專利名稱：菊酸乙酯酯酶及其編碼基因與其表達專用工程菌和該酶的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及酶及其編碼基因與其表達專用工程菌和該酶的應用，特別是涉及一種菊酸乙酯酯酶及其編碼基因與其表達專用工程菌和該酶在生產(+)-反式菊酸中的應用。
背景技術：
菊酸(Chrysanthemic acid，[2，2-二甲基-3-(2-甲基-1-丙烯基)環丙烷羧酸]，分子結構見式1)是一種新型、高效、低毒的擬除蟲菊酯類殺蟲劑的重要中間體，因其作為人工合成的擬除蟲菊酯類殺蟲劑的酸性部分而被廣泛地應用于此類殺蟲劑的合成。此外，菊酸也是國際上最流行的美白成分之一，能夠有效抑制酪氨酸酶的活性。
式1擬除蟲菊酯是一種模擬天然除蟲菊酯的化學結構合成的殺蟲劑。它的分子結構由菊酸和醇兩部分組成。迄今為止，人工合成的擬除蟲菊酯已近萬種。目前廣泛使用的有20多種，以氯菊酯、溴菊酯、氯氰菊酯、甲醚菊酪，氰戊菊酯、節菊酯(敵殺死)和殺滅菊酪(速滅殺丁)等為代表。
我國于70年代開始在農業生產中推廣使用擬除蟲菊酯。這類農藥的特點為對哺乳動物毒性較低，除蟲毒性大于胃毒，且沒有內吸毒性；低溫效果高于高溫，在環境中持留時間短，對害蟲的擊倒力強；它們除作殺蟲劑外，尚可用于殺螨、防霉等用途?；谏鲜鎏攸c，該類農藥具有廣闊的應用前景。
采用人工化學反應合成擬除蟲菊酯，一直無法解決合成產物中混雜幾乎無任何作用的光學異構體的難題。合成擬除蟲菊酯類殺蟲劑的關鍵性中間體是菊酸(Campbell，I.G.M.，and S.H.Harper.The chrysanthemumcarboxylic acids.IV.Opticalresolution of the chrysanthemic acids.J.Sci.Food Agric.1952，3189-192.；Yoshioka，H.，and J.Miyamoto.Synthetic Pyrethroids(1).Chem.Biol.1976，14427-434.(In Japanese.))，它有四種同分異構體。
研究表明，菊酸的四種立體異構體分別與一定結構的菊醇形成的除蟲菊酯的殺蟲活性相差很大，通常以(+)-反式-菊酸形成的菊酯的殺蟲活性最高(Schneider，M.，N.Engel，and H.Boensmann.Enzymatic synthesis of chiral building blocks fromracematespreparation of(1R，3R)-chrysanthemic，-permethrinic and-caronicacids from racemic，diastereomeric mixtures.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1984，2364-66.)，因此分離菊酸的四種立體異構體是擬除蟲菊酯研究及生產中的重要環節之一。
現今，國內常利用化學拆分劑和立體異構體光學拆分的方法進行菊酸的化學合成，但利用生物合成的方法進行菊酸的工業化生產還未見報道(鐘民，陳良.順式(+-)菊酸動力學拆分研究.華東師范大學學報(自然科學版).1995，355-60.)。
國外亦主要用化學方法合成菊酸(Synthetic pyrethroids chemical WATCHfactsheet 2003，Beyond Pesticides.；Aratani，T.，Y.Yoneyoshi，and T.Nagase.Asymmetric synthesis of chrysanthemic acid.An application of copper carbenoidreaction.Tetrahedron Lett.1975，211707-1710.)。菊酸合成過程中重點強調環丙烷部分的合成，依據該部分的合成方法，可把菊酸的化學合成方法歸為兩類(a)ylide，carbenoid化學，和其它相關的[2+1]補充；(b)1，3-消旋和相關的2，2-dimethyldimedone同分異構體(Stephane Jeanmart.Trends in chrysanthemic acidchemistryA survey of recent pyrethrum syntheses.Aust.J.Chem.2003，56，559-566.)。上述化學合成方法亦未能解決合成產物中混雜幾乎無任何作用的光學異構體的難題。關于菊酸生物合成方法的研究，Masako nishizawa等人的研究最富有成果，但還存在一些不完善的地方，如在可溶性及分泌表達等方面仍需完善。