專利名稱：一株紅平紅球菌及其在原油脫硫中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株紅球菌及其脫除化石燃料中有機硫的方法，具體地說，尤其涉及一株紅平紅球菌及其在原油脫硫中的應用。
背景技術：
化石燃料煤和石油中所含有的有機硫和無機硫是環境的重要污染源，這些硫化物燃燒時排放出大量的二氧化硫等毒性氣體，由此轉化成的大面積酸雨嚴重污染大氣和水源，破壞生態平衡，危害人類生存。有關資料披露中國的SO2排放量約占世界15％左右，是僅次于美國、原蘇聯而居世界第三位的SO2的排放大國。日本SO2年排放量僅為中國SO2排放量的1/15。為減少污染，世界各國對含硫量高的化石燃料的開采都有嚴格的規定。多年的持續開發使得現存含硫量低的化石燃料越來越少。隨著能源危機的逐步加劇，高硫化石燃料的開采成為必然。高硫化石燃料必須預先經過脫硫處理才能進一步使用。物理的和化學的脫硫方法成本巨大，而微生物脫硫工藝由于操作壓力、溫度低，運轉成本少，具有廣闊的前景。為了保護環境，要求使用低硫含量的化石燃料。目前世界上低硫含量的化石燃料儲備正在急劇減少，需要對含硫高的化石燃料進行脫硫處理。隨著汽車排放控制新技術的發展和應用，以及對燃油質量的深入研究，國際上對燃料油的硫含量要求越來越嚴格。隨著汽車工業的發展和環保要求日益嚴格，國產燃油質量問題越來越引起社會的關注。我國政府把控制汽車尾氣排放分三個階段，第一階段從1999年到2003年，新車要達到歐1排放標準，第二階段從2004年開始，新車要達到歐2排放標準，第三階段2010年將和國際同步。1993年歐洲標準的汽油硫含量要求不大于0.1％，我國新標準規定不大于0.08％。因此要使我國燃油質量與國際接軌，還要做大量的工作。
化學脫硫方法—加氫脫硫(Hydrodesulfurization，HDS)通過催化過程，將有機硫轉化成H2S氣體，反應是在1～20Mpa的壓力和290～450℃的溫度下進行的。由于對化石燃料中的硫含量有嚴格規定，再加上HDS方法耗費比較高，而且難以脫去化石燃料中的有機硫，而生物催化法脫硫(Biodesulfurization，BDS)成本低，在常溫下即可進行，并且具有高專一性，這使得BDS方法成為一種可供選擇的方法。現在國際上比較接受的觀點是生物脫硫可以作為常規加氫脫硫一個補充及下游精制技術。
原油中的硫含量相差很大，其中主要是有機硫，也存在少量元素硫、H2S、FeS2等溶解或懸浮在油中。有機硫化物包括硫醇、硫化物及含硫的雜環化合物如噻吩等。原油中的硫醇大部分是低分子量的，在石油的煉制過程中被除去，200℃以上沸點的石油產品中幾乎很少存在。脂肪族硫化物是沸點200℃以上石油產品如柴油中硫化物的主要成分，芳香族硫化物在較重的餾分中含量較低。雖然噻吩在原油中很少見，但噻吩的衍生物很多。苯噻吩、二苯噻吩、萘噻吩是高硫原油的重要組成，這些硫化物與長鏈脂肪烴有機的結合在一起。很難在下一步的加氫脫硫中去除，也是現使用的燃料油中主要的含硫化合物。
現在原油冶煉行業中都是把原油分成各種組分后再分別加氫脫硫，這也造成了整個脫硫成本的提高。如果能在原油冶煉前把原油的硫含量降低到一個比較低的水平這也可以減輕下游處理的壓力，節約加氫脫硫的成本。另一個方面，現在我國大量油田進入了開采的后期，必須使用各種手段提高原油的開采率，注水驅油是國內現在大量使用的一個方法。1995年統計，我國老油田中就有87％的油井采用注水驅油，到2004年我國老油田中開采的大部分原油中含水量超過80％，有些油井甚至超過90％。如此高的含水量雖然提高了原油下一步處理的費用，但是也為生物法處理原油創造了條件。因為含有如此高的水分，就解決了長期困擾生物脫硫的一個難題——必須提供較高比例的水相體系來保證生物催化劑的存活問題。
化石燃料中的有機硫主要是噻吩(Thiophene，T)、苯并噻吩(Benzothiophene，BT)、二苯并噻吩(Dibenzothiophene，DBT)以及含有更多苯環的含硫化合物等，生物脫有機硫的研究主要是以較為簡單的DBT為模式化合物來進行。現在已經發現許多微生物，如紅球菌屬(Rhodococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、分支桿菌屬(Mycobacterium)和節桿菌屬(Arthrobacter)等，能夠沿著硫專一途徑降解DBT。它們不打開這些含硫化合物的苯環結構，因而保留了燃料的熱值，具有較大的應用前景，成為近年來研究的熱點。

發明內容
針對現有技術中，脫除原油中有機硫的方法的不足，本發明要解決的問題是提供一株紅平紅球菌，以及利用紅平紅球菌休止細胞在原油脫硫中應用，所述應用的方法是基于現在國內原油開采的現狀提出的使用生物法脫除原油中有機硫的方法。
本發明提供的一株能夠專一性降解DBT生成不破壞碳架的終產物2-羥基聯苯的菌株，經過鑒定確認為紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)。該菌株于2005年6月20日保藏于中國典型培養物保藏中心(武漢大學，中國武漢)，保藏中心編號為M205068。
上述紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068經德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany)鑒定，具有如下生物學特征紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCCM205068生長初期形成短的分支菌絲體，然后分化成球菌及棒桿菌的形態；菌落有光澤，從奶白色逐漸變為粉紅色；使用氣相色譜分析碳鏈長度為32到44的分支菌酸，發現其與分支菌酸數據庫中的紅平紅球菌的分支菌酸類型相似；所述紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)CCTCC M205068的脂肪酸類型為無分支，含有飽和及不飽和脂肪酸，同時還含有結核菌脂酸，與數據庫中的紅平紅球菌脂肪酸類型有86.5％的同源性。
上述紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068的16S rDNA基因序列長度為1413個堿基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068的培養溫度為25～37℃，可以在基本無機鹽培養基上以有機含硫化合物如噻吩類化合物作為唯一硫源生長，也可以在LB培養基上生長。
