專利名稱：一種松樹萎蔫病病原線蟲的快速的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于森林病害檢測技術領域，具體地說是一種能對的松材線蟲和擬松材線蟲進行檢測的方法。
背景技術：
由松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)引起的松樹萎蔫病是一種毀滅性的森林病害，具有危害極其嚴重、蔓延速度快、防治困難等特點，一旦發(fā)生將給國民經(jīng)濟和生態(tài)環(huán)境造成極大的損失，現(xiàn)已成為我國林業(yè)生產(chǎn)上的頭號生物災難，其病原松材線蟲為我國對內對外的重要檢疫對象。由于缺乏較好的松樹萎蔫病發(fā)生后的應對措施，目前對于松樹萎蔫病的治理主要是通過清除傳染源和切斷傳染途徑來控制其傳播蔓延的速度，具體做法是在松樹萎蔫病發(fā)生區(qū)伐除病樹并銷毀防止擴散，在松樹萎蔫病未發(fā)生區(qū)則做好對內對外的檢疫工作防止傳入。上述兩項工作涉及的技術關鍵是林間病樹的診斷和松木制品中病原線蟲的檢測。
對于松樹萎蔫病的診斷和檢疫最直接、最有效的方法是快速準確的鑒定出病木或松木制品中的病原線蟲種類，長期以來松材線蟲的鑒定主要依靠形態(tài)學，尤其是對雌、雄成蟲某些特征的觀察。這種方法的優(yōu)點是簡便、直觀，存在的弊端是1.在松木材質中有眾多的線蟲，有些種類的線蟲形態(tài)特征與松材線蟲相似，特別松材線蟲的致病力較弱的近緣種擬松材線蟲(Bursaphelenchus mucronatus)，其形態(tài)與松材線蟲很容易混淆，使得鑒定的準確性完全依靠操作者的經(jīng)驗；2.松材線蟲在形態(tài)上有變異的情況存在，在實際操作時至少需要對雌、雄成蟲各10條以上進行觀察才能確診，費工、費時；3.形態(tài)學鑒定只適用于成蟲，不適宜幼蟲，而病木中的松材線蟲在很多情況下是以幼蟲的形式存在，使的該方法在實際應用中受到限制.。
近年來隨著分子生物學技術的發(fā)展，采用PCR技術對松材線蟲進行快速、準確鑒定已成為趨勢。松材線蟲PCR鑒定包含兩項關鍵技術，即PCR擴增技術和線蟲DNA制備技術。早期的PCR鑒定包括采用隨機引物擴增的RAPD-PCR技術和采用線蟲通用引物擴增后再對擴增產(chǎn)物進行限制性酶切的PCR-RFLP技術，線蟲DNA的制備多采用酚仿抽提法，它們的共同缺點是由于使用非松材線蟲專用的特異引物而造成鑒定的穩(wěn)定性和準確性不高，而且需要大量線蟲制備DNA，制備時間長。林茂松等發(fā)明的《松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法》(專利號ZL2003l0106109.5)提供一種松樹萎蔫病診斷的新方法，該方法采用三條特異引物對分離自松樹病木的單條線蟲進行PCR檢測，鑒定準確率高，自獲得線蟲分離液后8小時內可完成鑒定，大大提高了松樹萎蔫病的診斷效率。但由于采用了蛋白酶消化法提取單條線蟲的DNA，使得提取時間延長，同時在線蟲樣品在轉移過程中易丟失，增加了操作的難度。采用PCR反應中加入熒光探針的實時熒光PCR可以在每一輪循環(huán)時檢測熒光信號的強度，而不必等到PCR反應全部結束后才能檢測擴增結果，因此能大大縮短PCR擴增的時間。Cao等(Phytopathology 200595566-571)建立的松材線蟲實時熒光PCR檢測技術可以將獲得線蟲DNA樣品后的檢測時間縮短至1小時內。但該方法的完成必須依賴價格昂貴熒光實時PCR儀、檢測設備和試劑，因而使其應用受到限制。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供了一種快速、準確，且經(jīng)濟實用的松樹萎蔫病病原線蟲的PCR檢測方法。
本發(fā)明包括以下步驟(1)根據(jù)松材線蟲和擬松材線蟲的rDNA序列設計用于松材線蟲PCR檢測的一對引物BX15’-CGATGATGCGATTGGTGACTT-3’和BX25’-ATGCGAGACGACTGTCACAACG-3’，用于擬松材線蟲PCR檢測的一對引物BM15’-TTCTCAAGTTTCTGCATTTGTAAG-3’和BM25’-GGCGCGGTCGCACAATCGAG-3’。