他們用環形節桿菌(Arthrobacter globiformis)的菊酸乙酯酯酶在大腸桿菌中發酵表達，利用產生的菊酸乙酯酯酶生物合成(+)-反式菊酸，但獲得的菊酸乙酯酯酶的酶活力較低(Masako nishizawa，Masatoshi shimizu，Hideo ohkawa，and Masaharu kanaoka.Steroselective production of(+)-trans-chrysanthemic acid by a microbialesterasecloning，nucleotide sequence，and overexpression of the esterasegene of Arthrobacter globiformis in Escherichia coli.Applied AndEnvironmental Microbiology.1995，613208-3215.)。
環形節桿菌菊酸乙酯酯酶(ethyl chrysanthemate esterase，ECE)基因(GenBank號為L22516)是從一種環形節桿菌(Arthrobacter globiformis SC-6-98-28)中克隆得到的，此基因編碼由375個氨基酸殘基組成的蛋白，蛋白分子量約為40KD。它是迄今為止所發現的唯一一個能很好辨別(+/-)-cis，trans-菊酸乙酯的酯酶(Masakonishizawa，Masatoshi shimizu，Hideo ohkawa，and Masaharu kanaoka.Steroselective production of(+)-trans-chrysanthemic acid by a microbialesterasecloning，nucleotide sequence，and overexpression of the esterasegene of Arthrobacter globiformis in Escherichia coli.Applied AndEnvironmental Microbiology.1995，613208-3215.)。此酯酶能立體選擇性地水解(+)-反式-菊酸乙酯為(+)-反式-菊酸和乙醇，而對其它菊酸乙酯立體異構體不起作用，從而為(+)-反式-菊酸的合成提供了一個良好的途徑(Nishizawa，M.，H.Gomi，and F.Kishimoto.Purification and some properties of carboxylesterase fromArthrobacter globiformisstereoselective hydrolysis of ethyl chrysanthemate.Biosci.Biotechnol.Biochem.1993，57594-598.)。與常規的擬除蟲菊酯的化學合成方法相比，利用該酶不僅能簡化流程，且能提供高度專一活性的擬除蟲菊酯。研究表明，此酶穩定性好，可利用固定化酶技術，在酶反應器中選擇最佳條件不間斷地生產(+)-反式-菊酸。若能使此合成途徑高效地運作起來，必將帶來美好的應用前景并取得良好的經濟效益(K.H.E.Lam，K.C.Chow，W.K.R.Wong.Construction ofan efficient Bacillus subtillis system for extracellar production ofheterologous proteins.Journal of Biotechnology 1998，63167-177.)。

發明內容
本發明的目的是提供一種菊酸乙酯酯酶及其編碼基因。
本發明所提供的菊酸乙酯酯酶，命名為ECE1，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有菊酸乙酯酯酶活性的蛋白質。
序列表中的SEQ ID №1由375個氨基酸殘基組成。
編碼上述菊酸乙酯酯酶的基因(ECE1)也屬于本發明的保護范圍，它是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件為雜交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中的SEQ ID №2由1128個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1到第1128位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質。
含有本發明基因的表達載體、轉基因細胞系均屬于本發明的保護范圍。
擴增上述菊酸乙酯酯酶編碼基因中任一片段的引物對也在本發明的保護范圍之內。