本發明涉及的紅平紅球菌在原油脫硫中的應用，其脫硫方法涉及的步驟順序如下
(1)菌種選擇選用紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068；(2)斜面培養將菌種接種于含有質量體積比為1.5～2.0％的瓊脂并加有質量體積比為0.003～0.01％的二苯并噻吩(DBT)的固體斜面無機鹽基本培養基上，25～37℃條件下，靜止培養24～48小時；(3)種子培養將步驟(2)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接1～2環于20～100mL含有質量體積比為0.003～0.01％的二苯并噻吩的液體無機鹽基本培養基中，25℃～37℃條件下，振蕩培養24～48小時，制得種子液；(4)擴大培養以5～10％的體積比的接種量，將種子液接種于100～1000mL含有質量體積比為0.003～0.01％的二苯并噻吩液體無機鹽基本培養基中，25～37℃條件下，振蕩培養24～42小時；(5)收集細胞取步驟(4)所得的培養液5,000轉/每分鐘離心10～15分鐘，收集沉淀細胞，使用pH7.0磷酸緩沖液重懸細胞，再以相同的條件離心，重復2～3次，收集沉淀細胞；(6)休止細胞制備使用如步驟(5)的磷酸緩沖液重懸沉淀細胞，使菌體濃度達到10～30克干細胞/升，此細胞懸濁液即為制備好的紅平紅球菌休止細胞懸濁液，也稱生物催化劑；(7)處理樣品在反應體系中(100～1000mL)，以步驟(6)所得的休止細胞懸濁液作為水相，加入原油，使原油與水相的體積比為1∶10～20，在25～37℃條件下，250轉/每分鐘振蕩48～72小時，進行樣品處理；(8)分離樣品以10,000轉/每分鐘離心5～10分鐘分離步驟(7)中處理后的樣品，得到上層原油樣品；(9)樣品檢測取1～5μL步驟(8)中的原油樣品，使用硫氮元素分析儀測定原油中殘留的硫含量，然后對照未處理的樣品硫含量，得出經紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)CCTCC M205068處理的原油脫除率。
其中，步驟(2)、(3)、(4)中所述的菌體培養溫度優選是28～32℃；二苯并噻吩(DBT)的濃度優選為0.005～0.01％。
其中，步驟(3)、(4)中所述的菌體培養時間優選是36～42小時。
其中，步驟(6)中所述的生物催化劑的菌體濃度優選是每升12～18克干細胞重的菌體；其中，步驟(7)所述原油與水相的體積比例優選為1∶15～20。
其中，步驟(7)中處理樣品的溫度優選為28～35℃，樣品振蕩時間優選為60～72小時。
其中，步驟(7)中處理樣品時也可額外添加質量體積百分比濃度為2～5％的葡萄糖。
在上述利用紅平紅球菌休止細胞脫除原油中有機硫的方法中，菌株培養使用液體基本無機鹽培養基(Basal Salts Medium，BSM)，配方為甘油4克/升，KH2PO42.44克/升，Na2HPO414.04克/升，NH4Cl 2克/升，質量百分比為1％的CaCl2100微升/升，質量百分比為10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，質量百分比為1％的FeCl3100微升/升，維生素混合液200毫升/升的，離子混合液5毫升/升。121℃條件下滅菌20分鐘。
以0.003～0.01％的DBT作為硫源。
上述固體斜面基本無機鹽培養基為上述液體無機鹽培養基成分添加質量體積百分比濃度為1.6％的瓊脂粉。
上述的離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4.2·H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。
上述的維生素混合液的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
上述LB培養基配方如下，1升蒸餾水中含10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，固體LB培養基在上述配方的基礎上加入質量體積比為1.6％的瓊脂粉，121℃條件下滅菌20分鐘。
利用本發明所述的紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068可以降解3-甲基苯并噻吩(3-MBT)，DBT，4-甲基二苯并噻吩(4-MDBT)，4，6-二甲基二苯并噻吩(4，6-DMDBT)及萘噻吩(BNT)(如圖1，圖2，圖3所示)，生成相應的不破壞碳架結構的產物，具有較大的應用前景。
本發明采用紅平紅球菌休止細胞作為生物催化劑，能夠有效地脫除原油中的含硫有機化合物。使用GC-PFPD(氣相色譜—脈沖式火焰光度檢測器)測定休止細胞處理前后的原油中的含硫化合物的變化。其總硫含量使用Antek7000硫氮元素分析儀(美國，Antek公司產品)進行分析測定為3,210ppm。圖4所示的是經過休止細胞處理之后，GC-PFPD測定原油中的含硫化合物的分布情況，此時總硫含量為1,210ppm。處理前后含硫化合物的比較，可以明顯看出經過休止細胞處理之后，原油中的大部分可檢測到的含硫化合物，如噻吩類，二苯并噻吩類及更加復雜的含硫化合物都基本脫除，起到了很好的脫硫效果。例如在30℃條件下，使用本發明所述的紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)CCTCC M205068休止細胞可將硫含量為3,210ppm的原油中的硫，降低到1,210ppm，脫除率達到了62.3％。
根據文獻和專利檢索，Setti等人1992年報道采用一株能降解烷烴的假單胞菌降解重油中的硫化合物，但是脫硫的過程也造成了烷烴的損失。Fedorak等人在1984年采用混合菌處理原油，也造成了烷烴的損失。生物脫硫模式菌株紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)ATCC 53968也進行了原油脫硫的試驗，但是發現處理前后對原油總硫含量沒有明顯的變化，即沒有明顯的脫硫效果。
本發明的紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068是一個專一性降解含硫化合物的菌，不損失燃燒值。處理原油結果發現有明顯的脫硫效果，本菌株具有重要的實際應用價值。
