專利名稱：一個可提高黃原膠產量的基因的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物基因工程領域。具體涉及與黃原膠合成相關的基因，該基因編碼的蛋白質為尿苷二磷酸葡萄糖差向異構酶(UDP-glucose4-epimerase，簡稱rmd)，該基因在野生型野油菜黃單胞菌中表達，可顯著增加黃原膠的產量，可用于黃原膠生產菌株的遺傳改良。
背景技術：
黃原膠是一種由野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonascampestris pv.campestris，簡稱Xcc)所產生的胞外多糖聚合物，由多個“五糖單元”聚合而成。兩個D-葡萄糖分子通過β-(1→4)糖苷鍵連接成主鏈骨架，一條由甘露糖-(β→1，4)-葡萄糖醛酸-(β→1，2)-甘露糖組成的側鏈通過α-(1→3)糖苷鍵連接到主鏈的一個D-葡萄糖殘基，組成一個“五糖單元”。黃原膠具有良好的增粘性和觸變性，極佳的熱、酸、堿穩定性，較強的抗酶解能力，能與大多數的金屬鹽配伍，與常用的溶劑、試劑相容。它是目前國內外已經開發的幾種微生物多糖中最具特色的一種，也是世界上生產規模最大，用途最廣的微生物多糖。已作為助懸劑、增稠劑、乳化劑、穩定劑，在石油開采、醫藥、食品、飲料、化妝品、洗滌劑、涂料等行業中廣泛應用，另外在森林滅火、環境保護方面也有很好的應用前景(Sutherland1986；李信，1995)。美國曾對9種微生物多糖進行評價，黃原膠以其功能全面、用途廣泛而居首位。目前全世界黃原膠的年產量超過5萬噸，在發酵工業中占有十分重要的地位。黃原膠的廣泛應用，為相關的行業創造了巨大的經濟效益。
然而，目前國內黃原膠生產菌株的產量在4％碳源的發酵液中黃原膠產量為27g/L，而發達國家則超過34g/L，選育高產菌株仍有很大的發展空間，可以通過采用①提高黃原膠生物合成相關基因產物的活性(Harding etal 1987；Zha et al 1998)；②增加相關基因的拷貝數(Tseng et al 1992)；③修飾黃原膠生物合成調控基因(Tang et al 1991；Katzen et al 1998)；④修飾與糖代謝有關的基因，降低糖類的其他途徑消耗；⑤改變多聚糖分解酶類基因，以減少胞外多糖的降解，提高產膠率(Schroter et al 2001)；⑥提高胞外多糖轉運酶類活性等方法來改良菌株提高黃原膠產量。

發明內容
本發明提供與黃原膠合成相關的新基因，用于黃原膠生產菌株的遺傳改良，提高黃原膠產量。
因此，本發明的一個目的是提供一種編碼尿苷二磷酸葡萄糖差向異構酶的基因(rmd)，其是下列核苷酸序列之一1)SEQ ID No.1所示的DNA序列；2)與SEQ ID No.1所示DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。
在一個實施方案中，所述的基因具有SEQ ID No.1所示的DNA序列，5’端的第1-939位核苷酸為開放閱讀框。
本發明還涉及含有上述基因的表達載體。優選為pLAFR3-rmd。
本發明另一個目的是提供一種提高黃原膠產量的方法，其特征在于在微生物中高表達上述基因。優選所述微生物是野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)。
具體地講，一種源于野油菜黃單胞菌8004菌株的基因(基因組全序列已在GenBank公布，序列號為CP000050)所表達的尿苷二磷酸葡萄糖差向異構酶或功能類似物，其氨基酸序列與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列具有至少80％的同源性，至少它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本發明還具體地涉及編碼它們的基因。另外還提供了尿苷二磷酸葡萄糖差向異構酶在黃原膠生產中的應用和基因在黃原膠生產和其菌株的遺傳改良中的應用。
SEQ ID No.1是野油菜黃單胞菌8004菌株的基因DNA序列片段，由939個堿基組成。含完整的尿苷二磷酸葡萄糖差向異構酶基因，自5’端的第1-939位核苷酸為該基因的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)，自5’端的第1-3位核苷酸為該基因的起始密碼子GTG，自5’端的第937-939位核苷酸為終止密碼子TGA。SEQ ID No.2所示的氨基酸序列是尿苷二磷酸葡萄糖差向異構酶基因編碼的尿苷二磷酸葡萄糖差向異構酶蛋白產物，由312個氨基酸組成。
本發明提供了一種與黃原膠合成相關的新基因，在黃原膠生產和其菌株的遺傳改良中的應用有著重要的意義。


圖1為rmd基因的PCR產物電泳圖。
M100bp標準DNA(片段大小從大到小依次為3kb，2kb，1.5kb，1.2kb，1kb，0.9kb，0.8kb，0.7kb等)；1rmd基因PCR產物電泳帶，顯示大小為約950bp。
圖2為rmnd基因克隆入表達載體pLARF3后的酶切檢驗。
