專利名稱：一種預(yù)測2型糖尿病易感性的方法及試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)測2型糖尿病易感性的方法及試劑，更具體地說是通過測定人TNFRSF9基因多態(tài)性預(yù)測受試者對于2型糖尿病的易感性，該方法可用于疾病的輔助診斷、治療和新藥開發(fā)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2型糖尿病(T2DM)是一種常見多發(fā)的慢性代謝性疾病，受遺傳和環(huán)境因素的雙重影響，具有復(fù)雜發(fā)病機(jī)制，在人群中的患病率約為5％～15％。由于其高比例的大血管并發(fā)癥，直接導(dǎo)致心、腦血管疾患引起死亡，以及微血管并發(fā)癥引起的殘疾，已經(jīng)成為全球嚴(yán)重危脅生命和健康的前幾位疾病之一，每年為此消耗了大量人力、物力和財(cái)力(錢榮立，楊澤，佟之復(fù)主編.21世紀(jì)的糖尿病防治.河南醫(yī)科大學(xué)出版社，鄭州，2000.)。迄今為止，關(guān)于T2DM的病因仍然不清，但是即往大量研究表明，T2DM在家系分析、雙生子研究均呈現(xiàn)高度遺傳一致性(Zimmet P，Alberti KG，Shaw J.Globaland societal implications of the diabetes epidemic.Nature，2001；414782-787.)。遺傳因素在發(fā)病機(jī)制中的重要性得到了很多人群證據(jù)的證明，如染色體2q(NIDDM1)位點(diǎn)是墨西哥美國人的相關(guān)位點(diǎn)，染色體12q(NIDDM2)是在芬蘭人群中發(fā)現(xiàn)的，在Pima印第安人中常染色體基因組掃描發(fā)現(xiàn)了幾個LOD分?jǐn)?shù)較高的染色體區(qū)域(3q24，9q21和22q12)(Walker M.Gene detection in type 2 diabetes.International DiabetesMonitor，1998；1014-15)。
目前進(jìn)行T2DM遺傳病因研究，多采用SNPs作為基因組標(biāo)志的關(guān)聯(lián)分析方法，是有效的，已得到證明(Horikawa Y，Oda N，Cox NJ，et al.Genetic variation in the geneencoding calpain-10 is associated with type 2 diabetes mellitus.Nat Genet，2000；26163-175.)。SNP是指染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，在人群中的頻率需＞1％，SNPs是雙等位基因標(biāo)記，這種單堿基變化中有70.1％為同型堿基之間的轉(zhuǎn)換如G/A或T/C，29.1％為發(fā)生在嘌呤和嘧啶之間的顛換。C(胞嘧啶)是人類基因組中最易發(fā)生變化的位點(diǎn)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)是甲基化胞嘧啶，能夠自發(fā)脫氨基轉(zhuǎn)換為T(胸腺嘧啶)，SNPs包含了已知多態(tài)性的80-90％，是最常見的遺傳變異。
由于生存的選擇壓力導(dǎo)致SNP在單一基因和整個基因組中的分布呈不均勻性。SNPs在基因非編碼區(qū)的數(shù)量是編碼區(qū)的4倍，總數(shù)可達(dá)3百萬個(Brookes AJ.Theessence of SNPs.Gene，1999；234177-186.)。SNPs以其密度高，平均每1kb就有1個；代表性強(qiáng)，位于基因內(nèi)部的SNPs可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平；遺傳穩(wěn)定性好，同微衛(wèi)星多態(tài)性比較而言；易于自動化分析，因SNPs在人群中為雙等位基因標(biāo)記，可簡單以“+/-或1/0”直接分型，成為很好的遺傳標(biāo)志。(Collins FS，Brooks LD，Chakravarti A.A DNA polymorphism discovery resource for research on human geneticvariation.Genome Res，1998；81229-1231)。