本發明的另一個目的是提供一種菊酸乙酯酯酶的專用表達工程菌，是將含有上述菊酸乙酯酯酶基因ECE1的表達載體導入枯草芽孢桿菌中得到的。
用于構建所述含有菊酸乙酯酯酶基因ECE1的表達載體的出發載體可為pMA5、pBE2、pSBPTQ、pC194或pM2Veg等，優選為pMA5。
以pMA5為出發載體，構建的含有菊酸乙酯酯酶基因ECE1的表達載體為pMA5-ECE1。
所述枯草芽孢桿菌可為枯草芽孢桿菌DB1342、WB700、DB104或WB600等，優選為枯草芽孢桿菌DB1342。
本發明的第四個目的是提供一種(+)-反式菊酸的生產方法。
本發明所提供的(+)-反式菊酸的生產方法，是發酵上述菊酸乙酯酯酶的專用表達工程菌，獲得菊酸乙酯酯酶，再加入底物(+)-反式菊酸乙酯，得到(+)-反式菊酸。
上述生產方法中，所述發酵用培養基可為普通枯草芽孢桿菌培養基或2×MSR培養基。普通枯草芽孢桿菌培養基配方為每1000mL水中含2-3％酵母浸出物，1-2％蛋白胨，0.1-0.2％K2HPO4.3H2O，0.1％KH2PO4和1％NaCl，其余為水；2×MSR培養基配方為每1000mL水中含5％酵母浸出物，3％蛋白胨，0.6％K2HPO4，1.0％葡萄糖，其余為水。所述百分比濃度均為質量百分濃度。
發酵溫度為27-42℃，優選為35-37℃；發酵時間為24-148小時，優選為72-120小時。
本發明在原有的環形節桿菌(Arthrobacter globiformis SC-6-98-28)的菊酸乙酯酯酶基因序列的基礎上，根據枯草桿菌的密碼子偏好性對編碼菊酸乙酯酯酶的前10個氨基酸殘基的密碼子用PCR的方法進行改造，改造后的基因可在枯草桿菌中高水平表達菊酸乙酯酯酶，并利用枯草桿菌表達載體將改造的基因轉化到枯草桿菌中，獲得了菊酸乙酯酯酶的表達工程菌。該工程菌在普通枯草芽孢桿菌培養基或2×MSR培養基中經24-148小時發酵后，即可產生酶活較高的菊酸乙酯酯酶，酶活力可達到5.7×105U/L，顯著高于用已有方法生產的菊酸乙酯酯酶的酶活力，并且該工程菌具有表達量高，生產成本低，易于產業化的優點。實驗證明，本發明的菊酸乙酯酯酶可轉一性的作用于(+)-反式菊酸乙酯，并生成(+)-反式菊酸。本發明具有較高的實用性和可推廣性，在(+)-反式菊酸的工業化生產中具有廣闊的應用前景。
說明書附1為PCR擴增的菊酸乙酯酯酶基因的1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖2為ECE1專用表達載體pMA5-ECE1的構建示意3為ECE1的枯草芽孢桿菌表達產物的SDS-PAGE蛋白電泳檢測結果圖4為pMA5-ECE1在普通枯草芽孢桿菌培養基中發酵不同時間的培養液的酶活力測定結果具體實施方式
下屬實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，所有百分比濃度均為質量百分比濃度，所有引物合成及測序工作均由上海生工完成。
實施例1、菊酸乙酯酯酶基因ECE1的克隆1、PCR擴增菊酸乙酯酯酶基因根據已公開的菊酸乙酯酯酶基因的核苷酸序列(GenBank號為L22516)設計引物，引物序列如下ECE-UP(上游引物)5’-GAGCTCCATGGATGCACAGACGATTGCC-3’；ECE-Down(下游引物)5’-GAAGACTCCTACTGAGCCAGTTCGG-3’其中，上游引物引入了限制性內切酶NcoI識別序列(帶下劃線堿基)，并將菊酸乙酯酯酶基因的起始密碼子“GTG”改為“ATG”。以環形節桿菌(Arthrobacterglobiformis)的基因組DNA為模板，在引物ECE-UP和引物ECE-Down的引導下，PCR擴增菊酸乙酯酯酶基因。PCR反應體系為1μl經5分鐘超聲波處理過的環形節桿菌菌液，上、下游引物各1μl，1μl 10mM dNTP，5μl 10倍PCR緩沖液，0.5μl pfuTaq酶(Stratagene公司)，補水至50μl；PCR反應條件為首先94℃ 5min；然后94℃ 1min，55℃ 30sec，72℃延伸2min，共30個循環；最后72℃ 10min。反應結束后，對PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如

圖1所示(泳道M為MarkerIII(北京奇華盛公司)，泳道1為PCR產物)，PCR擴增出了大小約1200bp的單一條帶，與預期結果相符。再將PCR產物克隆入載體pMD18T(TaKaRa公司)中，得到含有菊酸乙酯酯酶基因的重組載體，命名為pMD18T-ECE。用測序的方法做進一步的鑒定，測序結果表明擴增的菊酸乙酯酯酶基因與已公開的菊酸乙酯酯酶基因一致。
