專利名稱：適于原核表達系統的重組人促紅細胞生成素基因及其表達載體的制作方法
技術領域：
本發明涉及人工合成的人促紅細胞生成素基因，具體地說涉及可在大腸桿菌中高效表達的重組人促紅細胞生成素基因。
本發明還涉及含有重組人促紅細胞生成素的載體和宿主細胞。
本發明還涉及含有本發明重組人紅細胞生成素的抗原和肽鏈蛋白試劑。
背景技術：
促紅細胞生成素(Erythropoietin，EPO)是一種主要由腎臟合成并分泌的糖蛋白激素，能刺激骨髓中的紅細胞前體細胞的分化與增殖，在紅細胞發育成熟過程中起著重要的作用，是紅細胞形成的內源性調節劑，在臨床上可用于治療各種貧血性疾病。
美國科學家在1985年首次成功克隆了人EPO基因，為單考貝基因，定位于第7號染色體長臂7q21-22區域。整個基因由5個外顯子和4個內含子組成，編碼193個氨基酸。其中前端27個氨基酸為信號肽，成熟蛋白質由165個氨基酸分子組成(EPO分子在后加工修飾過程中其C-末端Arg166位被切除)。1986-1987年Joseph Eschbath博士等人首次將rhEPO用于臨床病人，開始了臨床應用驗證(Cotes PM，et al.Determination of serum immunoreactive erythropoietin in the investigation oferythrocytosis.N Engl J Med 1986；315283～287.Eschbach JW，et al.Correction of theanemia of end-stage renal disease with recombinant human erythropoietinrusults of acombined phase I and II clinical trials.N Engl J Med 1987；31673～77.Schaefer R M，et，al.Therapy of renal anemia with recombinant human erythropoietin.Dtsch MedWochenschr 1988；113125～129.Matsumoto T，et al.Effect of recombinant humanerythropoietin on cancer drug-induced-anemia.Br J Haematol 1990；75463～468.及Adamson J W.Cytokine biology.Implications for transfusion medicine.Cancer1991；672708～2711.)。
EPO分子是一種含唾液酸的酸性糖蛋白，對熱(在80℃條件下不變性)和酸堿(穩定范圍在PH3.5～10.0之間)較為穩定。蛋白質肽鏈中Cys161與Cys7、Cys29和Cys33之間分別形成兩對二硫鍵，其中Cys7和Cys161之間的二硫鍵對于EPO的生物活性至關重要，如果二硫鍵被還原，EPO將喪失其生物活性。EPO分子的四個糖基化位點分別在Asn38、Asn24、Asn83和Ser126上，前三者為N-糖鏈，后者為O-糖鏈。糖鏈的分技程度不同，有雙末梢、三末梢或四末梢，其中四末梢最為常見，由于EPO糖基結構部分占整個分子量的30-40％，其糖鏈分枝程度的不同使EPO的分子量在30～40KD之間。研究結果表明，糖鏈的分枝程度對EPO在體內的生物活性有影響，N-端糖鏈的高度分枝對其維持生物體內生物活性是必要的。去唾液酸或去糖基化不影響在體外的生物活性，但卻大大縮短了在體內的半衰期(主要經肝細胞吸附代謝)，結果使其完全不能表現出體內生物學活性。只有EPO分子被充分糖基化后，才能在體內才表現出生物活性。因此糖鏈結構的存在對EPO在體內的生物活性至關重要。
通過DNA重組技術，將人EPO基因轉染中國倉鼠卵巢細胞(CHO)后，可由CHO細胞大量合成重組的人EPO(rhEPO)。rhEPO分子由肽鏈及不同糖基化程度的幾個糖鏈結構組成，分子大小和生物學活性等方面均與人內源性EPO相同，但在唾液酸含量上存在微小的差別。EPO去糖基后雖然在體外有生物活性，但在體內生物活性喪失。1989年6月美國Amgen公司生產的rhEPO正式獲得美國FDA注冊許可，用于臨床治療慢性腎衰竭合并貧血癥。訖今為止近十年的臨床應用的結果表明rhEPO的療效顯著，副作用小，在美國的年銷售額就達數十億美元，是訖今開發的最為成功的生物技術藥品之一。