位于染色體1p36的TNFRSF9基因編碼腫瘤壞死因子受體超家族組分9的分子蛋白，具有重要的功能，包括促進(jìn)免疫反應(yīng)，細(xì)胞凋亡和在自身免疫反應(yīng)中的重要作用。TNFRSF9也稱為CD137或ILA，編碼255個氨基酸的跨膜蛋白，分為胞外區(qū)富半胱氨酸序列；跨膜區(qū)和短的氮-端胞槳區(qū)含有磷酸化信號傳導(dǎo)位點(diǎn)。有限研究指出，當(dāng)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞活化時，刺激啟動了TNFRSF9表達(dá)，而后TNFRSF9呈現(xiàn)抑制活化T淋巴細(xì)胞的增殖并誘異細(xì)胞出現(xiàn)程序化死亡的作用。(Schwarz H，BlancoFJ，VonKempis J，et al.ILA，a member of the tumor necrosis factor family，is located onchromosome 1p36，in a cluster of related genes，and colocotizes with several malignancies，Biochem Biophys，Res Commun 1997；235699-703)。由于在T2DM發(fā)病機(jī)制中存在著低水平的免疫反應(yīng)，包括IL-6、TNFα、C-反應(yīng)蛋白和resistin等細(xì)胞因子在循環(huán)中和病灶發(fā)生的表型部位均可檢測到。如果病灶發(fā)生在肝臟、肌肉和脂肪組織，可以產(chǎn)生胰島素抵抗，如果病灶發(fā)生在胰腺可引致胰島素分泌量減少(Ferandez-Real JM，RicartW，Insulin resistance and Chronic cardiovascular in flammatory syndrome，Endocr Rev2003；34278-301)。在T2DM中TNFα的機(jī)制已得到證明，因此，TNFRSF9作為受體一定在其中發(fā)揮重要作用。
經(jīng)過現(xiàn)有國內(nèi)外文獻(xiàn)檢索，未見有TNFRSF9與T2DM相關(guān)聯(lián)的研究報(bào)道，也未見TNFRSF9基因多態(tài)性位點(diǎn)與T2DM相關(guān)聯(lián)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種預(yù)測2型糖尿病易感性的方法。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種預(yù)測2型糖尿病的試劑，包括PCR引物和含有該引物的試劑盒。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種預(yù)測2型糖尿病易感性的方法，通過提取宿主細(xì)胞的基因組DNA，測定受試者的TNFRSF9基因內(nèi)含子非編碼區(qū)第91位堿基多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，預(yù)測受試者對2型糖尿病的易感性TNFRSF9基因型為T/T純合子時，受試者的易感性最低；TNFRSF9基因型為C/C純合子時，受試者的易感性較高；TNFRSF9基因型為C/T雜合子時，受試者的易感性最高。
本發(fā)明提供了一種分離核酸，具有SEQ ID NO1所示的堿基序列，在第91位為C。該核酸序列為TNFRSF9。圖1為位于1p36的TNFRSF9基因結(jié)構(gòu)及其多態(tài)性變異位點(diǎn)的示意圖，附圖中包含有8個外顯子，rs161810位點(diǎn)標(biāo)在TNFRSF9基因圖中內(nèi)含子1的相應(yīng)位置。
本發(fā)明提供了一組等位基因特異性的引物，具有SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示的堿基序列，長度為19-22bp，而且可以特異性地?cái)U(kuò)增出SEQ ID NO1所示序列中第91位的SNP的擴(kuò)增產(chǎn)物。
