專利名稱：尿苷5＇－二磷酸－n－乙酰半乳糖胺的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為低聚糖合成的重要底物尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺(UDP-GalNAc)的制備方法。
背景技術(shù)：
用酶合成低聚糖的方法包括利用低聚糖水解酶的逆反應(yīng)的方法和利用轉(zhuǎn)糖基酶的方法這兩種。使用轉(zhuǎn)糖基酶的合成法，從合成收率和用于合成具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的低聚糖等方面考慮，比利用水解酶的逆反應(yīng)的方法更好，此外，近年隨著重組DNA技術(shù)的進步，各種轉(zhuǎn)糖基酶的大規(guī)模生產(chǎn)也隨該技術(shù)的發(fā)展而發(fā)展。
但是，在轉(zhuǎn)糖基酶的合成法中所用的糖供體糖核苷酸除了一部分之外，其它的價格仍較高，目前的供應(yīng)量僅在試劑水平。例如，作為UDP-GalNAc的制備方法，報道了使用半乳糖胺作為起始材料，將酶法和化學乙酰化組合合成UDP-GalNAc的方法。
但是，由于存在如下問題(A)只是實驗室的小規(guī)模反應(yīng)、(B)酶的制備難、(C)半乳糖胺磷酸化時必需補充ATP再生體系，整個反應(yīng)工序的收率也低、(D)在反應(yīng)液中殘留UDP-半乳糖胺的情況下，目的物UDP-GalNAc與它的分離存在問題，因此未必是實用的方法(Methods Enzymol.，28，271-277，(1972)、J.Org.Chem.，57，152-157.(1992))。
此外，已報道了用尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺4-表異構(gòu)酶(UDP-GlcNAc 4-表異構(gòu)酶)由尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)合成UDP-GalNAc的方法(WO2002/050267)，由于存在如下問題(i)UDP-GlcNAc 4-表異構(gòu)酶在動物組織或菌體中的存在量極少、(ii)盡管可以通過重組DNA法制備UDP-GlcNAc 4-表異構(gòu)酶，但是該酶反應(yīng)是平衡反應(yīng)因此轉(zhuǎn)化率低，并且作為底物的UDP-GlcNAc未完全消耗，大量留在反應(yīng)液中，因此UDP-GalNAc和UDP-GlcNAc的分離非常困難，因此該方法也不是實用的方法。
專利文獻1WO2002/05026非專利文獻1Methods Enzymol.，28，271-277，(1972)非專利文獻2J.Org.Chem.，57，152-157.(1992)非專利文獻3

J.Biol.Chem.271，23653-23656，(1996)非專利文獻4J.Biol.Chem.234，1822-1827(1959)非專利文獻5J.Biol.Chem.273，27055-27057(1998)非專利文獻6J.Biol.Chem.271，13147-13154(1996)發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的是提供一種使用價廉的底物，有效地酶促制備UDP-GalNAc的實用的方法。
本發(fā)明者們對UDP-GalNAc的生物合成路徑進行了詳細探討，發(fā)現(xiàn)結(jié)果如下，從而完成了本發(fā)明。
首先，已報道病原性金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcus aureus)來源于人、豬肝臟的各種尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶(UDP-GlcNAc焦磷酸化酶)，除了具有催化下述(A)固有的轉(zhuǎn)化反應(yīng)的活性之外，還具有催化下述(B)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)的活性(J.Biol.Chem.234，1822-1827(1959)、J.Biol.Chem.273，27055-27057(1998)、J.Biol.Chem.271，13147-13154(1996))，盡管除了Staphylococcus aureus之外，還沒有無病原性的來源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的這樣的報告，然而試驗結(jié)果證實除了具有下述(A)的活性之外還具有下述(B)的活性。而且，例如如果使用來源于大腸桿菌的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶，由N-乙酰半乳糖胺1-磷酸(GalNAc1-P)和尿苷5′-三磷酸(UTP)合成UDP-GalNAc的話，可以解決UDP-GlcNAc或UDP-半乳糖胺等按照現(xiàn)有方法與其它糖核苷酸分離的問題。