但由于其價格相對昂貴，使用頻度較高，造成醫療總體費用太高。為了減輕病人在使用rhEPO時的費用負擔，使更多的適應癥病人能夠有能力接受rhEPO治療，國內外許多廠家都在研究增加rhEPO的生物利用度，減少注射劑量或次數的方法。Amgen公司第二代長效的EPO制劑(Aranesp)已在2002年獲得美國FDA批準上市銷售。
rhEPO自1989年投入臨床使用迄今已十年，其臨床適應癥已由最初的治療慢性腎功能衰竭(CRF)合并貧血擴展到多種貧血性疾病的治療，包括腫瘤及腫瘤化療所致的貧血，骨髓增生異常綜合征貧血(Myelodysplastic Syndrome，MDS)，齊多夫定(zidovudine)治療的AIDS病人以及采用自體輸血的手術病人等。臨床上針對不同適應癥病人，人們采用各自相應的治療措施已取得了較為肯定和滿意的結果。
目前認為EPO的糖結構對維持其體內生物效應具有重要的作用。但是目前對EPO糖基化在EPO表達其生物活性中具體作用的報道相對較少，同時對EPO的活性部位也有多種說法(周廷沖，馬賢凱，唐佩弦等。多肽生長因子基礎與臨床。中國科學技術出版社。)。現在大量有關EPO研究都是針對糖基化的EPO，有關hEPO基因克隆、在COS和CHO等哺乳動物細胞系中獲得高效表達的研究很多，可能是基因結構的原因以及EPO蛋白質的特殊性，目前檢索到的有關對hEPO基因在E.coli中表達研究以及對原核表達系統表達的EPO的相關性質的研究等方面的報道較少，如文獻Expression and mutagenesis of recombinant human and murine erythropoietins in Escherichia coli，Biochemica et Biophysica Acta 1261(1995)35-43，Roslyn M.Bill etc.；Expression and mutagenesis ofrecombinant human and murine erythropoietins in Escherichia coli Biochimica et Biophysica Acta1261(1995)35-43.Roslyn M.Bill etc.；Asn to Lys mutations at three sites which are N-glycosylated in themammalian protein decrease the aggregation of Escherichia coli-derived erythropoietin，ProteinEngineering，Vol.14 no.2 pp.135-140，2001，Linda O.Narhi etc.
在原核表達系統中表達的EPO蛋白，盡管由于缺少糖基化而在體內不具有活性，但由于原核系統生產成本大大低于真核系統，而且研究表明肽鏈上的糖基化程度與其體內活性正相關而與體外活性無關，因此對于非體內應用的EPO蛋白，依然可以通過原核表達系統來制備。為了研究原核表達系統表達的EPO相關性質，我們曾經構建過幾種不同的原核表達載體，但EPO的表達量都比較少，只能通過ELISA方法檢測到目的蛋白，SDS-PAGE電泳基本不能看到表達條帶。
研究資料表明影響真核基因在E.coli中高效表達的因素很多，如基因的二級結構、基因的5′端和3′端穩定性、SD序列的位置以及密碼子的偏愛性等(Chen.T.InouyeM.Suppression of the negative effect of minor arginine codons on gene expressionpreforential usage of minor codons within the first 25 codons of the E.coli gene.NucleiAcids Resesrch 1990.181465～1473.)。同時，對真核和原核基因的密碼子的差異性研究也很多，發現如果稀有密碼子過多，其表達量較低(Zhang S，zubay G，Goldman E.Low-usage codons in E.coli.yeast.fruit fly and primates.Gene.1991.10561～72.及Sorensen M A，Kurland CG.Pedersen S.Codon usage determines translation rate in E.coli.J.Mol.Biol.1989.207365～377.)。而在EPO基因中，我們發現E.coli稀有密碼子占到12％，可能是制約hEPO在E.coli中高效表達的主要原因之一，因此可以通過密碼替換來改變基因結構，從而構建在大腸桿菌中能高效表達EPO的工程菌株。