2、菊酸乙酯酯酶基因核苷酸序列的改造為在枯草桿菌中高水平表達菊酸乙酯酯酶，在原有菊酸乙酯酯酶基因核苷酸序列的基礎上，根據枯草桿菌的密碼子偏好性對編碼菊酸乙酯酯酶的前10個氨基酸殘基的密碼子用PCR的方法進行改造，首先根據枯草桿菌的密碼子偏好性設計引物，引物序列如下引物1(上游引物)5’-GGAATTCCATATGGACGCTCAAACTATCGCTCCTGGATTCGAATCAGTCGCC-3’；引物2(下游引物)5’-GAAGATCTCTACTGAGCCAGTTCGGTGAC-3’再以步驟1構建的含有菊酸乙酯酯酶基因的重組載體pMD18T-ECE為模板，在引物1和引物2的引導下，PCR擴增經改造的菊酸乙酯酯酶基因。PCR反應體系為1μlpMD18T-ECE質粒，上、下游引物各1μl，1μl 10mM dNTP，5μl 10倍PCR緩沖液，0.5μl pfu Taq酶，補水至50μl；；PCR反應條件為首先94℃ 5min；然后94℃1min，55℃ 30sec，72℃延伸1min 30sec，共30個循環；最后72℃ 10min。反應結束后，對PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR擴增出了大小約1200bp的單一條帶，與預期結果相符。再將PCR產物克隆入載體pMD18T中，用測序的方法做進一步的鑒定，測序結果表明獲得的經改造的菊酸乙酯酯酶基因具有序列表中SEQ ID№2的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №2由1128個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1到第1128位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質，序列表中的SEQ ID №1由375個氨基酸殘基組成，將獲得的經改造的菊酸乙酯酯酶基因命名為ECE1。
實施例2、ECE1專用表達工程菌的構建1、ECE1專用表達載體pMA5-ECE1的構建如圖2所示，ECE1專用表達載體pMA5-ECE1的構建方法為用無水乙醇沉淀并回收實施例1 PCR擴增的ECE1，將其用限制性內切酶NdeI和BglII雙酶切后，與經限制性內切酶NdeI和BamHI雙酶切的載體pMA5用T4DNA連接酶連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，經篩選挑取轉化子提質粒，用限制性內切酶NdeI和XbaI進行酶切鑒定，經酶切獲得1100bp片段的為陽性克隆，再對陽性克隆質粒用PCR的方法做進一步鑒定，所用引物為實施例1中的引物1和引物2，對PCR產物進行測序，測序結果表明構建的含ECE1的重組表達載體正確，將其命名為pMA5-ECE1。
2、ECE1專用表達工程菌BSMA5-ECE1的構建將pMA5-ECE1用熱擊的方法轉化枯草芽孢桿菌DB1342(基因型his nprR2 nprE18aprAS epr)，將經鑒定正確的整合有pMA5-ECE1的枯草芽孢桿菌轉化子命名為BSMA5-ECE1。
實施例3、ECE1在枯草芽孢桿菌中的表達及酶活力的測定一、ECE1在枯草芽孢桿菌中的表達普通枯草芽孢桿菌培養基配方每1000mL水中含2-3％酵母浸出物，1-2％蛋白胨，0.1-0.2％ K2HPO4.3H2O，0.1％KH2PO4，1％NaCl。
將實施例2構建的ECE1專用表達工程菌BsMA5-ECE1接種于普通枯草芽孢桿菌培養基中，在37℃下連續培養120h，以轉化有pMA5空載體的枯草芽孢桿菌DB1342和轉化有ECE1的大腸桿菌BL21(DE3)plys(將ECE1克隆入載體pET26(Navagen公司)中，得到含有ECE1的大腸桿菌表達載體，命名為pET26-ECE1，再將pET26-ECE1轉化大腸桿菌BL21(DE3)plys，經篩選獲得陽性克隆轉化子，發酵培養條件為37℃下培養12h。)為對照。于第三天取樣(每份樣品1.5mL)，提取總蛋白，進行SDS-PAGE蛋白電泳檢測，檢測結果如圖3所示(泳道M為Marker，泳道1為轉化有pMA5空載體的枯草芽孢桿菌DB1342的培養液上清，泳道2為轉化有pMA5空載體的枯草芽孢桿菌DB1342經超聲破碎后的培養液上清，泳道3為轉化有pMA5空載體的枯草芽孢桿菌DB1342經超聲破碎后濃縮的培養液上清，泳道4 BsMA5-ECE1的培養液上清，泳道5為BsMA5-ECE1經超聲破碎后的培養液上清，泳道6為BsMA5-ECE1經超聲破碎后濃縮的的培養液上清，泳道7為BsMA5-ECE1經濃縮的上清，泳道8為轉化有pET26-ECE1的大腸桿菌BL21(DE3)plys轉化子經發酵后的培養液上清，泳道9為轉化有pET26-ECE1的大腸桿菌BL21(DE3)plys轉化子經發酵后重懸的沉淀)，結果表明ECE1在普通枯草芽孢桿菌中獲得了表達(圖中箭頭所指)，表達產物的分子量約為40KD，與預期結果相符。