(A)UDP-GlcNAc+焦磷酸UTP+GlcNAc1-P(B)UDP-GalNAc+焦磷酸UTP+GalNAc1-P其次，GalNAc1-P昂貴，化學上也不容易制備，在探討是否能夠?qū)-乙酰半乳糖胺(GalNAc)酶促磷酸化的過程中，報道了在人或豬的肝臟或腎臟等組織中存在使GalNAc磷酸化的活性(J.Biol.Chem.271，39.23653-23656，(1996))，通過該酶可以由GalNAc酶促制備GalNAc1-P。
然而，在采用大腸桿菌等的微生物作為宿主的體系內(nèi)難以生產(chǎn)來源于動物的N-乙酰半乳糖胺激酶，因此不可能實用地提供相應(yīng)的酶，然而將編碼來源于動物的N-乙酰半乳糖胺激酶的GALK 2基因與編碼來源于其它微生物的蛋白質(zhì)(例如，大腸桿菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶)的基因3′末端下游相連，產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)，這樣可以在大腸桿菌內(nèi)以活性狀態(tài)制備來源于動物的N-乙酰半乳糖胺激酶。
而且，還發(fā)現(xiàn)使用這種來源于動物的N-乙酰半乳糖胺激酶和來源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶、或者它們的融合蛋白質(zhì)可以由GalNAc和UTP合成UDP-GalNAc，另外通過酵母菌體進行腺苷5′-三磷酸(ATP)生產(chǎn)和尿苷5′-一磷酸(UMP)的磷酸化的同時使N-乙酰半乳糖胺激酶和大腸桿菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶起作用，可以由價廉的UMP和GalNAc合成UDP-GalNAc，由此完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及UDP-GalNAc的制備方法，它是由UTP和GalNAc1-P酶促制備UDP-GalNAc的方法，其特征在于所述的酶使用來源于微生物(但是，病原性微生物除外)的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶。
此外，本發(fā)明涉及UDP-GalNAc的制備方法，其特征在于所述UDP-GlcNAc焦磷酸化酶是用來源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶基因(glmU)經(jīng)重組DNA法制得的。
另外，本發(fā)明涉及UDP-GalNAc的制備方法，其特征在于所述GalNAc1-P是用N-乙酰半乳糖胺激酶，由GalNAc和磷酸供體在反應(yīng)體系內(nèi)制得的。
在本發(fā)明中，所述N-乙酰半乳糖胺激酶可以是使用來源于動物的N-乙酰半乳糖胺激酶基因(GALK 2)經(jīng)重組DNA法制得的，可以是采用重組DNA法以與來源于微生物的蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的形式制得的，或者可以使用以與來源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的融合蛋白質(zhì)的形式制得的。
此外，在本發(fā)明中，所述磷酸供體可以是腺苷5′-三磷酸(ATP)，所述腺苷5′-三磷酸(ATP)也可以經(jīng)酵母菌體產(chǎn)生。
此外，在本發(fā)明的UDP-GalNAc的制備方法中，取代使用UTP，可以組合使用采用微生物菌體或酶的UTP生成/再生體系，取代使用UTP，也可以組合使用UMP和用酵母菌體由UMP產(chǎn)生UTP的體系。
另外，在本發(fā)明中，所述來源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶基因(glmU)可以是來源于大腸桿菌的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶基因。此外，在由所述UDP-GlcNAc焦磷酸化酶合成UDP-GalNAc時，也可以向反應(yīng)體系內(nèi)添加將生成的焦磷酸分解的酶。
此外，在本發(fā)明中，所述酵母菌體可以使用來源于選自酵母屬、接合酵母屬、假絲酵母屬、球擬酵母屬、漢森酵母屬、德巴利酵母屬中的一種或多種酵母的菌體，作為所述酵母菌體的一個實例，可以使用干燥酵母菌體。在使用所述酵母菌體的反應(yīng)中，添加無機磷酸和所需的能量源也是有益的。
另外，在本發(fā)明中，可以添加氟化鈉以防止由所述N-乙酰半乳糖胺激酶制備的GalNAc1-P的分解。
發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)來源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶具有由GalNAc1-P和UTP產(chǎn)生UDP-GalNAc的活性，因此采用該酶和來源于動物的N-乙酰半乳糖胺激酶，進行GalNAc的磷酸化并交替地添加UDP，首次可以有效地制備UDP-GalNAc。
