專利名稱：一種提高化能自養(yǎng)硫桿菌平板檢出率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高化能自養(yǎng)硫桿菌平板檢出率的方法，是一項利用雙層平板法培養(yǎng)化能自養(yǎng)硫桿菌的微生物分離技術(shù)，屬于環(huán)境微生物技術(shù)領(lǐng)域。
二、技術(shù)背景化能自養(yǎng)硫桿菌-氧化硫硫桿菌Thiobacillus thiooxidans和氧化亞鐵硫桿菌Thiobacillus ferrooxidans，是2種廣泛應(yīng)用于生物濕法冶金、生物淋濾法去除污染介質(zhì)(污泥、底泥等)中重金屬、煤炭生物脫硫的主要細(xì)菌，也是導(dǎo)致酸性礦山廢水形成的主要微生物。它們均屬于中溫、好氧、嗜酸，以CO2為唯一碳源的嚴(yán)格化能自養(yǎng)細(xì)菌，在培養(yǎng)基中生長比異養(yǎng)菌要緩慢得多。研究發(fā)現(xiàn)，在固體平板上，形成菌落時往往需要3～4周時間，且平板的檢出率較低，成為嚴(yán)重影響對硫桿菌進行分離純化及誘變篩選等工作的重要“瓶頸”。作者發(fā)明了一種雙層平板法大幅度地提高了硫桿菌的檢出率，并明顯縮短了固體平板的培養(yǎng)時間。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題發(fā)明一種用于提高化能自養(yǎng)硫桿菌的平板檢出率及縮短培養(yǎng)時間的方法。
技術(shù)方案本發(fā)明提供的氧化亞鐵硫桿菌Thiobacillus ferrooxidans LX5菌株，氧化硫硫桿菌Thiobacillus thiooxidans TS6菌株和酵母菌Rhodotorula sp.R30菌株，是本實驗室自己分離的菌株，現(xiàn)于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存。Thiobacillus ferrooxidans LX5和Thiobacillus thiooxidans TS6為嚴(yán)格化能自養(yǎng)菌。兩菌株特征為呈短桿狀0.3～0.5×1.0～1.5μm，革蘭氏陰性菌，最適溫度30～35℃，最適pH2.0～3.0，好氧、嗜酸、專性化能自養(yǎng)菌。其中Thiobacillus ferrooxidans LX5既可以以亞鐵為能源物質(zhì)，也可利用還原性硫為能源物質(zhì)。但Thiobacillus thiooxidans TS6只能利用還原性硫為能源物質(zhì)，不能氧化亞鐵。酵母菌Rhodotorula sp.R30菌株的單細(xì)胞呈卵圓形，直徑4.5～5.5μm，芽殖。不產(chǎn)生子囊孢子。菌落呈粘質(zhì)樣，產(chǎn)生粉紅色色素，形成莢膜。最適溫度30℃，最適pH3.0～7.0。
提高自養(yǎng)化能硫桿菌平板檢出率的雙層平板法1、酵母菌Rhodotorula sp.R30(保藏號CGMCC No.1147)的培養(yǎng)方法，配制PDA培養(yǎng)基，成分馬鈴薯200g，蔗糖或葡萄糖20g，水1000mL，pH自然，121℃，30min滅菌。液體培養(yǎng)條件從斜面上取酵母菌R30菌苔，接種于PDA液體培養(yǎng)基中，于28～30℃，180r/m搖床上培養(yǎng)2天。
2、氧化硫硫桿菌Thiobacillus thiooxidans TS6(CGMCC NO.0759)的液體培養(yǎng)方法，培養(yǎng)基成分(g/L)(NH4)2SO40.4，KH2PO43.0，CaCl2·2H2O 0.25，MgSO4·7H2O0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，硫粉4.0。用10N硫酸調(diào)pH為3.0，培養(yǎng)條件T.thiooxidans TS6接種在液體培養(yǎng)基中，于28～30℃，180r/m搖床上培養(yǎng)5天，制備TS6菌液。
3、氧化硫硫桿菌Thiobacillus thiooxidans TS6的固體培養(yǎng)基成分A液(NH4)2SO42g、KCl 0.1g、K2HPO40.25g、MgSO4·7H2O 0.25g、Ca(NO3)2·4H2O 0.01g，溶于500mL蒸餾水中，用10N H2SO4調(diào)pH為3.0；B液22.1g Na2S2O3·5H2O溶于300mL蒸餾水中；C液30g瓊脂粉溶于200mL蒸餾水，A、B和C液分開濕熱滅菌后，冷卻至60℃，備用。