進一步利用本發明所述的紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068的休止細胞將硫含量為1,236ppm的粘度較大的原油進行處理。72小時后，原油硫含量為653ppm，脫除率為47.2％；


本發明提供的一株紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)，于2005年6月20日保藏于中國典型微生物菌種保藏中心，保藏地址湖北省武漢市武漢大學，郵政編碼430072，其保藏編號為CCTCC M205068。
圖1使用氣相-質譜連用技術分析紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCCM205068降解模式化合物DBT及其產物的結構。
其中A2-羥基聯苯；B二苯并噻吩；C二苯并噻吩砜。
圖2使用氣相-質譜連用技術分析紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCCM205068降解復雜含硫模式化合物萘噻吩及其產物的結構。
其中Aα-羥基-β-苯基-萘；B萘噻吩；C萘噻吩砜。
圖3紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068降解各種原油中含硫模式化合物的途徑分析。
其中a二苯并噻吩的代謝分析；b 4-甲基二苯并噻吩的途徑分析；c 4，6-二甲基-二二苯并噻吩途徑分析；d萘噻吩途徑分析；e 3-甲基苯并噻吩途徑分析。
圖4使用GC-PFPD檢測休止細胞處理前后，原油中的含硫化合物的變化。
其中圖空白是處理之前的原油含硫化合物的色譜圖，圖樣品是處理之后的原油含硫化合物的色譜圖。
具體實施例方式
實施例1紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068菌株的篩選取油田附近或者煉油廠附近被污染過的各種土壤。各稱取5克上述的土壤加入50mL含有質量體積比為0.01％的二苯并噻吩的液體無機鹽基本培養基中，30℃，轉速250轉/每分鐘條件下震蕩培養48小時，然后以10％的體積比的接種量接種新的含有質量體積比為0.01％的二苯并噻吩的液體無機鹽基本培養基中，30℃，轉速250轉/每分鐘條件下，震蕩培養48小時，再繼續轉接，重復這一過程3～5次。將培養的菌液稀釋1,000,000倍涂布含有質量體積比為1.6％的瓊脂并加有質量體積比為0.01％的二苯并噻吩的固體無機鹽基本培養基上，30℃條件下靜止培養72小時。選取長出的單菌落繼續接種50mL含有質量體積比為0.01％的二苯并噻吩的液體無機鹽基本培養基中，30℃，轉速250轉/每分鐘條件下，震蕩培養48小時，篩選能夠利用二苯并噻吩作為唯一硫源生長的菌株，最終獲得一株降解能力較好的菌株，即紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)CCTCC M205068，經過穩定性實驗表明該菌株具有非常高的穩定性，連續培養后降解二苯并噻吩的能力沒有降低。
該菌株生長初期形成短的分支菌絲體，然后分化成球菌及棒桿菌的形態；菌落有光澤，從奶白色逐漸變為粉紅色；使用氣相色譜分析碳鏈長度為32到44的分支菌酸，發現其與分支菌酸數據庫中的紅平紅球菌的分支菌酸類型相似；所述紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068的脂肪酸類型為無分支，含有飽和及不飽和脂肪酸，同時還含有結核菌脂酸。其最適生長溫度在30℃。
上述菌株培養使用液體基本無機鹽培養基(Basal Salts Medium，BSM)，配方為甘油4克/升，KH2PO42.44克/升，Na2HPO414.04克/升，NH4Cl 2克/升，質量百分比為1％的CaCl2100微升/升，質量百分比為10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，質量百分比為1％的FeCl3100微升/升，維生素混合液200毫升/升的，離子混合液5毫升/升。121℃條件下滅菌20分鐘。
固體基本無機鹽培養基為上述液體無機鹽培養基成分添加質量體積百分比為1.6％的瓊脂粉。
上面所述的離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O 0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl120mmol/L。
上面所述的維生素混合物的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mgVB12(Cyanocobalamin)。
實施例2上述紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068菌株16SrDNA基因的提取培養5ml的細菌培養物至飽和狀態，取1.5ml培養物，6000轉/每分鐘離心2分鐘；沉淀物加入565μl的TE緩沖液，TE緩沖液配方如下10mmol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)、1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、用鹽酸調整pH為8.0，用吸管反復吹打使之重懸，加入30μl質量體積比為10％的十二烷基磺酸鈉(SDS)和5μl 20mg/mL的蛋白酶K，混勻，于37℃溫育1小時；加入100μl，5mol/L NaCl，充分混勻，再加入80μl的CTAB/NaCl溶液，所述CTAB/NaCl溶液配方如下質量體積比為10％的十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)溶解于0.7mol/L的NaCl中，混勻，于65℃溫育10分鐘；加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，12000轉/每分鐘離心5分鐘，將上清液轉入一個新管中；加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，12000轉/每分鐘離心5分鐘，將上清轉入一支新管中；加入0.6倍體積異丙醇，輕輕混勻直到DNA沉淀下來，用一個封口的離心管將沉淀轉移至1ml的70％乙醇中洗滌；12000轉/每分鐘離心5分鐘，棄上清，用凍干機稍加干燥，重溶于50μl的TE緩沖液。