(2)用于PCR檢測的單條線蟲DNA模板制備在一塊經(jīng)高壓滅菌并剪成2～4mm的方形定量濾紙上滴加2μl含有1.25mM dNTP和各15μM的特異引物BX1、BX2、BM1和BM2及的線蟲檢測液，晾干待用；在解剖鏡下從線蟲分離液中挑取一條線蟲入預先滴在載玻片的雙蒸水滴中清洗后，移至水滴外，待線蟲蟲體周圍的水接近完全干燥時，用鑷子取一塊已干燥的含線蟲檢測試劑的濾紙片覆蓋于線蟲蟲體上，鑷子輕按濾紙片將線蟲壓破，將濾紙片移入裝有15μl雙蒸水的0.2ml薄壁管中95℃加熱10min，冷卻至室溫，8000rpm離心30s得到單條線蟲DNA模板制備液。
(3)PCR擴增在步驟(2)得到的單條線蟲DNA模板制備液中加入2.5μl含1.5～2.0mM MgCl2的10×PCR buffer，1U Taq酶，補雙蒸水至25μl；置于PCR儀內進行擴增，經(jīng)優(yōu)化的擴增條件為預變性94℃2min；30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃45s，54～55℃60s，72℃60s；最后再72℃延伸10min。
(4)PCR產(chǎn)物檢測取5～10μl步驟(3)得到的PCR擴增產(chǎn)物進行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠在電泳結束經(jīng)溴化乙錠染色后在紫外透射儀下觀察，如檢測到一條分子量為501bp的電泳譜帶表明受檢線蟲為松材線蟲，如檢測到一條分子量為160bp的電泳譜帶表明受檢線蟲為擬松材線蟲。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，其優(yōu)點和積極效果表現(xiàn)在1.本發(fā)明采用了機械破碎和濾紙直接吸附的方法制備用于PCR擴增的單條線蟲DNA模板，無需蛋白酶消化和酚仿抽提，線蟲DNA的制備時間縮短到了15min之內，從而使從獲得線蟲分離液開始的整個鑒定過程在4小時內完成，同時在解剖鏡下將線蟲DNA吸附于濾紙上后便于觀察，不易發(fā)生線蟲DNA在轉移中丟失的情況，使得操作更為方便。
2.本發(fā)明用于PCR檢測的引物為根據(jù)松材線蟲和擬松材線蟲rDNA區(qū)的特異序列設計的專用引物，鑒定的穩(wěn)定性好、準確性高。
3.本發(fā)明采用普通PCR儀和常規(guī)試劑，檢測成本，利于推廣應用。
4.檢測的靈敏度高，單條線蟲制備的DNA足以完成檢測，可以對成蟲和幼蟲進行檢測。


圖1松材線蟲種群成蟲和幼蟲的擴增結果圖2擬松材線蟲種群成蟲和幼蟲的擴增結果.
圖3對不同來源的松材線蟲和擬松材線蟲種群的擴增結果具體實施方式
實施例一1.用于松材線蟲和擬松材線蟲檢測的特異引物的設計采用線蟲ITS通用引物擴增不同來源的2個松材線蟲和5個擬松材線蟲種群，獲得包含rDNA的ITS1、5.8S、ITS2區(qū)的擴增片段；雙脫氧終止法測定各擴增片段的DNA序列；所得的序列信息用DNASTAR 5.0軟件分析，找出松材線蟲和擬松材線蟲種群間的差異序列，根據(jù)差異序列利用primer Premier 5.0軟件設計松材線蟲的特異引物BX15’-CGATGATGCGATTGGTGACTT-3’和BX25’-ATGCGAGACGACTGTCACAACG-3’，擬松材線蟲的特異引物BM15’-TTCTCAAGTTTCTGCATTTGTAAG-3’和BM25’-GGCGCGGTCGCACAATCGAG-3’，其中BX1定位于rDNA的ITS1區(qū)，BX2位于rDNA的ITS2區(qū)，預期擴增片段為501bp；BM1和BM2定位于rDNA的ITS2區(qū)，預期擴增片段為160bp；DNA合成儀合成上述4條寡聚核苷酸引物。