4、氧化亞鐵硫桿菌Thiobacillus ferrooxidans LX5(CGMCC NO.0727)的液體培養(yǎng)方法，培養(yǎng)基成分(g/L)(NH4)2SO43.5；KCl 0.116，K2HPO40.058，Ca(NO3)4H2O0.0168，MgSO4·7H2O 0.583，F(xiàn)eSO4·7H2O 44.22。用10N硫酸調(diào)pH2.58，培養(yǎng)條件T.ferrooxidans LX5接種在液體培養(yǎng)基中，于28～30℃，180r/m搖床上培養(yǎng)5天，制備LX5菌液。
5、氧化亞鐵硫桿菌Thiobacillus ferrooxidans LX5的固體培養(yǎng)基成分A液(NH4)2SO43.0；KCl 0.10，K2HPO40.05，Ca(NO3)4H2O 0.01，MgSO4·7H2O 0.5，溶于300mL蒸餾水中，用10N H2SO4調(diào)pH為2.79；B液4g瓊脂糖溶于500mL蒸餾水；C液22.1g FeSO4·7H2O溶于200mL蒸餾水中(pH為2.59)。A液與B液分別濕熱滅菌，C液過濾除菌。冷卻至60℃，備用。
6、配制2％的水瓊脂稱取2g瓊脂溶于100mL蒸餾水中，121℃，30min滅菌。冷卻至60℃，備用。
7、制備雙層平板在無菌平皿中倒入60℃的2％水瓊脂作底層，待平板凝固后，用無菌吸管取0.1mL的酵母菌R30菌液于底層平板上并均勻涂布，放置1～2h。再分別將用于分離T.thiooxidans TS6或T.ferrooxidans LX5的固體培養(yǎng)基A、B、C液3者混合，迅速倒入混勻，作上層平板，凝固后備用。
8、分別取T.thiooxidans TS6和T.ferrooxidans LX5菌液作稀釋，取0.1mL適當(dāng)稀釋的TS6或LX5菌懸液于雙層平板上并均勻涂布，放置20～30min后，置30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。
9、培養(yǎng)11天，計數(shù)菌落，T.thiooxidans TS6菌落直徑約0.5～1mm，呈淡黃色。T.ferrooxidans LX5菌落直徑約1～1.5mm，呈黑褐色。
本發(fā)明的技術(shù)原理用于固體平板法進行硫桿菌分離培養(yǎng)的凝固劑瓊脂粉在倒平板前，須經(jīng)高溫滅菌，而滅菌后瓊脂粉中水溶性有機物含量大幅度升高，實驗發(fā)現(xiàn)，滅菌前僅為96.8mgDOC.L-1(折合干瓊脂重量的4.52％)，滅菌后達到320.9mg.L-1(折合干瓊脂重量的15％)，提高3.3倍。高溫滅菌使瓊脂產(chǎn)生一定的水解作用，從而產(chǎn)生大量的水溶性有機物。硫桿菌是化能自養(yǎng)細(xì)菌，代時長，生長慢，一些低分子量水溶性有機物對它有很大的毒害作用。因此，由于水溶性有機物的存在使得在單層平板上生長的自養(yǎng)菌更趨緩慢。而在雙層平板中，底層的異養(yǎng)微生物酵母菌R30，能消耗瓊脂粉水解產(chǎn)生的水溶性有機物，減輕了培養(yǎng)基中水溶性有機物對硫桿菌生長的抑制，從而縮短了菌落出現(xiàn)的時間，并提高了菌落的檢出率。
有益效果本發(fā)明用雙層平板分離化能自養(yǎng)硫桿菌的方法，具有以下有益效果1、本發(fā)明使用的酵母菌R30，營養(yǎng)要求簡單，易于擴大培養(yǎng)。
2、利用本發(fā)明的雙層平板法分離化能自養(yǎng)的氧化硫硫桿菌T.thiooxidans TS6，在雙層平板上菌落的檢出率比在單層平板上檢出率提高3～4倍，檢出時間由20天縮短至11天。
3、利用本發(fā)明的雙層平板法分離化能自養(yǎng)的氧化亞鐵硫桿菌T.ferrooxidansLX5，在雙層平板上菌落的檢出率是在單層平板上檢出率的2倍多。檢出時間由15天縮短至11天。
具體實施例方式
實施例1制革污泥生物淋濾液中氧化硫硫桿菌T.thiooxidans的檢測。
(1)采樣取南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦實習(xí)基地不同階段的制革污泥生物淋濾液(pH＝4.8，3.2，2.1)。
(2)pH＝4.8，3.2，2.1的三種制革污泥生物淋濾液分別稀釋至10-4，10-5。
(3)酵母菌Rhodotorula sp.R30用PDA液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，28～30℃，180r/m搖床培養(yǎng)2天。