發明內容
本發明的一個目的在于提供一種可在原核生物特別是大腸桿菌中高效表達的重組人促紅細胞生成素基因序列。
本發明的另一個目的在于提供包含本發明重組基因的質粒和宿主表達載體。
本發明的再一目的在于提供含有本發明重組人促紅細胞生成素的抗原和肽鏈蛋白試劑。
根據本發明的一方面，新的可表達人促紅細胞生成素的基因的構建是通過對已知的人促紅細胞生成素(hEPO)基因的堿基序列進行重新設計，消除大腸桿菌稀有密碼子，而代之以大腸桿菌偏愛密碼子，并適量調整GC含量，同時在目的基因片段的兩端增加3個酶切位點。密碼替換前后的對照如表1所示，為方便比較按50個堿基一組分列，表中給出的是替換前后的全部cDNA序列
表1 hEPO基因密碼替換前后對照表
根據本發明的另一方面，含有重組hEPO基因的質粒載體通過將合成的hEPO基因經酶切后連接進入質粒而構建成本發明的質粒載體。在本發明的一個實施方案中，合成的hEPO基因中含有BamH I和EcoR I酶切位點，經雙酶切后，與同樣含有該兩個酶切位點的PBV220質粒連接。
根據本發明的再一方面，用獲得的本發明的重組質粒載體轉化大腸桿菌而得到本發明的含有重組hEPO基因的宿主細胞。在本發明的一個實施方案中，將質粒載體轉化大腸桿菌DH5α，涂布含氨芐青霉素的LB平板得轉化子。挑取轉化子，提取質粒，用限制性內切酶BamH I和EcoR I雙酶切分析，篩選含有hEPO基因片段的重組質粒轉化細胞。
根據本發明的又一方面，提供含有本發明重組人紅細胞生成素的抗原和肽鏈蛋白試劑，可用于制備抗EPO單克隆抗體的抗原，也可用于制備檢測所用的陽性對照標準。也可用于免疫動物的EPO抗原；或制備成EPO陽性對照標準品，用于EPO免疫檢測的試劑盒，如反相血凝、放射免疫、酶聯免疫等方法；以及用于EPO依賴細胞系的培養或以之檢測EPO體外活性的標準品等等。
本發明通過密碼替換來改變基因序列，構建了新的表達人促紅細胞生成素蛋白的基因及其表達載體。結果發現密碼替換后，hEPO能在E.coli中高效表達，為研究原核系統表達的EPO的相關性質提供了基礎。本發明所涉及的EPO為無糖基化的EPO肽鏈，因生產成本較生產具糖基化的rhEPO低，可直接用于僅用其體外活性而不需體內活性的領域。
本發明的制備重組hEPO的方法中，構建高效表達的工程菌在保證產物高表達的前提下，采用高密度發酵技術，提高菌體發酵密度，不僅能減少培養體積，而且有利于下游純化，很大程度上降低各種成本。


圖1為本發明的質粒構建步驟示意圖；圖2為本發明構建的基因在E.coli中的表達產物SDS-PAGE圖；圖中1陰性對照2、3、4、5、6PBV220-hEPO/DH5α圖3為本發明的rhEPO Western blot結果；圖中1陰性對照2試管表達產物3發酵罐表達產物圖4示出培養溫度對本發明rhEPO表達影響的電泳圖；圖中1蛋白分子量標記(14,400、20,100、30,000、43,000、67,000、94,000)2在30℃培養3在28℃培養4在35℃培養5陰性對照圖5為培養時間對本發明rhEPO表達影響的電泳圖；
圖中1蛋白分子量標記(14,400、20,100、30,000、43,000、67,000、94,000)2培養5hr3培養4hr4培養3hr5培養2hr6陰性對照圖6為密碼修改前后hEPO的表達對照圖；圖中1蛋白分子量標記(14,400、20,100、30,000、43,000、67,000、94,000)2PBV220-EPO-DH5α，密碼未修改，未誘導表達的對照樣品3PBV220-EPO-DH5α，密碼未修改，誘導表達的樣品4PBV220-EPO-DH5α，密碼已修改，未誘導表達的對照樣品5PBV220-EPO-DH5α，密碼已修改，誘導表達的樣品圖7為兩種氨基酸序列(167AA和166AA，均包括第一位Met)的EPO蛋白表達對照圖；圖中1密碼修改后，表達的167AA(含167位Arg)樣品2密碼修改后，表達的166AA(不含167位Arg)樣品31之誘導表達前對照樣品42之誘導表達前對照樣品具體實施方式
下面結合附圖，通過對本發明較佳實施方式的詳細描述，說明但不限制本發明。
實施例1重組人促紅細胞生成素基因(rhEPO)的合成和表達載體構建1.菌株及質粒質粒PBV220全長3.66Kb，串聯噬菌體PLPR啟動子，下游為核糖體基因終止信號，氨芐青霉素抗性，制備方法見含PLPR啟動子的原核高效表達載體的組建及其應用，病毒學報，1990，6(2)11，該質粒由作者贈送。大腸桿菌菌株DH5α購自于GIBCO公司DH5α標準株。