此外，由于可以將N-乙酰半乳糖胺激酶和UDP-GlcNAc焦磷酸化酶作為融合蛋白質(zhì)生產(chǎn)，首次可以在大腸桿菌內(nèi)制備來源于動物的N-乙酰半乳糖胺激酶，并且可以一次生產(chǎn)兩種酶，因此酶制備變得容易。
另外，通過酵母菌體生產(chǎn)ATP和UMP的磷酸化的同時使N-乙酰半乳糖胺激酶和來源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶作用，可以有效地由價廉的UMP和GalNAc合成UDP-GalNAc。
再次，本發(fā)明的方法，由于幾乎不產(chǎn)生UDP-GalNAc之外的糖核苷酸，因此可以極其簡單地進行從反應(yīng)液中分離精制目標UDP-GalNAc。
本發(fā)明的最佳實施方式本發(fā)明涉及UDP-GalNAc的制備方法，它是由UTP和GalNAcl-P酶促制備UDP-GalNAc的方法，特征在于酶使用來源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶。
作為向反應(yīng)體系內(nèi)添加的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶，可以使用沒有病原性的來源于微生物的酶。通過將各自酶的基因克隆，可以在微生物菌體內(nèi)大量表達這些酶，也可以采用所謂的重組DNA法制備。作為來源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶，列舉有來源于屬于埃希氏桿菌(Escherichia)屬(Journal of Bacteriology，175，6150(1993))、酵母(Saccharomyces)屬(Agricultural Biological Chemistry，40，2275(1976))或鏈孢霉(Neurospoa)屬(Can.J.Microbiology，25，1381(1979))的微生物的酶，特別優(yōu)選來源于大腸桿菌的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶。
這種UDP-GlcNAc焦磷酸化酶，只要具有相應(yīng)活性，任何形態(tài)都可以。具體地說，可以列舉有微生物菌體、該菌體的處理物或由該處理物獲得的酶制劑等。
作為微生物菌體處理物，可以將上述微生物菌體經(jīng)機械破碎(利用渦流混合機、法式壓力機、均化器、乳缽等)、凍融、自溶、干燥(利用冷凍干燥、風干等)、酶處理(利用溶菌酶等)、超聲波處理、化學處理(利用酸、堿處理等)等普通處理方法而獲得的菌體破壞物或者菌體細胞壁或細胞膜的變性物。
作為酶制劑，可以列舉由對來源于上述菌體處理物的具有相應(yīng)酶活性的部分施加常用的酶精制手段(鹽析處理、等電點沉淀處理、有機溶劑沉淀處理、透析處理、各種層析法處理等)獲得粗酶或精制酶。
對由微生物菌體制備UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的方法進行具體說明，對收集到的菌體進行超聲波處理使菌體破碎，然后使菌體破壞液離心，獲得上清液，對該上清液施加離子交換層析法、凝膠層析法等各種層析法處理，將UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性部分濃縮、脫鹽之后就可以獲得作為目標酶制劑。
反應(yīng)所用的UTP和GalNAc1-P，也可以在反應(yīng)體系內(nèi)分別制備。例如，可以使用N-乙酰半乳糖胺激酶，在GalNAc1-P的反應(yīng)體系內(nèi)由GalNAc和磷酸供體進行制備。
反應(yīng)所用的N-乙酰半乳糖胺激酶，存在于人、豬、鼠等哺乳類腎臟或肝臟、胰臟、肺、心臟、大動脈、腦等的組織中，特別是在腎臟或肝臟內(nèi)含有大量的該酶，因此可以由這些組織制得。此外，向反應(yīng)體系中添加的N-乙酰半乳糖胺激酶，只要具有相應(yīng)活性，任何形態(tài)都可以。具體地說，可以列舉有豬肝臟處理物或由該處理物獲得的酶制劑等。
但是，從酶制備的簡便性等的角度，按照常規(guī)方法克隆N-乙酰半乳糖胺激酶基因，可以在微生物菌體內(nèi)大量表達，最優(yōu)選通過重組DNA法制備。采用微生物作為宿主，通過重組DNA法制備來源于動物的N-乙酰半乳糖胺激酶時，按照常規(guī)方法不能制得目標酶，即使能夠產(chǎn)生其量也極少，因此不適合實用。為此，與宿主相同的編碼來源于微生物的蛋白質(zhì)(例如，大腸桿菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶)的基因的下游相連，以生產(chǎn)融合蛋白質(zhì)，可以在大腸桿菌等的宿主內(nèi)以具有活性的狀態(tài)制備來源于動物的N-乙酰半乳糖胺激酶。
用于生產(chǎn)上述融合蛋白質(zhì)的基因的連接、質(zhì)粒的構(gòu)建、宿主的性狀轉(zhuǎn)變、酶的生產(chǎn)等，已經(jīng)是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，如后面實施例所示，可以按照常規(guī)方法進行。