本發(fā)明提供了一種檢測T2DM易感性的診斷試劑盒，其中含有本發(fā)明特異性擴(kuò)增TNFRSF9基因的引物對和用于PCR擴(kuò)增檢測的試劑盒的常規(guī)組件、試劑、緩沖液等，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這些常規(guī)組件和檢測方法。檢測擴(kuò)增產(chǎn)物與正常TNFRSF9基因第91位SNP相互對比是否存在變異時，所需的化學(xué)試劑還包括特異性內(nèi)切酶等。本發(fā)明試劑盒中的全部組分、含量、來源和使用方法如下本發(fā)明試劑盒供10人份檢測應(yīng)用，其組分、含量和來源包括60ul 10X PCR緩沖液(Pharmacia)，50ul 10mM dNTP混合液(Pharmacia)，10ul(2unit/ul)Taq DNA聚合酶(Takara)，各12ul(50pmol/ul)F1(SEQ ID NO.2)和R1(SEQ ID NO.3)引物(自制)，1.5ml純水(自制)，20ul 10X限制酶反應(yīng)緩沖液(Biolab)，10ul(2unit/ul)限制酶Mn1I(Biolab)。
使用方法1)通過PCR擴(kuò)增TNFRSF9基因的外顯子1和內(nèi)含子1部分片段，簡言之，制備混合液，加入基因組DNA溶液100ng、5ul 10X PCR緩沖液、4ul 10mM dNTP、1.25單位Taq DNA聚合酶和50pmolF1和R1分別為有義引物和反義引物，實(shí)施例2敘述的每種引物。接著，加入純水，使總體積為50ul。反應(yīng)在95℃0.5分鐘，58℃0.5分鐘，72℃0.5分鐘，進(jìn)行30個循環(huán)。反應(yīng)完成后，將10ul每種PCR反應(yīng)液在7.5％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳檢測，如擴(kuò)增了253bp的片段，獲得了單一條帶，即為擴(kuò)增成功。
2)通過用限制酶處理PCR反應(yīng)產(chǎn)物測定TNFRSF9基因5’-非編碼區(qū)的多態(tài)性。往10ul上述擴(kuò)增的PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加入1ul限制酶反應(yīng)緩沖液、1ul限制酶Mn1I，并在37℃水浴中消化過夜。之后，在7.5％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳。
3)多態(tài)性定型用限制酶Mn1I處理片段，在第91個堿基是T等位基因時，出現(xiàn)151bp和102bp的條帶。如為C等位基因時，僅出現(xiàn)253bp一個條帶。
本發(fā)明的測定方法測定了來源于人的基因組DNA，樣品沒有限制如，體液(如血液、腹水和尿液)、組織細(xì)胞(如肝組織)等。通過提取和純化這些樣品可制備基因組DNA。
從基因組DNA中，可擴(kuò)增含TNFRSF9基因突變點(diǎn)的DNA片段，以獲得用于測定的大量樣本。這種通過擴(kuò)增含TNFRSF9基因突變點(diǎn)的DNA片段獲得的樣品，特別適于用作測定材料。例如，可按PCR方法，使用引物進(jìn)行擴(kuò)增，此引物經(jīng)合理設(shè)計(jì)以便僅擴(kuò)增含TNFRSF9基因多態(tài)性的非編碼區(qū)的部分。這種引物可經(jīng)常規(guī)方法制備。待擴(kuò)增區(qū)的堿基長度不受限制。在一般情況下，堿基長度約100bp至500bp。當(dāng)按本發(fā)明所述制備引物時，可獲得適宜的測定樣品，其作為擴(kuò)增的DNA片段，并具有特異性長度。
進(jìn)行PCR-RFLP方法時，欲擴(kuò)增的DNA被設(shè)計(jì)成含有能適用于此后RFLP方法的特異性酶切位點(diǎn)。
對此設(shè)計(jì)無限制，只要用酶切割DNA區(qū)獲得的片段長度在突變基因和野生型基因的兩種情形中不同。可使用通過TNFRSF9基因的突變產(chǎn)生或丟失的限制酶位點(diǎn)。
因此，根據(jù)PCR方法擴(kuò)增的所需DNA片段，通過上述合理選擇的限制酶得以設(shè)計(jì)。酶切產(chǎn)生的片段通過電泳證實(shí)，它們顯示特定的條帶。根據(jù)在上述方法中獲得的帶型，可測定TNFRSF9基因多態(tài)性。