2.工具酶及試劑限制性內切酶BamH I、EcoR I、T4連接酶以及Taq DNA聚合酶購于Roche公司，質粒純化試劑盒(Wizard Plus Minipreps DNA Purification System)購于Promega公司，蛋白分子量標記購于華美公司，其它試劑均為國產分析純試劑。
3.人促紅細胞生成素基因的合成人體內表達的EPO分子由166個氨基酸構成的糖基化蛋白質，在后加工修飾過程中其C-末端Arg166位被切除，成為由165個氨基酸組成的成熟hEPO。hEPO的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，其蛋白質一級結構的氨基酸序列如SEQ IDNO.2。其中大腸桿菌稀有密碼子的比例占到12％。為了讓基因最佳化表達，我們通過對基因的重新設計和合成，消除稀有密碼子而利用最佳化密碼子。將hEPO中的絕大部分稀有密碼子替換成大腸桿菌偏愛密碼子，并適量調整GC含量，同時在目的基因片段的兩端增加3個酶切位點EcoR IGAATTC；Nde ICATATG；BamH IGGATCC。密碼替換前后對照如表1中所示，替換后合成的序列中編碼序列如SEQ ID NO.3所示。由于大腸桿菌基因表達以甲硫氨酸起始，實際得到的肽鏈在SEQ ID NO.2序列N端多一個甲硫氨酸，共167個氨基酸的肽鏈，蛋白一級結構沒有其它改變。
4.序列合成方法方法參考Jelenkovic G，Billings S，Chen Q，et al.Transformation of eggplant withsynthetic ccry IIIA gene produces a high level of resistance to the Colorado potatobeetle.J Amer Soc Hort Sci，1998.123(1)19～25，采用全基因合成的方法，首先使用設計軟件設計長度約為80nt的oligo，這些oligo之間互相形成約18nt的overlap，然后進行多輪PCR擴增后得到全長基因，電泳回收后進行克隆，再測序得到序列正確的克隆。
為了合成表達成熟hEPO的165個氨基酸(由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列缺少第166位精氨酸)的基因序列，設計如下兩條引物，用PCR法從含有經密碼替換后的EPO基因的質粒中重新擴增出缺少第166位精氨酸密碼(CGT)的EPO基因(以下步驟和實施例均使用如SEQ ID NO.4所示的表達165個氨基酸的基因序列)，按上述方法同樣獲高效表達，見圖7。同樣，在大腸桿菌中表達的肽鏈為N端增加一個甲硫氨酸共166個氨基酸的肽鏈。
引物5’GAG GAA TTC ATA TGG CTC CGC CGC GTC TG 3’5’CAG CTG GGA TCC TCA ATC ACC GGT ACG GCA 3’5.重組質粒構建和篩選鑒定將經測序正確的目的基因用限制性內切酶BamH I和EcoR I雙酶切得到編碼序列(SEQ ID NO.4)，電泳后回收后與用限制性內切酶BamH I和EcoR I同樣雙酶切的PBV220質粒連接。連接產物轉化大腸桿菌DH5α，涂布含氨芐青霉素的LB平板得轉化子。挑取轉化子，提取質粒，用限制性內切酶BamH I和EcoR I雙酶切分析，篩選含有hEPO基因片段的重組質粒轉化子。
重組質粒的構建路線見圖1。
6.EPO基因在大腸桿菌中的表達將重組子接種于5ml LB培養基中，在30℃，180rpm搖床培養14h左右。然后以1∶30的比例轉入LB培養基中，30℃培養4h左右(A600≈0.8時)。再以42℃誘導培養4h。取培養物1ml，離心后進行SDS-PAGE及Western blot鑒定所表達的蛋白質。
實施例2重組人促紅細胞生成素的制備高密度發酵培養的培養基及培養條件1.LB種子培養基每立升含蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，PH7.0，高壓滅菌，使用時加入氨芐青霉素至100ug/ml。
2.發酵用培養基每10L含K2HPO412g，KH2PO4·3H2O 20g，NaCl 20g，MgSO4·7H2O 10g，葡萄糖500g，酵母粉480g，蛋白胨430g，高壓滅菌后使用。
3.發酵培養將保存的菌種劃平皿，挑取單個菌落，接種于LB種子培養基中，培養14～16h后，再以1∶30的比例擴大培養12h。然后接種于NBSMPP-40發酵罐中培養，在培養過程中每間隔1個小時補料一次，并根據菌體生長情況調整PH和氧溶解度(DO)。