二、ECE1的枯草芽孢桿菌表達產物的酶活力測定1、在普通枯草芽孢桿菌培養基中ECE1的枯草芽孢桿菌表達產物的相對酶活力測定按步驟一所述的方法在枯草芽孢桿菌中發酵表達ECE1，每隔24h取培養液15μl測酶活，為測定質粒穩定性，將連續培養120h后轉接在普通枯草芽孢桿菌培養基中，再連續培養120h，每隔24h取培養液15μl測酶活。蛋白相對酶活是以721分光光度計測定254nm處的吸光值。菊酸乙酯的快速酶活性檢測用酚酞二丁酸酯(Phenolphthalein Dibutyrate，Sigma-Aldrich R289086)。反應混合液含1.5mL 200mM甘氨酸-氫氧化鈉(pH 10.0)5μl 10mM的酚酞二丁酸酯。40℃溫育3min后，加入適量的酶ECE1或培養液(25μl)，40℃下反應。用分光光度計測定550nm光吸收的增長速率。以轉化有pMA5空載體的枯草芽孢桿菌DB1342的培養液為對照，測定5min內不同處理在254nm的吸光值。結果如表1所示，發酵BsMA5-ECE1獲得的酯酶ECE1的活性很高，550nm處的光吸收值最高為0.5，對照設為0。
表1 通枯草芽孢桿菌培養基上發酵不同時間BsMA5Z2-ECE1獲得的ECE1的相對酶活測定結果 2、在2×MSR培養基中ECE1的枯草芽孢桿菌表達產物的相對酶活力測定2×MSR培養基配方5％酵母浸出物，3％蛋白胨，0.6％K2HPO4，1.0％葡萄糖。
將培養基換成2×MSR培養基，其余發酵條件與步驟1相同，以環形節桿菌(Arthrobacter globiformis)為對照，發酵結束后，分別取1、2、6、15μl菌液測定相對酶活，結果如表2所示，發酵BsMA5-ECE1獲得的酯酶ECE1的活性很高，550nm處的光吸收值最高為0.52。
表2 用2×MSR培養BsMA5Z2-ECE1后取不同量菌液的的相對酶活測定結果 3、在普通枯草芽孢桿菌培養基中ECE1的枯草芽孢桿菌表達產物和環形節桿菌(Arthrobacter globiformis)發酵產物的相對酶活力比較分別取37℃搖床培養2天的3mL原始菌種環形節桿菌(Arthrobacterglobiformis)LB液體培養液和37℃搖床培養5天的3mL BsMA5-ECE1的普通枯草芽孢桿菌培養液作相對酶活性比較，具體方法為接種環形節桿菌(Arthrobacterglobiformis)于3mL LB液體培養基中，37℃搖床培養2天，把3ml菌液離心到一個1.5ml離心管中，棄上清(上清幾乎沒有測到酶活性)，把菌體同離心管中殘余的培養液混勻，成為濃縮的菌體混懸物，約60μl。同時以BsMA5-ECE1在3mL普通枯草培養基中37℃搖床培養發酵5天。分別取前者60μl中的15μl，后者發酵5天的培養液1μl，2μl，6μl，15μl加入到1.5mL反應液40℃反應5min(以BsMA5-ECE1 37℃搖床培養發酵4天為對照，設為0)，然后用721分光光度計測550nm的光吸收值，結果如表3所示。由表1和表2可以粗略計算出在枯草桿菌表達系統中經發酵產生的ECE1相對酶活性為發酵環形節桿菌所產生的菊酸乙酯酯酶的500-750倍。
表3 BsMA5Z2-ECE1與環形節桿菌相對酶活的對比
4、在普通枯草芽孢桿菌培養基中ECE1的枯草芽孢桿菌表達產物的絕對酶活力測定相對酶活力沒有嚴格依據一般酶效率的計算方法，因此只能作初步估計。絕對酶活力酶活力則根據一個酶活單位的定義40℃反應每分鐘產生1μmol酚酞的酶量。分別在0，5，10，15，20min時間段取樣，計算回歸方程。根據比爾定律A＝εbc(1)其中，A為吸光度；ε為消光系數；b為光程；c為吸光物質濃度。在波長、溶液和溫度確定的情況下，物質的摩爾消光系數是由給定物質的特性決定的。Nishizawa等人(Nishizawa，M.，H.Gomi，and F.Kishimoto.Purification and some propertiesof carboxylesterase from Arthrobacter globiformisstereoselectivehydrolysis of ethyl chrysanthemate.Biosci.Biotechnol.Biochem.1993，57594-598.)測得的酚酞二丁酸酯消光系數為23200/M.cm。酶活力單位可以依據其定義和上述公式計算得出。分析不同時間段254nm處BsMA5-ECE1在普通枯草芽孢桿菌培養基中發酵的培養液吸收值的變化，如圖4所示(發酵液離心后上清(a)，沉淀用PBS懸浮后上清(b)，以及超聲波破碎細胞壁后離心上清(c))。由于上清最易得到，且量大，因此最具有實際意義。上清的回歸方程為y＝0.0164x+0.141，按公式(1)計算出上清酶活力為1.41U/25ul酶液，約合5.7萬單位/升發酵液。