以提取的基因組DNA為模板，利用購自上海博亞生物技術有限公司的真細菌引物27f和1492r，進行PCR擴增，在50μl反應體系依次混勻下列試劑35μl H2O，5μl 10倍濃度的PCR反應緩沖液，10倍濃度的PCR反應緩沖液配方如下500mmol/L的KCl、30mmol/L的二硫蘇糖醇(DTT)、100mmol/L的用鹽酸調整pH為8.8的Tris緩沖液、1mg/ml的牛血清白蛋白、15mmol/L的MgCl2，4μl 25mmol/L MgCl2，1μl 4種dNTP的混合物，0.5μl上游引物，0.5μl下游引物，0.5μl模板DNA即上述紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCCM205068的基因組DNA，0.5μl Taq DNA聚合酶，混勻后離心5秒鐘。加入50μl礦物油再離心5秒鐘；將混合物在94℃加熱5分鐘。94℃變性1分鐘，50℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，總共30個循環。最后一個循環后，于72℃下保溫10分鐘，使反應混合物擴增充分，得到紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068的16S rDNA的PCR擴增產物，將產物測序。
測序結果紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068菌株16S rDNA基因序列長度為1413bp，核苷酸序列如下ccctgacgaa cgctggcggc gtgcttaaca catgcaagtc gagcggtaag gcctttcggg60gtacacgagc ggcgaacggg tgagtaacac gtgggtgatc tgccctgcac ttcgggataa 120gcctgggaaa ctgggtctaa taccggatat gacctcctat cgcatggtgg gtggtggaaa 180gatttatcgg tgcaggatgg gcccgcggcc tatcagcttg ttggtggggt aatggcctac 240caaggcgacg acgggtagcc gacctgagag ggtgaccggc cacactggga ctgagacacg 300gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcga aagcctgatg 360cagcgacgcc gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa acctctttca gcagggacga 420agcgcaagtg acggtacctg cagaagaagc accggctaac tacgtgccag cagccgcggt 480aatacgtagg gtgcaagcgt tgtccggaat tactgggcgt aaagagttcg taggcggttt 540gtcgcgtcgt ttgtgaaaac cagcagctca actgctggct tgcaggcgat acgggcagac 600ttgagtactg caggggagac tggaattcct ggtgtagcgg tgaaatgcgc agatatcagg 660aggaacaccg gtggcgaagg cgggtctctg ggcagtaact gacgctgagg aacgaaagcg 720tgggtagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacggtg ggcgctaggt 780gtgggttcct tccacggaat ccgtgccgta gctaacgcat taagcgcccc gcctggggag 840tacggccgca aggctaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggcggagcat 900gtggattaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctgggt ttgacatata ccggaaagct 960gcagagatgt ggcccccctt gtggtcggta tacaggtggt gcatggctgt cgtcagctcg 1020tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccctatctta tgttgccagc 1080acgttatggt ggggactcgt aagagactgc cggggtcaac tcggaggaag gtggggacga 1140cgtcaagtca tcatgcccct tatgtccagg gcttcacaca tgctacaatg gccagtacag 1200agggctgcga gaccgtgagg tggagcgaat cccttaaagc tggtctcagt tcggatcggg 1260gtctgcaact cgaccccgtg aagtcggagt cgctagtaat cgcagatcag caacgctgcg 1320gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcacg tcatgaaagt cggtaacacc 1380cgaagccggt ggcttaaccc cttgtgggag gga 