實施例3結果測定1.EPO體外細胞學活性測定方法參考《MTT比色法與ELISA法測定rhEPO體外生物學活性的比較[細胞與分子免疫學雜志(J Cell Mol Immunol)2000；16(5)]韓蕾，韓為躍》，收獲菌體以超聲波破菌后離心。上清液直接進行UT7細胞活性檢測，沉淀以6倍體積的7M尿素溶解后進行UT7細胞活性檢測。標準品為rhEPO(麒麟鯤鵬公司利血寶)3000IU/瓶(2ml)。
結果對照的載體菌上清及沉淀溶解液中均未測得UT7細胞活性。構建的工程菌破菌上清液測得8IU/ml，沉淀溶解液400倍稀釋后測得700IU/ml。
2.密碼修改前后及誘導前后的hEPO表達量測定將獲得的hEPO與對照組比較，結果見圖6。
3.rhEPO的DNA序列測定構建的重組質粒DNA序列測定的結果與設計的序列完全一致，且氨基酸序列與文獻(Goldwasser E，et，al.Erythropoietinthe primary regulator of red cellformation.Insporn MB.Roberts AB.Eds.Peptide growth factors and their receptors.BerlinSpringer-verlag.1990747～770.)報道的rhEPO氨基酸序列除起始甲硫氨酸外完全一致。
4.EPO高效表達及Western blot鑒定SDS-PAGE電泳和Western blot鑒定結果顯示，搖瓶培養和發酵罐培養均得到高表達，表達量達到30％左右，而且高表達的條帶都具有rhEPO抗原性，見圖2、圖3。
實施例4各種條件對表達產物的影響1.溫度對表達產物的影響通過比較發現，工程菌在30℃培養42℃誘導時，目的蛋白表達量最高，達到33％；在35℃進行培養時，雖然細菌的生長較快，菌密度明顯增加，但hEPO表達量卻很低，為20％；在28℃時培養，細菌生長速率較慢，菌密度增加緩慢，但工程菌hEPO的表達量較高，達到25％。見圖4。
2.培養時間對表達產物的影響研究發現細菌培養15h左右開始升溫誘導，大約誘導4h左右，表達量可以達到34％；如果誘導時間逐步縮短，目的蛋白的表達量有所減少；但是通過SDS-PAGE電泳綜合比較，大約誘導3h左右，情況比較好。一是目的蛋白表達量相對較高，達到28％，而且雜蛋白的量也不高，更加有利于下游純化工作，見圖5。
3.溶氧量與培養基對表達產物的影響通過實驗發現，在發酵過程中，溶氧量控制在20％時，表達產物的量比較高，雜蛋白較少；同時在培養過程中應根據OD值的變化適時補充葡萄糖、酵母粉和蛋白胨，葡萄糖的濃度應維持在1g/L左右，以利于細菌生長。
4.密碼修改和誘導對hEPO表達的影響圖6中，由第2、3比較可見，在目的分子量(18～20K)處可見較弱的表達條帶，掃描定量占總蛋白量不足1％；由4、5比較可見，在目的分子量(18～20K)處可見較強的表達條帶，掃描定量占總蛋白量的25％。
由以上各實施例表明，通過密碼替換改變基因序列后，rhEPO能在E.coli中高效表達，因此為原核系統中大規模生產制備hEPO奠定了基礎。
構建高效表達的工程菌在保證產物高表達的前提下，采用高密度發酵技術，提高菌體發酵密度，不僅能減少培養體積，而且有利于下游純化，很大程度上降低各種成本。由于發酵是個動態過程，影響大腸桿菌高密度高表達發酵的因素主要有溫度、PH、補料調控、氧溶解度(DO)等方面。根據實際情況，我們研究了溫度、培養時間對表達產物的影響；同時在發酵過程中采用間隙補料方式。由于細菌的生長是以指數形式增加，因此它對葡萄糖的要求也以這種形式增加，而我們采取的間隙補料方式即能保證葡萄糖加入量與細菌的生長需求一致，有利于細菌生長，提高目的蛋白的表達。
本發明制備的重組hEPO，其為無糖基化的EPO肽鏈，因生產成本較生產具糖基化的rhEPO低，目前的研究已經證明肽鏈上的糖基化程度與其體內活性正相關而與體外活性無關，可直接用于僅用其體外活性而不需體內活性的領域。
本發明所構建的工程菌高效表達的產物經與抗EPO單克隆抗體斑點雜交，可產生陽性斑點；而對照的載體菌不產生陽性斑點。證明本發明所獲的EPO肽鏈具有EPO特有的抗原活性，可開發生產出用于制備抗EPO單克隆抗體的抗原，也可用于制備檢測所用的陽性對照標準。因此本發明的hEPO可以用于制備EPO肽鏈蛋白試劑；也可用于免疫動物的EPO抗原；或制備成EPO陽性對照標準品，用于EPO免疫檢測的試劑盒，如反相血凝、放射免疫、酶聯免疫等方法。
