于任何目的的參考。
1.0領域提供了產生和表征細胞中的插入突變的方法。還提供了穩定結合插入突變的細胞。
2.0背景許多人類治療(有某些例外，包括，例如，直接靶向病原體的抗體)直接或間接地與基因組序列信息的有限集所編碼的產物或元件相互作用。因此，科學考查轉向對那些可能提出清楚的醫療介入途徑的編碼序列信息部分進行鑒別。許多治療性產物通過調節生理起作用。在成千上萬種生物化學和構建體相關的人類基因組編碼產物中，科學團體僅清楚鑒別了這些產物中一部分的生理功能。出于多種原因，在某些情況下，小鼠成為代理表征(characterizing-by-proxy)人類生物序列生理意義的模式生物。作為一種哺乳動物，小鼠擁有許多人類的主要器官系統并經常利用直向同源產物(orthologous products)調節這些器官系統的功能。此外，在某些情況下，小鼠還允許其自身基因組的基因工程操作。
在某些情況下，小鼠胚胎干細胞(ES)技術提供了染色體工程的方法并，因此，提供了假定基因組(genomic hypotheses)的直接檢測。
3.0概述在某些實施方案中，提供了產生一組單獨表征的被插入突變的哺乳動物細胞克隆的方法。在某些實施方案中，該方法包括用逆轉錄基因誘捕構建體感染哺乳動物細胞。在某些實施方案中，該方法進一步包括選擇穩定結合所述逆轉錄基因誘捕構建體的整合前病毒形式的哺乳動物細胞克隆。在某些實施方案中，該方法進一步包括體外鑒別所述逆轉錄基因誘捕構建體的整合前病毒形式附近的基因組DNA區域。
在某些實施方案中，用逆轉錄病毒基因誘捕構建體以小于5的感染復數(M.O.I)感染哺乳動物細胞。在某些實施方案中，感染復數小于1。在某些實施方案中，感染復數小于0.5。
在某些實施方案中，鑒別包含反向聚合酶鏈式反應(IPCR)。在某些實施方案中，反向聚合酶鏈式反應包含至少一種選自Pfu、Taq、Isis、Vent、Pwo、Phusion和Tth的聚合酶。在某些實施方案中，通過測序來鑒別所述逆轉錄病毒基因誘捕構建體的整合前病毒形式附近的基因組DNA的至少50個堿基。在某些實施方案中，鑒別不涉及逆轉錄酶反應。
在某些實施方案中，選擇了至少10,000個不同的哺乳動物細胞克隆的集群。在某些實施方案中，選擇了至少10,000個不同的哺乳動物細胞克隆的集群，其包含至少10,000個不同的哺乳動物細胞克隆，每個克隆都在不同的基因中含有所述逆轉錄病毒基因誘捕構建體的整合的前病毒形式。
在某些實施方案中，提供了一組單獨表征的被插入突變的哺乳動物細胞克隆。
4.0附圖簡述

圖1顯示了反向聚合酶鏈式反應(IPCR)的示意圖。
圖2顯示了VICTR48的示意圖。“LTR”是逆轉錄病毒的長末端重復。“SA”是剪接受體位點。“NEO”是新霉素抗性基因。“PA”是多腺苷酸化位點。“SV40tpA”是SV40的三重多腺苷酸化序列。“PGK”是PGK啟動子。“BTK”和“SD”是小鼠BTK基因第一外顯子和剪接供體位點。剪接供體之后是BTK基因第一內含子的一部分。標出了限制性位點。限制性位點名稱后面的星號(*)表示其是在構建體上的獨特位點。
圖3顯示了來自數個被基因誘捕的ES細胞克隆的IPCR分析的示例產物，如實施例6.2所討論。
圖4顯示了莫洛尼鼠類白血病病毒長末端重復(LTR)的序列，缺少至少一部分的增強子區(SEQ ID NO5)。
圖5顯示了被修飾的LTR，其缺少至少一部分的增強子區還缺少LTR內的隱蔽剪接供體(SEQ ID NO6)。
圖6A-C顯示了VICTR 48的序列(SEQ ID NO7)。
5.0詳細說明本文所用的本節標題僅用于組織目的而不能被解釋為限制所述對象的內容。本申請引用的所有參考在此特別引入作為用于任何目的的參考。
在本申請中，除非特別聲明，單數的使用包含了復數。在本申請中，除非特別聲明，“或”的使用意指“和/或”。此外，術語“包含”，還有其它形式，如“包括”，的使用，不具限制意義。在多個實施方案中，可以用標準技術進行重組DNA、寡核苷酸合成、組織培養、轉化和轉染。在多個實施方案中，可依據制造商說明書或依據本領域內的常規成熟技術或依據本文所述技術進行酶促反應和純化技術。在多個實施方案中，通常可以按照本領域內已知的常規方法，也可以按照本說明書各處引用和討論的各種一般性的和較具體的參考文獻所述，和/或按照本領域內技術人員所知的方法實施技術和程序。見，例如，Sambrook等.Molecular CloningALaboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1989).