在進(jìn)行本發(fā)明的基因診斷時，優(yōu)選使用用于測定根據(jù)TNFRSF9基因的突變類型存在的診斷試劑，診斷試劑包括作為必要成分的特定試劑，其對應(yīng)于用于測定TNFRSF9基因突變類型的方法。特定的試劑按采用的測定方法來適當(dāng)?shù)剡x擇。試劑的特征是，組成測定由TNFRSF9基因定義的突變類型的手段是必要的，如，DNA片段/和/或作為用于測定的特異限制酶。試劑，例如特定制備的用于PCR擴(kuò)增步驟的引物，該步驟用于包含TNFRSF9基因的突變點(diǎn)的特定擴(kuò)增片段，不被認(rèn)為是本發(fā)明診斷試劑的必要成分，它們也包含于本發(fā)明的診斷試劑之中。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明首次闡明了TNFRSF9基因多態(tài)性位點(diǎn)與T2DM的相關(guān)性，提供了一種預(yù)測T2DM易感性的方法，該方法可用于T2DM的預(yù)防、輔助診斷和治療，還可以用于新藥研發(fā)。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步敘述，以使公眾對發(fā)明內(nèi)容有更深入的了解，并非對本發(fā)明的限制。


圖1為位于1p36的TNFRSF9基因結(jié)構(gòu)及其多態(tài)性變異位點(diǎn)的示意圖。
具體實(shí)施例方式
用于下列實(shí)施例中表示試劑的英文縮寫如下。
需要時，用高壓鍋(120℃，20分鐘)滅菌EDTA乙二胺四乙酸二鈉SDS十二烷基硫酸鈉TE10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA(pH8.0)10×PCR緩沖液100mM Tris-HCl(pH8.3)，500mM KCl，15mM氯化鎂(MgCl2)0.01％(W/V)白明膠dNTP脫氧核苷三磷酸甲酰胺顏料95％去離子甲酞胺，0.05％葡聚糖藍(lán)APS過硫酸銨→10×TBETris(108g)，硼酸(55g)，EDTA2Na(9.3g)，溶于純水中，總體積為1升。
實(shí)施例1血液樣本收集和基因組DNA的提取按WHO(1999)標(biāo)準(zhǔn)明確診斷入選病例，須經(jīng)空腹8-12小時口服溶入300ml溫水中的75g無水葡萄糖，2小時后檢測其血漿葡萄糖值≥11.1mmol/L或者以前經(jīng)由縣市以上級別醫(yī)院明確診斷的糖尿病患者，共計(jì)收集來自黑龍江、北京、大連和銀川的無親緣關(guān)系T2DM患者690例，平均年齡49歲±21.2歲，其中男性300例，同地區(qū)的健康對照志愿者710例，平均年齡47歲±19.6歲，其中男性325例。所有受檢者均為漢族，且簽署知情同意書，這一研究也得到了本單位倫理委員會批準(zhǔn)。
根據(jù)下列方法，用人外周血制備基因組DNA。在抗凝劑EDTA存在下，將收集的10ml人外周血在2500rpm，離心分離30分鐘除去血清。接著加入0.2％NaCl溶液，使總體積為50ml。輕輕振蕩溶液5-6次，并使其放置于冰上15分鐘。此后，在2500rpm離心分離30分鐘，借此收集沉淀物。用0.2％的NaCl溶液，以類似于前面的方式再進(jìn)行洗滌。在如此獲得的沉淀物中，加入10mMTris-HCl(pH8.0)和10mM EDTA(4ml)，以懸浮該沉淀物。將10％SDS，25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入懸液中，其加入量分別為4ml、16ul和20ul，接著上下顛倒懸液輕輕混合。然后，在37℃過夜溫育懸液。過夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下顛倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm進(jìn)行離心分離10分鐘除去水層。將水層和4ml酚/氯仿溶液混合，接著逆混合并以3000rpm離心分離10分鐘。除去水層。最后，用氯仿提取兩次，以獲得水相，往其中加1/10，3M NaAC(pH5.2)，兩倍量的冷無水乙醇，使DNA沉淀。用70％的乙醇洗滌以獲得基因組DNA。使這樣獲得的DNA，基因組DNA溶解于TE中，然后定量測定混合物在260nm的吸收率。DNA工作液濃度校正至30ng/ul，置-20℃冰箱保存。
實(shí)施例2 SNP的識別確定本發(fā)明采用PCR-RFLP和PCR測序技術(shù)同時對TNFRSF9基因的內(nèi)含子1的第91位SNP位點(diǎn)(其等位位點(diǎn)對為T/C)進(jìn)行檢測。