(4)配制2％的水瓊脂稱取2g瓊脂溶于100mL蒸餾水中，121℃，30min滅菌。冷卻至60℃，備用。
(5)制備T.thiooxidans的固體培養(yǎng)基成分A液(NH4)2SO42g、KCl 0.1g、K2HPO40.25g、MgSO4·7H2O 0.25g、Ca(NO3)2·4H2O 0.01g，溶于500mL蒸餾水中，用10N H2SO4調(diào)pH為3.0；B液22.1g Na2S2O3·5H2O溶于300mL蒸餾水中；C液30g瓊脂粉溶于200mL蒸餾水，A、B和C液分開濕熱滅菌后，冷卻至60℃，備用。
(6)制備雙層平板在無菌平皿中倒入60℃的水瓊脂作底層，待平板凝固后，用無菌吸管取0.1mL的酵母菌R30菌液于底層平板并均勻涂布，放置1～2h。再將用于分離T.thiooxidans的固體培養(yǎng)基A、B、C液(60℃)3者混合，迅速倒入混勻，作上層平板，凝固后備用。
(7)分離計數(shù)制革污泥生物淋濾液中的氧化硫硫桿菌T.thiooxidans分別取0.1mL稀釋至10-4，10-5的制革污泥生物淋濾液，于雙層平板上均勻涂布，放置20～30min后，置30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，每個樣品做三個重復(fù)。并做單層平板(無涂布有酵母菌R30菌液的水瓊脂層)涂布分離對照。
(8)培養(yǎng)11，20天，分別計數(shù)T.thiooxidans在單、雙層平板上的菌落數(shù)，結(jié)果見表1。
表1 三種制革污泥生物淋濾液中T.thiooxidans在單、雙層平板上的檢出效果

實施例2從礦山廢水中分離氧化亞鐵硫桿菌Thiobacillus ferrooxidans(1)采樣安徽馬鞍山某礦山廢水(2)在100mL礦山廢水中加入適量的T.ferrooxidans無機鹽培養(yǎng)液，于30℃，180r/m搖床上富集培養(yǎng)7天，然后稀釋至10-2，10-3，10-4。
(3)酵母菌Rhodotorula sp.R30用PDA液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，28～30℃，180r/m搖床培養(yǎng)2天。
(4)配制2％的水瓊脂同實例1(5)制備T.ferrooxidans的固體培養(yǎng)基成分A液(NH4)2SO43.0；KCl 0.10，K2HPO40.05，Ca(NO3)4H2O 0.01，MgSO4·7H2O 0.5，溶于300mL蒸餾水中，用10N H2SO4調(diào)pH為2.79；B液4g瓊脂糖溶于500mL蒸餾水；C液22.1g FeSO4·7H2O溶于200mL蒸餾水中(pH為2.59)。A液與B液分別濕熱滅菌，C液過濾除菌。冷卻至60℃，備用。
(6)制備雙層平板在無菌平皿中倒入60℃的水瓊脂作底層，待平板凝固后，用無菌吸管取O.1mL的酵母菌R30菌液于底層平板并均勻涂布，放置12h。再將用于分離T.ferrooxidans的固體培養(yǎng)基A、B、C液(60℃)3者混合，迅速倒入混勻，作上層平板，凝固后備用。
(7)分離計數(shù)礦山廢水中的氧化亞鐵硫桿菌T.ferrooxidans分別取0.1mL稀釋至10-2，10-3，10-4的礦山廢水，于雙層平板上均勻涂布，放置20～30min后，置30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，每個樣品做三個重復(fù)。并做單層平板(無涂布有R30菌液的水瓊脂層)涂布分離對照。
(8)培養(yǎng)8，15天，分別計數(shù)T.ferrooxidans在單、雙層平板上的菌落數(shù)，結(jié)果見表2。
表2 礦山廢水中T.ferrooxdans在單、雙層平板上的檢出效果

權(quán)利要求