本發明所組建的工程菌高效表達的產物(SDS-PAGE可見表達條帶)經EPO依賴細胞系UT7檢測，發現具有EPO特有的維持UT7細胞生長的活性；而對照的載體菌(SDS-PAGE未見表達條帶)未檢出相應的EPO活性。此實驗證明所獲的EPO肽鏈具有EPO特有的體外細胞學活性，可用于制備EPO依賴細胞系生長所必需的細胞因子添加劑。
以上對本發明的詳細描述并不限制本發明，本領域技術人員可以根據本發明作出各種改變或變形，只要不脫離本發明的精神，均應屬于本發明所附權利要求所定義的范圍。
重組人促紅細胞生成素.ST25SEQUENCE LISTING<110>成都生物制品研究所<120>適于原核表達系統的重組人促紅細胞生成素基因及其表達載體<130>2832<160>4<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>501<212>DNA<213>Artificial(人工序列)<220>
<221>CDS<222>(1)..(501)<223>編碼人重組人促紅細胞生成素基因<400>1gcc cca cca cgc ctc atc tgt gac agc cga gtc ctg gag agg tac ctc 48Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15ttg gag gcc aag gag gcc gag aat atc acg acg ggc tgt gct gaa cac 96Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30tgc agc ttg aat gag aat atc act gtc cca gac acc aaa gtt aat ttc144Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45tat gcc tgg aag agg atg gag gtc ggg cag cag gcc gta gaa gtc tgg192Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60cag ggc ctg gcc ctg ctg tcg gaa gct gtc ctg cgg ggc cag gcc ctg240Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80ttg gtc aac tct tcc cag ccg tgg gag ccc ctg cag ctg cat gtg gat288Len Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95aaa gcc gtc agt ggc ctt cgc agc ctc acc act ctg ctt cgg gct ctg336Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110gga gcc cag aag gaa gcc atc tcc cct cca gat gcg gcc tca gct gct384Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125cca ctc cga aca atc act gct gac act ttc cgc aaa ctc ttc cga gtc432Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140tac tcc aat ttc ctc cgg gga aag ctg aag ctg tac aca ggg gag gcc480Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160tgc agg aca ggg gac aga tga501Cys Arg Thr Gly Asp Arg165<210>2<211>166<212>PRT<213>Artificial(人工序列)<400>2