Mλ/Hind III標準DNA(片段大小從大到小依次為23.1kb，9.4kb，6.6kb，2.4kb，2.0kb)；1克隆載體pLAFR3作為對照的BamHI/EcoRI酶切產物；2表達質粒pLAFR3-rmd的BamHI/EcoRI酶切產物。
圖3為pLAFR3的質粒圖譜。
圖4為驗證rmd基因在轉化株中高表達的RNA實驗。
圖5為rmd基因導入野生型Xcc 8004后，構建高表達菌株。高表達菌株與野生型菌株在NYG+2％葡萄糖上的生長狀況。
具體實施例方式
下文將參考實施例詳細描述本發明，所述實施例僅是意圖舉例說明本發明，而不是意圖限制本發明的范圍。本發明的范圍由后附的權利要求具體限定。
實施例在本發明的實施例中所用到的材料包括黃單胞菌野生型菌株8004，購于英國植物病原細菌國家保藏中心(The National Collection of PlantPathogenic Bacteria，NCPPB)，保藏號為NCPPB No.1145；表達載體pLAFR3(Staskawicz et al，1987)為本研究室(廣西大學生命科學與技術學院分子遺傳研究所)保存。限制性內切酶、修飾酶等試劑購自Promega、Stratagene、TAKARA、QIAGEN等公司；抗生素(利福平、卡那霉素)和培養基原料(蛋白胨、酵母提取粉、甘油)購于上海生物工程公司。
SV Total RNA Isolation System總RNA提取試劑盒購自Promega公司，反轉錄試劑盒ReveAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas公司。
培養基NYG(每升溶液含5g蛋白胨，3g酵母膏和20g甘油，根據三組分縮寫為NYG，pH7.0)。
實施例1 rmd基因的PCR擴增根據rmd的基因序列，設計引物正向引物C3626F，5-CCCGAATTCGTGGCTTCTCATTC-3，反向引物C3 626R，5-CCCGGATCCTCACTGCTCAGTGC-3。
根據野油菜黃單胞菌菌株的rmd基因序列，設計帶有BamHI、EcoRI酶切位點的上下游引物，上游引物命名為C3626F，加有BamHI切點；下游引物命名為C3626R，加有EcoRI切點。以野油菜黃單胞菌菌株NCPPBNo.1145總DNA為模板，PCR擴增該基因全長序列(PCR條件95℃3min；95℃30sec，56℃30sec，72℃1min，30個循環；72℃5min)。電泳圖示PCR產物，大小約950bp(見圖1)。用雙脫氧核苷酸法在ABI 377 DNA自動測序儀上測定DNA核苷酸序列(SEQ ID No.1)。
實施例2 rmd基因高表達質粒的構建及驗證用BamHI/EcoRI酶切PCR產物及pLAFR3(見圖3)并連接，將其rmd基因片段克隆至pLAFR3中，構建表達質粒pLAFR3-rmd并酶切驗證(見圖2)。
實施例3 黃單胞菌轉化子中rmd基因高表達的驗證采用電穿孔法將表達質粒pLAFR3-rmd導入上述黃單胞菌野生菌株中。通過從黃單胞菌轉化子提取質粒，酶切的方法篩選黃單胞菌轉化株。
采用半定量PCR方法檢測rmd基因在轉化株中確實高表達狀況(圖4)。操作方法野生型菌株和測試菌株在NYG培養基中培養18小時，分別提取RNA(SV Total RNA Isolation System總RNA提取試劑盒)，用反轉錄ReveAidTM試劑盒獲得總RNA的cDNA。在分別用16S rDNA上下游引物(GAGGATGATCAGCCACACTG和ACCACATACTCCACCGCTTG)和rmd基因上下游引物(C3626F、C3626R)，以總cDNA為模板，進行PCR(反應條件95℃3min；95℃30sec，61℃30sec，72℃1min，30個循環；72℃5min)。檢測16S rRNA的表達狀況，在確定16S rRNA表達基本一致。電泳帶明亮程度差異明顯，結果表明，在構建的高表達菌種中rmd基因比在野生菌中表達量增高。
實施例4 rmd基因高表達菌株在固體培養基上的生長狀況在NYG+2％葡萄糖固體培養基(NYG加1.5％瓊脂，pH7.0)平板上，用牙簽點接野生型黃單胞菌、rmd基因高表達菌株，28℃培養72小時。結果表明，rmd基因高表達菌株比野生型菌株的胞外多糖產量明顯(見圖5)。
實施例5 rmd基因高表達菌株的黃原膠產量檢測黃原膠產量檢測(Tang D，et al.2005)，可以通過搖瓶發酵，提取黃原膠，對產量進行比較。黃原膠產量作定性分析時，將Xcc的過夜培養物以1％(v/v)的接種量接種至加2％葡萄糖的NYG培養基，28℃搖床培養3天后，取1體積的培養物，緩慢注入到3～7倍體積的無水乙醇中，邊注入邊攪拌，然后將絮狀沉淀物取出后干燥，稱重，換算成每100ml培養物可形成多少克黃原膠進行菌株間的產量比較。對rmd基因高表達菌株與野生型菌株平行進行搖瓶發酵，重復三次，黃原膠產量統計對比結果如表1。結果顯示，培養72小時和120小時rmd基因高表達菌株黃原膠產量分別比野生型菌株提高44.7％和43.9％。證實rmd基因高表達能增加黃原膠的產量。
表1 rmd基因高表達菌株與野生型8004菌株黃原膠產量比較

參考文獻1.李信主編.1995.黃原膠生產與應用，北京中國農業科技出版社.