1)引物的確定定位在TNFRSF9基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游啟動子區(qū)-11bp到內(nèi)含子1非編碼區(qū)+242bp，全長253bp，確定了正義鏈(-11--+8bp)和反義鏈(222--242bp)特異性引物如下F15′-CAG AAG CCT GAA GAC CAAG～3′(SEQ ID NO2)R15′-TTG AGA TGT AAG TTT GTA TGG～3′(SEQ ID NO3)2)通過PCR擴(kuò)增TNFRSF9基因的外顯子1和內(nèi)含子1部分片段，簡言之，制備混合液，加入上述實(shí)施例1制備的基因組DNA溶液100ng、5ul 10X PCR緩沖液、4ul 10mMdNTP、1.25單位Taq DNA聚合酶和50pmol上述步驟1)敘述的每種引物。接著，加入純水，使總體積為50ul。反應(yīng)在95℃0.5分鐘，58℃0.5分鐘，72℃0.5分鐘，進(jìn)行30個循環(huán)。反應(yīng)完成后，將10ul每種PCR反應(yīng)液在7.5％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳獲得了單一的條帶，觀察在BioRad成像儀，應(yīng)用Gel Doc 2000程序。
3)通過用限制酶處理PCR反應(yīng)產(chǎn)物測定TNFRSF9基因5’-非編碼區(qū)的多態(tài)性簡言之使用F1和R1分別為有義引物和反義引物進(jìn)行PCR。結(jié)果，擴(kuò)增了253bp的片段。往10ul上述擴(kuò)增的PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加入1ul限制酶反應(yīng)緩沖液、1ul限制酶MnlI，并在37℃消化過夜。此后，在7.5％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳。多態(tài)性的測定為用限制酶Mn1I處理片段，在第91個堿基是T等位基因時，出現(xiàn)151bp和102bp的條帶。如為C等位基因時，僅出現(xiàn)253bp一個條帶。
實(shí)施例3 TNFRSF9基因SNP與T2DM的相關(guān)統(tǒng)計(jì)方法利用STATA8.0和SPSS11.0軟件中Pearson卡方檢驗(yàn)計(jì)算TNFRSF9基因多態(tài)性的等位位點(diǎn)，基因型頻率，Hardy-Weinberg平衡檢測，進(jìn)行連續(xù)校正和單側(cè)漸近概率分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性水平設(shè)定為P＜0.05。采用單因素Logistic回歸分析計(jì)算T2DM的患病風(fēng)險(xiǎn)OR值及其95％可信區(qū)間(CI)。
結(jié)果1)健康人TNFRSF9基因多態(tài)性分布按實(shí)施例1和2的方法測定了710個健康人的基因多態(tài)性。584人在第91位堿基有多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)231人有T的純合子(32.65％)，353人有T和C的雜合子(49.66％)，126人有C的純合子(17.69％)。
2)T2DM病人TNFRSF9基因多態(tài)性分布按實(shí)施例1和2的方法測定690個健康人的基因多態(tài)性。481人在第91位堿基有多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)136人有T的純合子(19.70％)，345人有T和C的雜合子(50.00％)，209人有C的純合子(30.30％)。
3)T2DM病例和健康對照組比較T2DM病例和健康對照組比較其TNFRSF9基因上的rs161810，其等位位點(diǎn)對為T/C多態(tài)性的頻率分布，詳見表1。
表1 TNFRSF9基因rs161810位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率風(fēng)險(xiǎn)性在T2DM和健康正常人群中的比較樣本數(shù) 基因型 (％) 等位基因(％)C/C C/T T/TCT2型DM人 690 209 30.30 345 50.00 136 19.70 763 55.30 617 44.70正常人 710 126 17.69 353 49.66 231 32.65 604 42.53 816 7.48P (df＝2)0.0001 0.0026(df＝1)OR(95％CI) 2.458(1.345-4.492)表1可見，TNFRSF9基因第91位的常見SNP位點(diǎn)(rs161810)的A等位位點(diǎn)，即在其DNA互補(bǔ)鏈上為T等位位點(diǎn)，當(dāng)突變?yōu)镃，互補(bǔ)鏈上為G時，在患者群體中的分布頻率大大高于在健康正常人群中的頻率，相差約12％，有顯著性差別(P＝0.0026)。