1413實施例3利用紅平紅球菌休止細胞脫除原油中有機硫的方法，其中加入的原油與水相的體積比為1∶10，處理溫度為25℃本發明利用紅平紅球菌在原油脫硫中的應用，其脫硫方法涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇選用紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068；(2)斜面培養將菌種接種于含有質量體積比為1.6％的瓊脂并加有質量體積比為0.005％的二苯并噻吩的固體斜面無機鹽基本培養基上，25℃條件下，靜止培養42小時；(3)種子培養將步驟(2)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接2環于100mL含有質量體積比為0.005％的二苯并噻吩的液體無機鹽基本培養基中，25℃條件下，振蕩培養40小時，制得種子液；(4)擴大培養以10％的體積比的接種量，將種子液接種于100mL含有質量體積比為0.005％的二苯并噻吩液體無機鹽基本培養基中，25℃條件下，振蕩培養42小時；(5)收集細胞取步驟(4)所得的培養液5,000轉/每分鐘離心15分鐘，收集沉淀細胞，使用pH7.0磷酸緩沖液重懸細胞，再以相同的條件離心，重復2次，收集沉淀細胞；(6)休止細胞制備使用如步驟(5)的磷酸緩沖液重懸沉淀細胞，使菌體濃度達到25克干細胞/升，此細胞懸濁液即為制備好的紅平紅球菌休止細胞懸濁液，也稱生物催化劑；(7)處理樣品在100mL的反應體系中，以步驟(6)所得的休止細胞懸濁液作為水相，加入原油，使原油與水相的體積比為1∶10，在25℃條件下，250轉/每分鐘振蕩48小時，進行樣品處理；(8)分離樣品以10,000轉/每分鐘離心10分鐘分離步驟(7)中處理后的樣品，得到上層原油樣品；(9)樣品檢測取1μL步驟(8)中的原油樣品，使用Antek7000硫氮元素分析儀(美國，Antek公司產品)測定原油中殘留的硫含量，然后對照未處理的樣品硫含量，得出經紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068處理的原油脫除率為22.7％；在上述利用紅平紅球菌休止細胞脫除原油中有機硫的方法中，菌株培養使用液體基本無機鹽培養基(Basal Salts Medium，BSM)，配方為甘油4克/升，KH2PO42.44克/升，Na2HPO414.04克/升，NH4Cl 2克/升，質量百分比為1％的CaCl2100微升/升，質量百分比為10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，質量百分比為1％的FeCl3100微升/升，維生素混合液200毫升/升的，離子混合液5毫升/升。121℃條件下滅菌20分鐘。
以0.005％的DBT作為硫源。
上述固體斜面基本無機鹽培養基為上述液體無機鹽培養基成分添加質量體積百分比為1.6％的瓊脂粉。
上述的離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。
上述的維生素混合液的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
實施例4利用紅平紅球菌休止細胞脫除原油中有機硫的方法，其中加入的原油與水相的體積比為1∶20，處理溫度為30℃本發明利用紅平紅球菌在原油脫硫中的應用，其脫硫方法涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇選用紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068；(2)斜面培養將菌種接種于含有質量體積比為1.6％的瓊脂并加有質量體積比為0.01％的二苯并噻吩的固體斜面無機鹽基本培養基上，28℃條件下，靜止培養42小時；(3)種子培養將步驟(2)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接2環于100mL含有質量體積比為0.01％的二苯并噻吩的液體無機鹽基本培養基中，28℃條件下，振蕩培養36小時，制得種子液；
(4)擴大培養以10％的體積比的接種量，將種子液接種于100mL含有質量體積比為0.01％的二苯并噻吩液體無機鹽基本培養基中，28℃條件下，振蕩培養36小時；(5)收集細胞取步驟(4)所得的培養液5,000轉/每分鐘離心15分鐘，收集沉淀細胞，使用pH7.0磷酸緩沖液重懸細胞，再以相同的條件離心，重復2次，收集沉淀細胞；(6)休止細胞制備使用如步驟(5)的磷酸緩沖液重懸沉淀細胞，使菌體濃度達到16克干細胞/升，此細胞懸濁液即為制備好的紅平紅球菌休止細胞懸濁液，也稱生物催化劑；(7)處理樣品在100mL的反應體系中，以步驟(6)所得的休止細胞懸濁液作為水相，加入原油，使原油與水相的體積比為1∶20，在30℃條件下，250轉/每分鐘振蕩65小時，額外添加質量體積比為2％的葡萄糖，進行樣品處理；(8)分離樣品以10,000轉/每分鐘離心10分鐘分離步驟(7)中處理后的樣品，得到上層原油樣品；(9)樣品檢測取1μL步驟(8)中的原油樣品，使用Antek7000硫氮元素分析儀(美國，Antek公司產品)測定原油中殘留的硫含量，然后對照未處理的樣品硫含量，得出經紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068處理的原油脫除率為43.7％；在上述利用紅平紅球菌休止細胞脫除原油中有機硫的方法中，菌株培養使用液體基本無機鹽培養基(Basal Salts Medium，BSM)，配方為甘油4克/升，KH2PO42.44克/升，Na2HPO414.04克/升，NH4Cl 2克/升，質量百分比為1％的CaCl2100微升/升，質量百分比為10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，質量百分比為1％的FeCl3100微升/升，維生素混合液200毫升/升的，離子混合液5毫升/升。121℃條件下滅菌20分鐘。
以0.01％的DBT作為硫源。
上述固體斜面基本無機鹽培養基為上述液體無機鹽培養基成分添加質量體積百分比為1.6％的瓊脂粉。
上述的離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。
上述的維生素混合液的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
實施例5利用紅平紅球菌休止細胞脫除原油中有機硫的方法，其中加入的原油與水相的體積比為1∶20，處理溫度為30℃本發明利用紅平紅球菌在原油脫硫中的應用，其脫硫方法涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇選用紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068；(2)斜面培養將菌種接種于含有質量體積比為1.6％的瓊脂并加有質量體積比為0.01％的二苯并噻吩的固體斜面無機鹽基本培養基上，30℃條件下，靜止培養42小時；