2.Harding NE.et al.1987.Genetic and physical analyses of a cluster ofgenes essential for xanthan gum biosynthesis in Xanthomonas campestris.JBacteriol. 1692854-2861.
3.Hirsch PR et al.1984.A physical map of pPH1JI and pJB4JI. Plasmid.12139-141.
4.Katzen F et al.1998.Xanthomonas campestris pv.campestris gummutantseffects on xanthan biosynthesis and plant virulence.J Bacteriol.1801607-1617.
5.Liu YG et al.1995 Efficient isolation and mapping of Arabidopsisthaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetric interlaced PCR.PlantJ.8457-63.
6.Liu YN et al.1990.A multipurpose broad host range cloning vector andits use to characterise an extracellular protease gene of Xanthomonascampestris pathovar campestris.Mol Gen Genet.220433-440.
7.Schroter K et al.2001.Xanthomonas campestris pv.campestris secretesthe endoglucanases ENGXCA and ENGXCBconstruction of anendoglucanase-deficient mutant for industrial xanthan production.ApplMicrobiol Biotechnol.55727-733.
8.Sutherland IW.1986.Industrially useful microbial polysaccharides.Microbiol Sci.35-9.
9.Tang DJ， Li XJ，He YQ，et al.The zinc uptake regulator Zur isessential for the full virulence of Xanthomonas campestris pv.campestris. MolPlant-Microbe Interact，2005，18652-658.
10.Tang JL et al.1991.Genetic and molecular analysis of a cluster of rpfgenes involved in positive regulation of synthesis of extracellular enzymes andpolysaccharide in Xanthomonas campestris pathovar campestris.Mol GenGenet 226409-417.
11.Tseng YH et al.1992.Increase of xanthan production by cloning xpsgenes into wild-type Xanthomonas campestris.Lett Appl Microbiol.1443-46.
12.Zha D et al. 1998.Cloning of DNA sequences involved inexopolysaccharide synthesis of Xanthomonas campestris pv.campestris.WeiSheng Wu Xue Bao.38251-255.