2.用于單條線蟲PCR鑒定的DNA模板制備在一塊經(jīng)高壓滅菌并剪成4mm的方形定量濾紙上滴加2μl含有1.25mM dNTP和各15μM的特異引物BX1、BX2、M1和BM2的線蟲檢測液，晾干待用；在解剖鏡下從來源于廣東的松材線蟲分離液中挑取一條典型的成蟲入預先滴在載玻片的雙蒸水滴中清洗后，移至水滴外，待線蟲蟲體周圍的水接近完全干燥；用鑷子取已干燥的含線蟲檢測試劑的濾紙片覆蓋于線蟲蟲體上，鑷子輕按濾紙片將線蟲壓破，將濾紙片移入裝有15μl雙蒸水的0.2ml薄壁管中95℃加熱10min，冷卻至室溫，8000rpm離心30s得到單條線蟲DNA模板制備液。
3.病原線蟲的PCR特異擴增在單條線蟲DNA模板制備液中加入2.5μl含1.5mM MgCl2的10×PCR buffer，1U Taq酶，補雙蒸水至25μl；置于PCR儀內進行擴增，擴增條件為預變性94℃2min；30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃45s，55℃60s，72℃60s；最后再72℃延伸10min。
4.PCR產(chǎn)物檢測；取5μl的PCR擴增產(chǎn)物加入2μl 6×電泳上樣緩沖液，進行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳；電泳結束后凝膠塊用溴化乙錠染色后在紫外透射儀下觀察，檢測到一條分子量為501bp的電泳譜帶，表明受檢線蟲為松材線蟲(圖1、圖3)。
實施例二1.用于松材線蟲和擬松材線蟲檢測的特異引物的設計采用線蟲ITS通用引物擴增不同來源的2個松材線蟲和5個擬松材線蟲種群，獲得包含rDNA的ITS1、5.8S、ITS2區(qū)的擴增片段；雙脫氧終止法測定各擴增片段的DNA序列；所得的序列信息用DNASTAR 5.0軟件分析，找出松材線蟲和擬松材線蟲種群間的差異序列，根據(jù)差異序列利用primer Premier 5.0軟件設計松材線蟲的特異引物BX15’-CGATGATGCGATTGGTGACTT-3’和BX25’-ATGCGAGACGACTGTCACAACG-3’，擬松材線蟲的特異引物BM15’-TTCTCAAGTTTCTGCATTTGTAAG-3’和BM25’-GGCGCGGTCGCACAATCGAG-3’，其中BX1定位于rDNA的ITS1區(qū)，BX2位于rDNA的ITS2區(qū)，預期擴增片段為501bp；BM1和BM2定位于rDNA的ITS2區(qū)，預期擴增片段為160bp；DNA合成儀合成上述4條寡聚核苷酸引物。
2.用于單條線蟲PCR鑒定的DNA模板制備在一塊經(jīng)高壓滅菌并剪成2mm的方形定量濾紙上滴加2μl含有1.25mM dNTP和各15μM的特異引物BX1、BX2、M1和BM2的線蟲檢測液，晾干待用；在解剖鏡下從來源于江蘇的松材線蟲分離液中挑取一條典型的幼蟲入預先滴在載玻片的雙蒸水滴中清洗后，移至水滴外，待線蟲蟲體周圍的水接近完全干燥；用鑷子取已干燥的含線蟲檢測試劑的濾紙片覆蓋于線蟲蟲體上，鑷子輕按濾紙片將線蟲壓破，將濾紙片移入裝有15μl雙蒸水的0.2ml薄壁管中95℃加熱10min，冷卻至室溫，8000rpm離心30s得到單條線蟲DNA模板制備液。
3.病原線蟲的PCR特異擴增在單條線蟲DNA模板制備液中加入2.5μl含2.0mM MgCl2的10×PCR buffer，1U Taq酶，補雙蒸水至25μl；置于PCR儀內進行擴增，擴增條件為預變性94℃2min；30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃45s，54℃60s，72℃60s；最后再72℃延伸10min。
4.PCR產(chǎn)物檢測取10μl的PCR擴增產(chǎn)物加入2μl 6×電泳上樣緩沖液，進行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳；電泳結束后凝膠塊用溴化乙錠染色后在紫外透射儀下觀察，檢測到一條分子量為501bp的電泳譜帶，表明受檢線蟲為松材線蟲(圖1、圖3)。