在某些實施方案中，提供了在哺乳動物生物學意義上鑒別遺傳編碼的生物序列(包括，但不限于，蛋白質、多肽、氨基酸序列，多核苷酸和核苷酸序列)的生理作用的方法。在某些實施方案中，提供了培養和處理真核細胞的方法以產生具有確定的基因組插入/突變的遺傳改造的真核細胞克隆。本方法所用的真核細胞，在多個實施方案中，包括但不限于昆蟲細胞(包括但不限于黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)細胞)，線蟲(C.elegans)細胞，嚙齒類動物細胞(包括但不限于小鼠細胞、大鼠細胞和倉鼠細胞)，雞細胞，靈長類細胞，(包括但不限于猴細胞和人細胞)。在某些實施方案中，用非特異性插入突變對細胞進行遺傳改造。在某些實施方案中，提供了培養和處理小鼠ES細胞的方法以產生具有確定的基因組插入/突變的遺傳改造的ES細胞克隆。
在某些實施案方中，方法不包括某些昂貴的和/或費時的處理步驟。在某些實施方案中，方法可以適用于突變的真核細胞，包括但不限于，突變的小鼠ES細胞的工業化生產。
某些實施方案涉及培養、產生和鑒別突變的真核細胞，包括但不限于小鼠ES細胞的方法。在某些實施方案中，突變的真核細胞可以被用于產生能進行插入的突變等位基因的種系傳遞的生物。在某些實施方案中，突變的小鼠ES細胞被用于產生能進行插入的突變等位基因的種系傳遞的小鼠。
在某些實施方案中，基因誘捕是使用DNA作為誘變劑的隨機插入誘變方法。在某些實施方案中，DNA最初被作為逆轉錄病毒引入，其在細胞內被逆轉錄以生成起誘變劑作用的DNA前病毒。在某些實施方案中，DNA的一部分編碼可選擇標記。在某些實施方案中，基因誘捕構建體整合入一個基因的內含子或外顯子中。在某些實施方案中，基因誘捕構建體被設計為優選整合入內含子和/或外顯子中。在多個實施方案中，整合入內含子或外顯子后，細胞的剪接器將構建體編碼序列剪接成一個或多個共轉錄在相同mRNA上的內源序列。在某些實施方案中，基因誘捕構建體包含編碼可選擇標記的序列。在某些實施方案中，剪接受體序列處于編碼可選擇標記的序列之前。在某些實施方案中，啟動子不處于編碼可選擇標記的序列之前。在某些實施方案中，細胞的剪接器將內源序列從被誘捕的基因剪接到編碼可選擇標記的序列的5’端。在某些實施方案中，可選擇標記只在編碼可選擇標記的基因誘捕構建體整合入內含子時才被表達。在某些實施方案中，可選擇標記只在編碼可選擇標記的基因誘捕構建體整合入外顯子時才被表達。在某些實施方案中，例如，當可選擇標記基因編碼抗生素抗性時，可以在培養物中選擇以表達可選擇標記的方式將基因誘捕構建體整合到它們基因組內的細胞。
示范性的真核細胞插入突變述于，例如，Friedrich和Soriano，1991，Genes Dev.5(9)1513-23；Friedrich和Soriano，1993，Methods Enzymol.1993；225681-701；PCT
發明者G·漢森, A·阿武因, B·贊布羅維奇, C·J·弗里德勒, W·P·登普西 申請人:萊克康遺傳公司