實施例4、用本發明的菊酸乙酯酯酶ECE1制備(+)-反式菊酸的特異性分析取500ul菊酸乙酯混合物((+)-反式(-)-反式(+)-順式(-)-順式＝45∶45∶5∶5(重量分數比))加入到24.5mL的200mM甘氨酸溶液(pH10.0)，再加入50ul實施例3表達的菊酸乙酯酯酶ECE1酶液(1.41U/25ul)，在500rpm、45℃下反應24h后用2mL 35％HCl終止反應。然后用甲基異丁酮(MIBK)萃取，在5mL萃取液中加入100ul二氯苯胺和100ul二環己基碳二胺，室溫反應3h，反應液用1.0N HCl和水洗，MgSO4脫水后用高壓液相色譜(HPLC)進行產物分析。HPLC反應中用Bio-Rad Hipore C18反向色譜柱分析，流動相為己烷∶二氯甲烷＝17∶3，流速1mL/min，在254nm處檢測。結果表明，加入酶液的處理在18.5min有產物(+)-反式菊酸胺洗脫峰出現。測定反應生成的(+)-反式菊酸和未水解的(+)-反式菊酸乙酯，沒有生成其它類型的菊酸異構體，表明本發明的菊酸乙酯酯酶ECE1的底物僅為(+)-反式菊酸乙酯。用該酶可以替代化學法，直接用(+)-反式菊酸乙酯耒生產(+)-反式菊酸。
序列表<160>2<210>1<211>375<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Met Asp Ala Gln Thr Ile Ala Pro Gly Phe Glu Ser Val Ala Glu Leu1 5 10 15Phe Gly Arg Phe Leu Ser Glu Asp Arg Glu Tyr Ser Ala Gln Leu Ala20 25 30Ala Tyr His Arg Gly Val Lys Val Leu Asp Ile Ser Gly Gly Pro His35 40 45Arg Arg Pro Asp Ser Val Thr Gly Val Phe Ser Cys Ser Lys Gly Val50 55 60Ser Gly Leu Val Ile Ala Leu Leu Val Gln Asp Gly Phe Leu Asp Leu65 70 75 80Asp Ala Glu Val Val Lys Tyr Trp Pro Glu Phe Gly Ala Glu Gly Lys85 90 95Ala Thr Ile Thr Val Ala Gln Leu Leu Ser His Gln Ala Gly Leu Leu100 105 110Gly Val Glu Gly Gly Leu Thr Leu Ala Glu Tyr Asn Asn Ser Glu Leu115 120 125Ala Ala Ala Lys Leu Ala Gln Met Arg Pro Leu Trp Lys Pro Gly Thr130 135 140Ala Phe Gly Tyr His Ala Leu Thr Ile Gly Val Phe Met Glu Glu Leu
145 150 155 160Cys Arg Arg Ile Thr Gly Ser Thr Leu Gln Glu Ile Tyr Glu Gln Arg165 170 175Ile Arg Ser Val Thr Gly Ala His Phe Phe Leu Gly Leu Pro Glu Ser180 185 190Glu Glu Pro Arg Tyr Ala Thr Leu Arg Trp Ala Ala Asp Pro Ser Gln195 200 205Pro Trp Ile Asp Pro Ala Ser His Phe Gly Leu Ser Ala Asn Ser Ala210 215 220Val Gly Asp Ile Leu Asp Leu Pro Asn Leu Arg Glu Val Arg Ala Ala225 230 235 240Gly Leu Ser Ser Ala Ala Gly Val Ala Ser Ala Glu Gly Met Ala Arg245 250 255Val Tyr Ala Ala Ala Leu Thr Gly Leu Ala Ala