實施例三1.用于松材線蟲和擬松材線蟲檢測的特異引物的設計采用線蟲ITS通用引物擴增不同來源的2個松材線蟲和5個擬松材線蟲種群，獲得包含rDNA的ITS1、5.8S、ITS2區(qū)的擴增片段；雙脫氧終止法測定各擴增片段的DNA序列；所得的序列信息用DNASTAR 5.0軟件分析，找出松材線蟲和擬松材線蟲種群間的差異序列，根據(jù)差異序列利用primer Premier 5.0軟件設計松材線蟲的特異引物BX15’-CGATGATGCGATTGGTGACTT-3’和BX25’-ATGCGAGACGACTGTCACAACG-3’，擬松材線蟲的特異引物BM15’-TTCTCAAGTTTCTGCATTTGTAAG-3’和BM25’-GGCGCGGTCGCACAATCGAG-3’，其中BX1定位于rDNA的ITS1區(qū)，BX2位于rDNA的ITS2區(qū)，預期擴增片段為501bp；BM1和BM2定位于rDNA的ITS2區(qū)，預期擴增片段為160bp；DNA合成儀合成上述4條寡聚核苷酸引物。
2.用于單條線蟲PCR鑒定的DNA模板制備在一塊經(jīng)高壓滅菌并剪成4mm的方形定量濾紙上滴加2μl含有1.25mM dNTP和各15μM的特異引物BX1、BX2、M1和BM2的線蟲檢測液，晾干待用；在解剖鏡下從來源于云南的擬松材線蟲分離液中挑取一條典型的成蟲入預先滴在載玻片的雙蒸水滴中清洗后，移至水滴外，待線蟲蟲體周圍的水接近完全干燥；用鑷子取已干燥的含線蟲檢測試劑的濾紙片覆蓋于線蟲蟲體上，鑷子輕按濾紙片將線蟲壓破，將濾紙片移入裝有15μl雙蒸水的0.2ml薄壁管中95℃加熱10min，冷卻至室溫，8000rpm離心30s得到單條線蟲DNA模板制備液。
3.病原線蟲的PCR特異擴增在單條線蟲DNA模板制備液中加入2.5μl含1.5mM MgCl2的10×PCR buffer，1U Taq酶，補雙蒸水至25μl；置于PCR儀內進行擴增，擴增條件為預變性94℃2min；30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃45s，54℃60s，72℃60s；最后再72℃延伸10min。
4.PCR產(chǎn)物檢測取5μl的PCR擴增產(chǎn)物加入2μl 6×電泳上樣緩沖液，進行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳；電泳結束后凝膠塊用溴化乙錠染色后在紫外透射儀下觀察，檢測到一條分子量為160bp的電泳譜帶，表明受檢線蟲為擬松材線蟲(圖2、圖3)。
實施例四1.用于松材線蟲和擬松材線蟲檢測的特異引物的設計采用線蟲ITS通用引物擴增不同來源的2個松材線蟲和5個擬松材線蟲種群，獲得包含rDNA的ITS1、5.8S、ITS2區(qū)的擴增片段；雙脫氧終止法測定各擴增片段的DNA序列；所得的序列信息用DNASTAR 5.0軟件分析，找出松材線蟲和擬松材線蟲種群間的差異序列，根據(jù)差異序列利用primer Premier 5.0軟件設計松材線蟲的特異引物BX15’-CGATGATGCGATTGGTGACTT-3’和BX25’-ATGCGAGACGACTGTCACAACG-3’，擬松材線蟲的特異引物BM15’-TTCTCAAGTTTCTGCATTTGTAAG-3’和BM25’-GGCGCGGTCGCACAATCGAG-3’，其中BX1定位于rDNA的ITS1區(qū)，BX2位于rDNA的ITS2區(qū)，預期擴增片段為501bp；BM1和BM2定位于rDNA的ITS2區(qū)，預期擴增片段為160bp；DNA合成儀合成上述4條寡聚核苷酸引物。
2.用于單條線蟲PCR鑒定的DNA模板制備在一塊經(jīng)高壓滅菌并剪成2mm的方形定量濾紙上滴加2μl含有1.25mM dNTP和各15μM的特異引物BX1、BX2、M1和BM2的線蟲檢測液，晾干待用；在解剖鏡下從來源于湖南的擬松材線蟲分離液中挑取一條典型的幼蟲入預先滴在載玻片的雙蒸水滴中清洗后，移至水滴外，待線蟲蟲體周圍的水接近完全干燥；用鑷子取已干燥的含線蟲檢測試劑的濾紙片覆蓋于線蟲蟲體上，鑷子輕按濾紙片將線蟲壓破，將濾紙片移入裝有15μl雙蒸水的0.2ml薄壁管中95℃加熱10min，冷卻至室溫，8000rpm離心30s得到單條線蟲DNA模板制備液。