(3)種子培養將步驟(2)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接2環于100mL含有質量體積比為0.01％的二苯并噻吩的液體無機鹽基本培養基中，30℃條件下，振蕩培養42小時，制得種子液；(4)擴大培養以10％的體積比的接種量，將種子液接種于100mL含有質量體積比為0.01％的二苯并噻吩液體無機鹽基本培養基中，30℃條件下，振蕩培養36小時；(5)收集細胞取步驟(4)所得的培養液5,000轉/每分鐘離心15分鐘，收集沉淀細胞，使用pH7.0磷酸緩沖液重懸細胞，再以相同的條件離心，重復2次，收集沉淀細胞；(6)休止細胞制備使用如步驟(5)的磷酸緩沖液重懸沉淀細胞，使菌體濃度達到18克干細胞/升，此細胞懸濁液即為制備好的紅平紅球菌休止細胞懸濁液，也稱生物催化劑；(7)處理樣品在100mL的反應體系中，以步驟(6)所得的休止細胞懸濁液作為水相，加入原油，使原油與水相的體積比為1∶20，在30℃條件下，250轉/每分鐘振蕩72小時，額外添加質量體積比為5％的葡萄糖，進行樣品處理；(8)分離樣品以10,000轉/每分鐘離心10分鐘分離步驟(7)中處理后的樣品，得到上層原油樣品；(9)樣品檢測取1μL步驟(8)中的原油樣品，使用Antek7000硫氮元素分析儀(美國，Antek公司產品)測定原油中殘留的硫含量，然后對照未處理的樣品硫含量，得出經紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068處理的原油脫除率為63.2％；在上述利用紅平紅球菌休止細胞脫除原油中有機硫的方法中，菌株培養使用液體基本無機鹽培養基(Basal Salts Medium，BSM)，配方為甘油4克/升，KH2PO42.44克/升，Na2HPO414.04克/升，NH4Cl 2克/升，質量百分比為1％的CaCl2100微升/升，質量百分比為10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，質量百分比為1％的FeCl3100微升/升，維生素混合液200毫升/升的，離子混合液5毫升/升。121℃條件下滅菌20分鐘。
以0.01％的DBT作為硫源。
上述固體斜面基本無機鹽培養基為上述液體無機鹽培養基成分添加質量體積百分比為1.6％的瓊脂粉。
上述的離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。
上述的維生素混合液的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
實施例6利用紅平紅球菌休止細胞脫除原油中有機硫的方法，其中加入的原油與水相的體積比為1∶15，處理溫度為35℃本發明利用紅平紅球菌在原油脫硫中的應用，其脫硫方法涉及的步驟順序如下
(1)菌種選擇選用紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068；(2)斜面培養將菌種接種于含有質量體積比為1.6％的瓊脂并加有質量體積比為0.008％的二苯并噻吩的固體斜面無機鹽基本培養基上，32℃條件下，靜止培養48小時；(3)種子培養將步驟(2)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接2環于100mL含有質量體積比為0.008％的二苯并噻吩的液體無機鹽基本培養基中，32℃條件下，振蕩培養48小時，制得種子液；(4)擴大培養以10％的體積比的接種量，將種子液接種于100mL含有質量體積比為0.008％的二苯并噻吩液體無機鹽基本培養基中，32℃條件下，振蕩培養28小時；(5)收集細胞取步驟(4)所得的培養液5,000轉/每分鐘離心15分鐘，收集沉淀細胞，使用pH7.0磷酸緩沖液重懸細胞，再以相同的條件離心，重復2次，收集沉淀細胞；(6)休止細胞制備使用如步驟(5)的磷酸緩沖液重懸沉淀細胞，使菌體濃度達到12克干細胞/升，此細胞懸濁液即為制備好的紅平紅球菌休止細胞懸濁液，也稱生物催化劑；(7)處理樣品在100mL的反應體系中，以步驟(6)所得的休止細胞懸濁液作為水相，加入原油，使原油與水相的體積比為1∶15，在35℃條件下，250轉/每分鐘振蕩60小時，進行樣品處理；(8)分離樣品以10,000轉/每分鐘離心10分鐘分離步驟(7)中處理后的樣品，得到上層原油樣品；(9)樣品檢測取1μL步驟(8)中的原油樣品，使用Antek7000硫氮元素分析儀(美國，Antek公司產品)測定原油中殘留的硫含量，然后對照未處理的樣品硫含量，得出經紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068處理的原油脫除率為39.5％；在上述利用紅平紅球菌休止細胞脫除原油中有機硫的方法中，菌株培養使用液體基本無機鹽培養基(Basal Salts Medium，BSM)，配方為甘油4克/升，KH2PO42.44克/升，Na2HPO414.04克/升，NH4Cl 2克/升，質量百分比為1％的CaCl2100微升/升，質量百分比為10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，質量百分比為1％的FeCl3100微升/升，維生素混合液200毫升/升的，離子混合液5毫升/升。121℃條件下滅菌20分鐘。
以0.008％的DBT作為硫源。
上述固體斜面基本無機鹽培養基為上述液體無機鹽培養基成分添加質量體積百分比為1.6％的瓊脂粉。
上述的離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。
上述的維生素混合液的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