而且OR值反映突變位點(diǎn)C的頻率在T2DM中高出正常人2.46倍，95％CI下限＞1，均表明這是T2DM患病的一個較高風(fēng)險(xiǎn)的等位基因。與T2DM顯著相關(guān)的SNP(rs161810)位點(diǎn)，位于內(nèi)含子1靠近外顯子1的剪切點(diǎn)側(cè)，可能通過影響DNA的空間結(jié)構(gòu)，從而，這一突變位點(diǎn)影響DNA的轉(zhuǎn)錄和剪切。
實(shí)施例4檢測試劑盒制備檢測T2DM相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，包含有可擴(kuò)增出TNFRSF9基因SNP(rs161810)位點(diǎn)的引物對，及其PCR-RFLP相應(yīng)試劑，成分和含量如下，于-20℃保存60ul 10X PCR緩沖液(Pharmacia)，50ul 10mM dNTP混合液(Pharmacia)，10ul(2unit/ul)Taq DNA聚合酶(Takara)，各12ul(50pmol/ul)F1(SEQ ID NO.2)和R1(SEQ ID NO.3)引物(自制)，1.5ml純水(自制)，20ul 10X限制酶反應(yīng)緩沖液(Biolab)，10ul(2unit/ul)限制酶MnlI(Biolab)。
本發(fā)明具有實(shí)用性的例證1)本發(fā)明的TNFRSF9基因多態(tài)性的檢測方法可用于分析人常染色體1p36區(qū)的TNFRSF9基因上的常見SNP(rs161810)的T等位位點(diǎn)，即在其DNA互補(bǔ)鏈上為A等位位點(diǎn)，應(yīng)用在對T2DM的輔助性診斷和對個體是否有多大的T2DM患病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評估。以利于開展T2DM的早期干預(yù)和治療。
2)利用本發(fā)明闡述TNFRSF9基因第91位堿基變異，作為生物標(biāo)志物之一，可用作藥物設(shè)計(jì)的分子靶標(biāo)的篩選，以幫助尋找具有調(diào)節(jié)TNFRSF9表達(dá)的活性分子，促進(jìn)T2DM新藥開發(fā)。
3)本發(fā)明建立的檢測TNFRSF9基因多態(tài)性的核酸序列和T2DM相關(guān)位點(diǎn)，可高靈敏度，特異性地應(yīng)用于T2DM基因診斷用的試劑盒。
如上所述，得出結(jié)論，TNFRSF9基因在第91位堿基的多態(tài)性與T2DM具顯著相關(guān)性。因此，根據(jù)本發(fā)明，測定此多態(tài)性可用于進(jìn)行基因診斷。
本發(fā)明敘述了TNFRSF9基因T2DM相關(guān)的新突變點(diǎn)，并提供了一種測定TNFRSF9基因多態(tài)性的方法。而且，根據(jù)本發(fā)明，只需要少量DNA樣品就足以測定TNFRSF9基因的多態(tài)性。結(jié)果，本發(fā)明提供了一種測定T2DM相關(guān)基因多態(tài)性的基因診斷方法。
序列表<110>衛(wèi)生部北京醫(yī)院<120>一種預(yù)測2型糖尿病易感性的方法及試劑<130>
<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2116<212>DNA<213>人屬，人種(Homo sapiens，human)<400>1agaccaagga gtggaaagtt ctccggcagc cctgagatct caaggtctgt ccatctgggg 60gagtgggtgg gggcactgag aaggggtgag cttggaactt ttgctccctt tgcccatttc120tagacttttt ctcctaatat gtaataactt ctcttcaata gccctttaaa taaacatcaa180taacttagcc tgaagagttt ttcactcctt agttttgtta ccatacaaac ttcacatctc240aaaacatgtc tctgtttaag aaaatgtgtt agtgagttga acagggaggt ctttccacat300gttagtagtt aggtgttcag ctaaaggggg aagagtgatt atgtgatagc ttcttcttga360