1.一種提高化能自養(yǎng)菌硫桿菌平板檢出率的方法，其特征在于，用2％的水瓊脂作底層平板，上面涂布異養(yǎng)菌酵母Rhodotorula sp.R30菌液，上面再倒入分離自養(yǎng)菌硫桿菌的固體培養(yǎng)基制成雙層平板，再在雙層平板上涂布待分離的含化能自養(yǎng)菌硫桿菌的菌液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高化能自養(yǎng)菌平板檢出率的方法，其特征在于用2％的水瓊脂作底層平板，上面涂布異養(yǎng)菌如酵母Rhodotorula sp.R30(但不限于此)。異養(yǎng)菌酵母菌Rhodotorula sp.R30的培養(yǎng)方法，其特征在于用PDA液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，于28～30℃和180r/m下?lián)u床培養(yǎng)2天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高化能自養(yǎng)菌平板檢出率的方法，其特征在于權(quán)利要求1中所述的倒入分離自養(yǎng)菌硫桿菌的固體培養(yǎng)基是指氧化硫硫桿菌Thiobacillus thiooxidans固體培養(yǎng)基和氧化亞鐵硫桿菌Thiobacillus ferrooxidans的固體培養(yǎng)基。氧化硫硫桿菌Thiobacillus thiooxidans固體培養(yǎng)基的成分為A液(NH4)2SO42g、KCl 0.1g、K2HPO40.25g、MgSO4·7H2O 0.25g、Ca(NO3)2·4H2O 0.01g，溶于500mL蒸餾水中，用10N H2SO4調(diào)pH為3.0；B液22.1gNa2S2O3·5H2O溶于300mL蒸餾水中；C液30g瓊脂粉溶于200mL蒸餾水，A、B和C液分開濕熱滅菌后，冷卻至60℃，備用。氧化亞鐵硫桿菌Thiobacillus ferrooxidans的固體培養(yǎng)基成分A液(NH4)2SO43.0；KCl 0.10，K2HPO40.05，Ca(NO3)4H2O 0.01，MgSO4·7H2O 0.5，溶于300mL蒸餾水中，用10N H2SO4調(diào)pH為2.79；B液4g瓊脂糖溶于500mL蒸餾水；C液22.1g FeSO4·7H2O溶于200mL蒸餾水中(pH為2.59)。A液與B液分別濕熱滅菌，C液過濾除菌。冷卻至60℃，備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高化能自養(yǎng)菌平板檢出率的方法，其特征在于制備雙層平板是指在無菌平皿中倒入已溶化并冷卻至60℃的水瓊脂作底層，待平板凝固后，用無菌吸管取0.1mL的酵母菌R30菌液于底層平板并均勻涂布，放置1～2h。再分別將用于分離T.thiooxidans或T.ferrooxidans的固體培養(yǎng)基A、B、C液3者混合，迅速倒入混勻，作上層平板，凝固后成雙層平板。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高化能自養(yǎng)菌平板檢出率的方法，其特征在于在雙層平板上涂布待分離的含化能自養(yǎng)菌硫桿菌的菌液，其方法是分別取0.1mL適當(dāng)濃度的含T.thiooxidans或T.ferrooxidans菌懸液于雙層平板均勻涂布，放置20～30min后，置30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。并計算T.thiooxidans或T.ferrooxidans的菌落數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高化能自養(yǎng)硫桿菌平板檢出率的方法，是一項利用雙層平板法培養(yǎng)化能自養(yǎng)硫桿菌的微生物分離技術(shù)。用2％的水瓊脂作底層平板，上面涂布酵母Rhodotorula sp.R30菌液，再倒入分離硫桿菌的固體培養(yǎng)基作上層平板，涂布一定稀釋度的含硫桿菌的懸液，于30℃下倒置培養(yǎng)。氧化硫硫桿菌Thiobacillus thiooxidans菌落在雙層平板上檢出的時間比單層平板提早9天，檢出率提高3～4倍，氧化亞鐵硫桿菌Thiobacillus ferrooxidans菌落在雙層平板上檢出的時間比單層平板提早5～7天，檢出率提高2倍多。硫桿菌是嚴(yán)格的化能自養(yǎng)細(xì)菌，代時長，生長慢，在單層固體平板上形成菌落往往需要3～4周時間，且檢出率較低，利用雙層平板分離培養(yǎng)是一種快速有效的分離方法。
文檔編號C12R1/01GK1746315SQ20051009442
公開日2006年3月15日 申請日期2005年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月19日
發(fā)明者王世梅, 周立祥 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)