實施例7利用紅平紅球菌ATCC 53968休止細胞脫除原油中有機硫的方法，其中加入的原油與水相的體積比為1∶20，處理溫度為30℃；(1)菌種選擇紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)ATCC 53968〖該菌株保藏于美國典型微生物收藏中心(12301 Park Lawn Drive，Rockville，Md.20852)〗；(2)斜面培養將菌種接種于含有質量體積比為1.6％的瓊脂并加有質量體積比為0.01％的二苯并噻吩的固體斜面無機鹽基本培養基上，30℃條件下，靜止培養42小時；(3)種子培養將步驟(2)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接2環于100mL含有質量體積比為0.01％的二苯并噻吩的液體無機鹽基本培養基中，30℃條件下，振蕩培養42小時，制得種子液；(4)擴大培養以10％的體積比的接種量，將種子液接種于100mL含有質量體積比為0.01％的二苯并噻吩液體無機鹽基本培養基中30℃條件下，振蕩培養36小時；(5)收集細胞取步驟(4)所得的培養液5,000轉/每分鐘離心15分鐘，收集沉淀細胞，使用pH7.0磷酸緩沖液重懸細胞，再以相同的條件離心，重復2次，收集沉淀細胞；(6)休止細胞制備使用如步驟(5)的磷酸緩沖液重懸沉淀細胞，使菌體濃度達到18克干細胞/升。此細胞懸濁液即為制備好的紅平紅球菌休止細胞，也稱生物催化劑；(7)處理樣品在100mL的反應體系中，以步驟(6)所得的休止細胞懸濁液作為水相，加入原油，使原油與水相的體積比為1∶20，在30℃條件下，250轉/每分鐘振蕩72小時，額外添加質量體積比為5％的葡萄糖，進行樣品處理；(8)分離樣品以10,000轉/每分鐘離心10分鐘分離步驟(7)中處理后的樣品，得到上層原油樣品；(9)樣品檢測取1μL步驟(8)中的原油樣品，使用Antek7000硫氮元素分析儀(美國，Antek公司產品)測定原油中殘留的硫含量。對照未處理的樣品硫含量，得出原油脫除率為15.3％。
在上述利用紅平紅球菌休止細胞脫除原油中有機硫的方法中，菌株培養使用液體基本無機鹽培養基(Basal Salts Medium，BSM)，配方為甘油4克/升，KH2PO42.44克/升，Na2HPO414.04克/升，NH4Cl 2克/升，質量百分比為1％的CaCl2100微升/升，質量百分比為10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，質量百分比為1％的FeCl3100微升/升，維生素混合液200毫升/升的，離子混合液5毫升/升。121℃條件下滅菌20分鐘。
以0.01％的DBT作為硫源。
上述固體基本無機鹽斜面培養基為上述液體無機鹽培養基成分添加質量體積百分比1.6％的瓊脂粉。
上述的離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。
上面所述的維生素混合物的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
通過實施例7與實施例5的對比可以看到，紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068對原油的總硫含量達到62.3％的脫除率；同樣條件下紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)ATCC 53968對相同原油只有15.3％的脫除率，說明上述的紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068具有更好的處理效果，在實際應用比ATCC 53968具有更大的價值。
序列表SEQ ID NO.1<110>山東大學<120>一株紅平紅球菌及其在原油脫硫中的應用<141>2005-9-11<211>1413<212>DNA<213>紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)<221>紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068 16S rDNA<222>(1)…(1413)<400>
ccctgacgaa cgctggcggc gtgcttaaca catgcaagtc gagcggtaag gcctttcggg60gtacacgagc ggcgaacggg tgagtaacac gtgggtgatc tgccctgcac ttcgggataa 120gcctgggaaa ctgggtctaa taccggatat gacctcctat cgcatggtgg gtggtggaaa 180gatttatcgg tgcaggatgg gcccgcggcc tatcagcttg ttggtggggt aatggcctac 240caaggcgacg acgggtagcc gacctgagag ggtgaccggc cacactggga ctgagacacg 300gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcga aagcctgatg 360cagcgacgcc gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa acctctttca gcagggacga 420agcgcaagtg acggtacctg cagaagaagc accggctaac tacgtgccag cagccgcggt 480aatacgtagg gtgcaagcgt tgtccggaat tactgggcgt aaagagttcg taggcggttt 540gtcgcgtcgt ttgtgaaaac cagcagctca actgctggct tgcaggcgat acgggcagac 600ttgagtactg caggggagac tggaattcct ggtgtagcgg tgaaatgcgc agatatcagg 660aggaacaccg gtggcgaagg cgggtctctg ggcagtaact gacgctgagg aacgaaagcg 720tgggtagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacggtg ggcgctaggt 780gtgggttcct tccacggaat ccgtgccgta gctaacgcat taagcgcccc gcctggggag 840tacggccgca aggctaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggcggagcat 900gtggattaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctgggt ttgacatata ccggaaagct 960gcagagatgt ggcccccctt gtggtcggta tacaggtggt gcatggctgt cgtcagctcg 1020tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccctatctta tgttgccagc 1080acgttatggt ggggactcgt aagagactgc cggggtcaac tcggaggaag gtggggacga 1140cgtcaagtca tcatgcccct tatgtccagg gcttcacaca tgctacaatg gccagtacag 1200agggctgcga gaccgtgagg tggagcgaat cccttaaagc tggtctcagt tcggatcggg 1260gtctgcaact cgaccccgtg aagtcggagt cgctagtaat cgcagatcag caacgctgcg 1320gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcacg tcatgaaagt cggtaacacc 1380cgaagccggt ggcttaaccc cttgtgggag gga 141權利要求
1.一株紅平紅球菌，其特征在于該菌名為紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)，已于2005年6月20日保藏于中國典型微生物菌種保藏中心，其保藏編號為CCTCC M205068。
2.如權利要求1所述的紅平紅球菌，其特征是，生長初期形成短的分支菌絲體，然后分化成球菌及棒桿菌的形態；菌落有光澤，從奶白色逐漸變為粉紅色；分析碳鏈長度為32到44的分支菌酸，與分支菌酸數據庫中的紅平紅球菌的分支菌酸類型相似；所述紅平紅球菌的脂肪酸類型為無分支，含有飽和及不飽和脂肪酸，同時還含有結核菌脂酸，與數據庫中的紅平紅球菌脂肪酸類型有86.5％的同源性；所述紅平紅球菌的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。
3.如權利要求1或2所述的紅平紅球菌在原油脫硫中的應用。
4.如權利要求3所述的紅平紅球菌在原油脫硫中的應用，其脫硫方法涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇選用紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068；(2)斜面培養將菌種接種于含有質量體積比為1.5～2.0％的瓊脂并加有質量體積比為0.003～0.01％的二苯并噻吩的固體斜面無機鹽基本培養基上，25～37℃條件下，靜止培養24～48小時；(3)種子培養將步驟(2)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接1～2環于20～100mL含有質量體積比為0.003～0.01％的二苯并噻吩的液體無機鹽基本培養基中，25～37℃條件下，振蕩培養24～48小時，制得種子液；(4)擴大培養以5～10％的體積比的接種量，將種子液接種于100～1000mL含有質量體積比為0.003～0.01％的二苯并噻吩液體無機鹽基本培養基中，25～37℃條件下，振蕩培養24～42小時；(5)收集細胞取步驟(4)所得的培養液5,000轉/每分鐘離心10～15分鐘，收集沉淀細胞，使用pH 7.0磷酸緩沖液重懸細胞，再以相同的條件離心，重復2～3次，收集沉淀細胞；(6)休止細胞制備使用如步驟(5)的磷酸緩沖液重懸沉淀細胞，使菌體濃度達到10～30克干細胞/升，此細胞懸濁液即為制備好的紅平紅球菌休止細胞懸濁液，也稱生物催化劑；(7)處理樣品在反應體系中，以步驟(6)所得的休止細胞懸濁液作為水相，加入原油，使原油與水相的體積比為1∶10～20，在25～37℃條件下，250轉/每分鐘振蕩48～72小時，進行樣品處理；(8)分離樣品以10,000轉/每分鐘離心5～10分鐘分離步驟(7)中處理后的樣品，得到上層原油樣品；(9)樣品檢測取1～5μL步驟(8)中的原油樣品，使用硫氮元素分析儀測定原油中殘留的硫含量，然后對照未處理的樣品硫含量，得出經紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)CCTCC M205068處理的原油脫除率。
5.如權利要求4所述的紅平紅球菌在原油脫硫中的應用，其特征在于，步驟(2)、(3)、(4)中所述的菌體培養溫度是28～32℃；二苯并噻吩的濃度為0.005～0.01％。
6.如權利要求4所述的紅平紅球菌在原油脫硫中的應用，其特征在于，步驟(3)、(4)中所述的菌體培養時間是36～42小時。
7.如權利要求4所述的紅平紅球菌在原油脫硫中的應用，其特征在于，步驟(6)中所述的生物催化劑的菌體濃度是每升12～18克干細胞重的菌體。
8.如權利要求4所述的紅平紅球菌在原油脫硫中的應用，其特征在于，步驟(7)中所述的原油與水相的體積比例為1∶15～20。
9.如權利要求4所述的紅平紅球菌在原油脫硫中的應用，其特征在于，步驟(7)中處理樣品的溫度為28～35℃，樣品振蕩時間為60～72小時。
10.如權利要求4所述的紅平紅球菌在原油脫硫中的應用，其特征在于，步驟(7)中處理樣品時也可額外添加質量體積百分比濃度為2～5％的葡萄糖。
全文摘要
本發明公開了一株紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)，該菌株于2005年6月20日保藏于中國典型培養物保藏中心(武漢大學，中國武漢)，保藏中心編號為M205068。本發明還公開了所述的紅平紅球菌在原油脫硫中的應用，其脫硫方法包括(1)斜面培養，(2)種子培養，(3)擴大培養(4)收集菌體，(5)制備休止細胞，(6)處理原油樣品，(7)樣品檢測等步驟；該方法具有操作簡單，脫硫率高等特點，在石油煉制及大氣污染治理方面具有很大的應用前景。
文檔編號C12S1/00GK1766089SQ200510044599
公開日2006年5月3日 申請日期2005年9月14日 優先權日2005年9月14日
發明者許平, 馬翠卿, 于波, 李福利, 馮進輝, 蔡曉鳳, 劉曉勇, 王霞, 楊春玉, 陶飛, 王穎, 周文娟 申請人:山東大學