3.病原線蟲的PCR特異擴增在單條線蟲DNA模板制備液中加入2.5μl含2.0mM MgCl2的10×PCR buffer，1U Taq酶，補雙蒸水至25μl；置于PCR儀內進行擴增，擴增條件為預變性94℃2min；30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃45s，55℃60s，72℃60s；最后再72℃延伸10min。
4.PCR產(chǎn)物檢測取10μl的PCR擴增產(chǎn)物加入2μl 6×電泳上樣緩沖液，進行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳；電泳結束后凝膠塊用溴化乙錠染色后在紫外透射儀下觀察，檢測到一條分子量為160bp的電泳譜帶，表明受檢線蟲為擬松材線蟲(圖2、圖3)。
權利要求
1.一種松樹萎蔫病病原線蟲的快速檢測方法，包括以下步驟(1)根據(jù)松材線蟲的rDNA序列設計用于松材線蟲PCR檢測的一對引物BX15’-CGATGATGCGATTGGTGACTT-3’BX25’-ATGCGAGACGACTGTCACAACG-3’根據(jù)擬松材線蟲的rDNA序列設計用于擬松材線蟲PCR檢測的一對引物BM15’-TTCTCAAGTTTCTGCATTTGTAAG-3’BM25’-GGCGCGGTCGCACAATCGAG-3’(2)用于PCR檢測的單條線蟲DNA模板制備在解剖鏡下從線蟲分離液中挑取一條線蟲入預先滴在載玻片的雙蒸水滴中清洗后，移至水滴外，待線蟲蟲體周圍的水接近完全干燥時，用鑷子取一塊預先滴有2μl含有1.25mM dNTP和各15μM的特異引物BX1、BX2、BM1和BM2的線蟲檢測試劑并已干燥的濾紙片覆蓋于線蟲蟲體上，鑷子輕按濾紙片將線蟲壓破，將濾紙片移入裝有15μl雙蒸水的0.2ml薄壁管中95℃加熱10min，冷卻至室溫，8000rpm離心30s得到單條線蟲DNA模板制備液(3)PCR擴增在步驟(2)得到的單條線蟲DNA模板制備液中加入2.5μl含1.5～2.0mM MgCl2的10×PCR buffer，1U Taq酶，補雙蒸水至25μl；置于PCR儀內進行擴增(4)PCR產(chǎn)物檢測取5～10μl步驟(3)得到的PCR擴增產(chǎn)物進行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠在電泳結束經(jīng)溴化乙錠染色后在紫外透射儀下觀察，如檢測到一條分子量為501bp的電泳譜帶表明受檢線蟲為松材線蟲，如檢測到一條分子量為160bp的電泳譜帶表明受檢線蟲為擬松材線蟲。
2.根據(jù)權利要求1所述的松樹萎蔫病病原線蟲的快速檢測方法，其特征是所述的用于PCR檢測的單條線蟲DNA模板制備的濾紙片為經(jīng)高壓滅菌處理，并剪成邊長2～4mm的方形定量濾紙。
3.根據(jù)權利要求1所述的松樹萎蔫病病原線蟲的快速檢測方法，其特征是所述的PCR擴增條件是預變性94℃ 2min；30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃ 45s，54～55℃ 60s，72℃ 60s；最后再72℃延伸10min。
全文摘要
本發(fā)明屬于森林病害檢測技術領域，涉及一種松材線蟲和擬松材線蟲的檢測方法。本發(fā)明的技術方案包括四個步驟①設計用于松材線蟲和擬松材線蟲PCR檢測的特異引物各一對；②用機械破碎和濾紙吸附的方法獲得單條線蟲DNA作為模板；③進行松材線蟲和擬松材線蟲的特異PCR擴增；④PCR產(chǎn)物檢測。本發(fā)明可快速、準確、靈敏地從線蟲分離液中鑒定出松材線蟲或擬松材線蟲，為危險性的松樹線蟲萎蔫病的診斷及檢疫提供了一種快速、準確且便于操作的方法，本發(fā)明可用于松材線蟲及擬松材的成蟲和幼蟲。
文檔編號C12Q1/02GK1793866SQ20051004872
公開日2006年6月28日 申請日期2005年12月22日 優(yōu)先權日2005年12月22日
發(fā)明者王揚, 喻盛甫, 楊佩文, 胡先奇 申請人:云南農(nóng)業(yè)大學