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<210>2<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>2cagaagcctg aagaccaag 19<210>3<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>3ttgagatgta agtttgtatg g 2權(quán)利要求
1.一種預(yù)測2型糖尿病易感性的方法，其特征在于該方法通過提取宿主細(xì)胞的基因組DNA，測定受試者的TNFRSF9基因內(nèi)含子非編碼區(qū)第91位堿基多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，預(yù)測受試者對2型糖尿病的易感性TNFRSF9基因型為T/T純合子時，受試者的易感性最低；TNFRSF9基因型為C/C純合子時，受試者的易感性較高；TNFRSF9基因型為C/T雜合子時，受試者的易感性最高。
2.一種分離核酸，具有序列表SEQ ID NO.1所示的堿基序列，在第91位為C。
3.一組預(yù)測2型糖尿病易感性的引物，其長度為19～22bp，能特異性地?cái)U(kuò)增出含TNFRSF9基因的SEQ ID NO.1所示序列中的第91位SNP的擴(kuò)增產(chǎn)物，具有序列表SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的堿基序列。
4.一種預(yù)測2型糖尿病易感性的試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求3所述的引物序列和以下試劑，包括60ul 10X PCR緩沖液，50ul 10mM dNTP混合液，10ul(2unit/ul)Taq DNA聚合酶，各12ul(50pmol/ul)F1和R1引物，1.5ml純水，20ul 10X限制酶反應(yīng)緩沖液，10ul(2unit/ul)限制酶Mn1I；本試劑盒供10人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20℃。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預(yù)測2型糖尿病易感性的方法，通過提取宿主細(xì)胞基因組DNA，測定受試者的TNFRSF9基因內(nèi)含子非編碼區(qū)第91位堿基多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，預(yù)測受試者對2型糖尿病的易感性TNFRSF9基因型為T/T純合子時，受試者的易感性最低；TNFRSF9基因型為C/C純合子時，受試者的易感性較高；TNFRSF9基因型為C/T雜合子時，受試者的易感性最高。本發(fā)明中TNFRSF9基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)具有SEQ ID NO.1所示的核酸序列的位于1p36區(qū)域定位在內(nèi)含子1非編碼區(qū)第91位(rs161810)位點(diǎn)上的C堿基替換，是與2型糖尿病發(fā)病相關(guān)的高風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)之一。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是首次闡明了TNFRSF9基因多態(tài)性位點(diǎn)與T2DM的相關(guān)性，提供了一種預(yù)測T2DM易感性的方法，該方法可用于T2DM的預(yù)防、輔助診斷和治療，還可以用于新藥研發(fā)。
文檔編號C12N15/11GK1710106SQ200510080248
公開日2005年12月21日 申請日期2005年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月30日
發(fā)明者楊澤, 紀(jì)立農(nóng), 蔡曉凌, 孫宏, 唐雷, 史曉紅, 朱小泉, 孫亮, 屈彥純, 張寧 申請人:衛(wèi)生部北京醫(yī)院