Asn Gly Asp Arg Ala260 265 270Ala Val Ala Pro Leu Leu Ser Glu Glu Thr Ile Gln Thr Val Thr Ala275 280 285Glu Gln Val Phe Gly Ile Asp Arg Val Phe Gly Glu Thr Ser Cys Phe290 295 300Gly Thr Val Phe Met Lys Ser His Ala Arg Ser Pro Tyr Gly Ser Tyr305 310 315 320Arg Ala Phe Gly His Asp Gly Ala Ser Ala Ser Leu Gly Phe Ala Asp325 330 335Pro Val Tyr Glu Leu Ala Phe Gly Tyr Val Pro Gln Gln Ala Glu Pro340 345 350Gly Gly Ala Gly Cys Arg Asn Leu Glu Leu Ser Ala Ala Val Arg Lys355 360 365Ala Val Thr Glu Leu Ala Gln370 375<210>2
<211>1128<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
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權利要求
1.一種菊酸乙酯酯酶，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有菊酸乙酯酯酶活性的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的菊酸乙酯酯酶，其特征在于所述菊酸乙酯酯酶具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列。
3.編碼權利要求1所述的菊酸乙酯酯酶的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.根據權利要求3所述的基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
5.含有權利要求3所述基因的表達載體和轉基因細胞系。
6.一種菊酸乙酯酯酶的專用表達工程菌，是將含有權利要求3所述的菊酸乙酯酯酶基因的表達載體導入枯草芽孢桿菌中得到的。
7.根據權利要求6所述的工程菌，其特征在于用于構建所述含有權利要求3所述菊酸乙酯酯酶基因的表達載體的出發載體為pMA5、pBE2、pSBPTQ、pC194或pM2Veg。
8.根據權利要求7所述的工程菌，其特征在于所述表達載體為pMA5-ECE1。
9.根據權利要求6所述的工程菌，其特征在于所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌DB1342、WB700、DB104或WB600。
10.一種(+)-反式菊酸的生產方法，是發酵權利要求6所述的菊酸乙酯酯酶的專用表達工程菌，獲得菊酸乙酯酯酶，再加入底物(+)-反式菊酸乙酯，得到(+)-反式菊酸；所述發酵用培養基為普通枯草芽孢桿菌培養基或2×MSR培養基，普通枯草芽孢桿菌培養基配方為每1000mL水中含2-3％酵母浸出物，1-2％蛋白胨，0.1-0.2％K2HPO4.3H2O，0.1％KH2PO4和1％NaCl，其余為水；2×MSR培養基配方為每1000mL水中含5％酵母浸出物，3％蛋白胨，0.6％K2HPO4，1.0％葡萄糖，其余為水；發酵溫度為27-42℃，發酵時間為24-148小時。
全文摘要
本發明公開了一種菊酸乙酯酯酶及其編碼基因與其表達專用工程菌和該酶的應用。該酶是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有菊酸乙酯酯酶活性的蛋白質。本發明在原有的環形節桿菌的菊酸乙酯酯酶基因序列的基礎上進行改造，改造后的基因可在枯草桿菌中高水平表達菊酸乙酯酯酶，并構建了菊酸乙酯酯酶的枯草桿菌表達工程菌。實驗證明，分泌表達的菊酸乙酯酯酶可轉一性的作用于(+)－反式菊酸乙酯，并生成(+)－反式菊酸。本發明具有較高的實用性和可推廣性，在(+)－反式菊酸的工業化生產中具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12P7/40GK1766097SQ20051009799
公開日2006年5月3日 申請日期2005年9月2日 優先權日2005年9月2日
發明者夏國興, 邱并生, 胡學博 申請人:夏瀚生物工程(上海)有限公司