序列表<110>廣西大學<120>一個可提高黃原膠產量的基因<130>IB055870<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>939<212>DNA<213>Xanthomonas campestris<400>1gtggcttctc attctgagct gaaaggcaag cgggttctgg tcagtggcgc gtccgggttc60accggacgct acatgtccca gcagctcaag gagcagggct gcaccgtgat cggtgttggg120acccgttgcg acggtgccgg tacaagcgca accgacgagt tctggccgat ggatctgcgt180gacgctgccg acgtcgctcg cgtcgttgcg caggcccaag ccgactacgt tgtgcatctg240gctgcagtgg cctttgtcgg tcatggggat gccgacgatt tttatcgggt caatctgctc300ggcacgcgta acctgctgca ggcgctggcc gcaagccaac accgcccaga gagggtgctg360atcgcgagca gtgccaatgt ctacggcaat gcaaccgagg gcgtgatcga cgagtcggtc420acgccttcgc ccgcgaacga ctacgcggtg agcaagctcg ccatggaata tgtcgccagc480ttgtggcacg agcgcctgcc cctggtgatt gcccgcccat tcaactacac gggggtcggt540caggcgacca atttcctgat tcccaagatt gtttcgcatt tcgcatcgcg cgcctcttcc600atcgagttgg gcaacaccga agtgtggcgg gatttcggcg atgtcagatc ggtcgtgctg660gcttatcgca agcttctgca agcacccgct gcggaagggc agatcgtcaa cgtgtgttcg720ggtgtcgcca gttcgctgag cgacatcatc aggatctgct cgaaaatcac cggccacgac780atcgacgtcc aggtgaatcc cgcattcgtt cggcagaatg aagtcaggaa gttgcttggc840agcaatgcca gattgcagga gctgatcggc gattggcaga gtcttgcgct ggaggatacg900ttgcgctgga tgcttgaagc tgcaagcact gagcagtga 939<210>2<211>312
<212>PRT<213>Xanthomonas campestris<400>2Met Ala Ser His Ser Glu Leu Lys Gly Lys Arg Val Leu Val Ser Gly1 5 10 15Ala Ser Gly Phe Thr Gly Arg Tyr Met Ser Gln Gln Leu Lys Glu Gln20 25 30Gly Cys Thr Val Ile Gly Val Gly Thr Arg Cys Asp Gly Ala Gly Thr35 40 45Ser Ala Thr Asp Glu Phe Trp Pro Met Asp Leu Arg Asp Ala Ala Asp50 55 60Val Ala Arg Val Val Ala Gln Ala Gln Ala Asp Tyr Val Val His Leu65 70 75 80Ala Ala Val Ala Phe Val Gly His Gly Asp Ala Asp Asp Phe Tyr Arg85 90 95Val Asn Leu Leu Gly Thr Arg Asn Leu Leu Gln Ala Leu Ala Ala Ser100 105 110Gln His Arg Pro Glu Arg Val Leu Ile Ala Ser Ser Ala Asn Val Tyr115 120 125Gly Asn Ala Thr Glu Gly Val Ile Asp Glu Ser Val Thr Pro Ser Pro130 135 140Ala Asn Asp Tyr Ala Val Ser Lys Leu Ala Met Glu Tyr Val Ala Ser145 150 155 160Leu Trp His Glu Arg Leu Pro Leu Val Ile Ala Arg Pro Phe Asn Tyr165 170 175Thr Gly Val Gly Gln Ala Thr Asn Phe Leu Ile Pro Lys Ile Val Ser180 185 190His Phe Ala Ser Arg Ala Ser Ser Ile Glu Leu Gly Asn Thr Glu Val195 200 205Trp Arg Asp Phe Gly Asp Val Arg Ser Val Val Leu Ala Tyr Arg Lys
210 215 220Leu Leu Gln Ala Pro Ala Ala Glu Gly Gln Ile Val Asn Val Cys Ser225 230 235 240Gly Val Ala Ser Ser Leu Ser Asp Ile Ile Arg Ile Cys Ser Lys Ile245 250 255Thr Gly His Asp Ile Asp Val Gln Val Asn Pro Ala Phe Val Arg Gln260 265 270Asn Glu Val Arg Lys Leu Leu Gly Ser Asn Ala Arg Leu Gln Glu Leu275 280 285Ile Gly Asp Trp Gln Ser Leu Ala Leu Glu Asp Thr Leu Arg Trp Met290 295 300Leu Glu Ala Ala Ser Thr Glu Gln305 310
權利要求
1.一種編碼尿苷二磷酸葡萄糖差向異構酶的基因(rmd)，其是下列核苷酸序列之一1)SEQ ID No.1所示的DNA序列；2)與SEQ ID No.1所示DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。
2.根據權利要求1所述的基因，其特征在于它具有SEQ ID No.1所示的DNA序列。
3.根據權利要求1所述的基因，其特征在于自5’端的第1-939位核苷酸為開放閱讀框。
4.含有根據權利要求1或2所述的基因的表達載體。
5.根據權利要求4的表達載體，其為pLAFR3-rmd。
6.一種提高黃原膠產量的方法，其特征在于在微生物中高表達根據權利要求1或2所述的基因。
7.根據權利要求6的方法，其中所述微生物是野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)。
全文摘要
本發明公開了來自野油菜黃單胞菌中的一個與黃原膠生產有關的基因——尿苷二磷酸葡萄糖差向異構酶基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。本發明還涉及含有該基因的載體和通過高表達該基因來提高黃原膠產量的方法。
文檔編號C12N15/63GK1952155SQ20051008665
公開日2007年4月25日 申請日期2005年10月20日 優先權日2005年10月20日
發明者何勇強, 唐紀良, 姜伯樂, 唐東階, 陸光濤, 梁曉夏, 危廣寧, 何飛燕, 馮家勛 申請人:廣西大學