重組人促紅細胞生成素.ST25Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg165<210>3<211>501<212>DNA<213>Artificial(人工序列)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(501)<400>3gctccgccgc gtctgatctg tgatagccgt gttctggaac gttacctgct ggaagctaaa 60gaagctgaaa acatcacgac gggctgtgct gaacactgca gcctgaacga aaacatcact120gttccggata ccaaagttaa cttctatgct tggaaacgta tggaagttgg tcagcaggct180gtagaagttt ggcagggcct ggctctgctg tcggaagctg ttctgcgtgg ccaggctctg240ctggttaact ctagccagcc gtgggaaccc ctgcagctgc acgtggataa agctgttagt300ggcctgcgta gcctgaccac tctgctgcgt gctctgggag ctcagaaaga agctatcagc360cctccggatg cggcttcagc tgctccgctg cgtaccatca ctgctgatac tttccgtaaa420ctgttccgtg tttacagcaa cttcctgcgt ggaaaactga aactgtacac cggtgaagct480tgccgtaccg gtgatcgttg a 501
重組人促紅細胞生成素.ST25<210>4<211>498<212>DNA<213>Artificial(人工序列)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(498)<400>4gctccgccgc gtctgatctg tgatagccgt gttctggaac gttacctgct ggaagctaaa 60gaagctgaaa acatcacgac gggctgtgct gaacactgca gcctgaacga aaacatcact120gttccggata ccaaagttaa cttctatgct tggaaacgta tggaagttgg tcagcaggct180gtagaagttt ggcagggcct ggctctgctg tcggaagctg ttctgcgtgg ccaggctctg240ctggttaact ctagccagcc gtgggaaccc ctgcagctgc acgtggataa agctgttagt300ggcctgcgta gcctgaccac tctgctgcgt gctctgggag ctcagaaaga agctatcagc360cctccggatg cggcttcagc tgctccgctg cgtaccatca ctgctgatac tttccgtaaa420ctgttccgtg tttacagcaa cttcctgcgt ggaaaactga aactgtacac cggtgaagct480tgccgtaccg gtgattga 498
權利要求
1.一種可在原核表達系統中高效表達的重組人促紅細胞生成素基因，其特征在于其含有SEQ ID NO.4的核苷酸序列。
2.含有權利要求1所述基因的重組質粒載體。
3.根據權利要求2所述的質粒載體，其特征在于所述質粒載體是將SEQ ID NO.4所示核苷酸序列經酶切后與PBV220連接而構建的。
4.含有權利要求1所述基因的宿主細胞。
5.根據權利要求4所述的宿主細胞，其特征在于所述宿主細胞為原核細胞。
6.根據權利要求5所述的宿主細胞，其特征在于所述宿主細胞是用含有SEQ IDNO.4序列的質粒載體轉入大腸桿菌DH5α而制備。
7.一種重組人促紅細胞生成素蛋白，其特征在于它由權利要求1所述的基因編碼，并在原核表達系統中表達。
8.根據權利要求7所述的重組人促紅細胞生成素蛋白，其特征在于所述原核表達系統為大腸桿菌表達系統。
9.含有權利要求7所述重組人促紅細胞生成素蛋白的抗原。
10.含有權利要求7所述重組人促紅細胞生成素蛋白的肽鏈蛋白試劑。
全文摘要
本發明涉及能在原核系統中高效表達的重組人促紅細胞生成素基因、其表達載體、宿主細胞。通過對已知的hEPO基因的堿基序列進行重新設計，消除大腸桿菌稀有密碼子，而代之以大腸桿菌偏愛密碼子，獲得了高效表達的重組基因。本發明所涉及的EPO為無糖基化的EPO肽鏈，因生產成本較生產具糖基化的rhEPO低，可直接用于僅用其體外活性而不需體內活性的領域。
文檔編號C12N15/70GK1657619SQ20051005099
公開日2005年8月24日 申請日期2005年2月5日 優先權日2004年2月18日
發明者葛永紅, 嚴君喜, 陳智勇 申請人:成都生物制品研究所