作為反應(yīng)添加的N-乙酰半乳糖胺激酶，與UDP-GlcNAc焦磷酸化酶相同，只要具有相應(yīng)活性，任何形態(tài)都可以。具體地說，可以列舉有微生物菌體、該菌體的處理物或由該處理物獲得的酶制劑等。
此外，UTP在反應(yīng)體系內(nèi)的制備，可以組合使用采用微生物菌體或酶的UTP生成/再生體系來實施。具體地說，可以利用采用UMP和酵母菌體由UMP生產(chǎn)UTP的體系，首先對此進行說明(參見

圖1)。
作為使用的酵母菌體，只要可用于糖核苷酸的制備，沒有特別的限制。具體地說，可以列舉有來源于酵母(Saccharomyces)屬、接合酵母(Zygosaccharomyces)屬、假絲酵母(Candida)屬、球擬酵母(Torulopsis)屬、漢森酵母(Hansenula)屬、德巴利酵母(Debaryomyces)屬等的酵母的菌體。這種酵母菌體，可以是活酵母菌體、干燥酵母菌體中任意一種，從反應(yīng)收率、獲取的容易性等的角度優(yōu)選使用干燥酵母菌體。
此外，UTP在反應(yīng)體系內(nèi)的制備，并不限于使用上述UMP和酵母菌體由UMP生產(chǎn)UTP的體系，例如，可以利用采用微生物菌體由乳清酸生產(chǎn)UTP的體系(特開平5-276974號)、或者同時使用使用了酶的UTP生成體系和ATP再生體系(具體地說，可以利用使多磷酸激酶、腺苷酸激酶及多磷酸作用于腺苷酸(AMP)使ATP再生，同時尿苷酸激酶，及根據(jù)需要使核苷酸二磷酸激酶作用于UMP生成UTP的體系)等。
使用這種酶和底物制備UDP-GalNAc的條件，隨所用的酶和底物不同而略有不同。
(1)酶使用來源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶，由UTP和GalNAc1-P酶促制備UDP-GalNAc時，反應(yīng)所用的UTP和GalNAc1-P可以使用市售品，或者可以按照公知的方法(J.Am.Chem.Soc.，115，2260-2267(1993))制得。作為使用的濃度，沒有特別的限制。可以分別適當設(shè)定在約1～200mM，優(yōu)選約1～100mM的范圍內(nèi)。
UDP-GalNAc的合成反應(yīng)，例如在pH約6.0～9.0的磷酸緩沖液中添加UTP和GalNAc1-P，然后在該反應(yīng)液中添加共存上述UDP-GlcNAc焦磷酸化酶約0.1U/ml以上，優(yōu)選約0.5～20.0U/ml，在約5～30℃，優(yōu)選約5～25℃下，根據(jù)需要進行攪拌使反應(yīng)進行1～70小時左右。
此外，通過UDP-GlcNAc焦磷酸化酶合成UDP-GalNAc的反應(yīng)，是平衡反應(yīng)，為了提高UDP-GalNAc的合成收率，優(yōu)選向反應(yīng)體系內(nèi)添加0.1U/ml以上的酶分解生成的焦磷酸(例如，焦磷酸酶)。
(2)酶使用來源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶和來源于動物的N-乙酰半乳糖胺激酶、或者它們的融合酶，由UTP和GalNAc酶促制備UDP-GalNAc時，反應(yīng)所用的UTP和GalNAc可以使用市售品。使用濃度沒有特別的限制，各自可以適當設(shè)定在約1～200mM，優(yōu)選約1～100mM的范圍內(nèi)。
UDP-GalNAc的合成反應(yīng)，例如在pH約6.0～9.0的磷酸緩沖液中添加UTP和GalNAc，然后向該反應(yīng)液中分別添加共存上述兩種酶、或者融合酶約0.1U/ml以上，優(yōu)選約0.5～20.0U/ml，在約5～30℃，優(yōu)選約5～25℃下根據(jù)需要攪拌使反應(yīng)進行1～70小時左右。
另外，與上述(1)相同地，添加分解焦磷酸的酶(例如，焦磷酸酶)0.1U/ml以上，再者為了防止經(jīng)N-乙酰半乳糖胺激酶制得的GalNAc1-P分解，添加1mM以上的氟化鈉是理想的。
(3)酶使用來源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶和來源于動物的N-乙酰半乳糖胺激酶、或者它們的融合酶，組合使用用酵母菌體由UMP生成UTP的體系，由UMP和GalNAc制備UDP-GalNAc時，反應(yīng)所用的UMP和GalNAc可以使用市售品。作為使用濃度，沒有特別的限制，可以分別適當設(shè)定在約1～200mM，優(yōu)選約10～50mM的范圍內(nèi)。
UDP-GalNAc的合成反應(yīng)，例如在pH約6.0～9.0的磷酸緩沖液中添加UMP和GalNAc，然后向該反應(yīng)液中分別添加上述兩種酶、或者它們的融合酶約0.1U/ml以上，優(yōu)選約0.5～20.0U/ml，再添加共存酵母菌體1～10％(w/v)，在約5～30℃下根據(jù)需要攪拌使反應(yīng)進行1～70小時左右。
上述反應(yīng)中，優(yōu)選在反應(yīng)體系內(nèi)添加無機磷酸和能量源。無機磷酸可以直接使用磷酸鉀等，但是優(yōu)選以磷酸緩沖液的形態(tài)使用。作為能量源，可以使用葡萄糖、果糖等糖類，乙酸、檸檬酸等有機酸。各自的使用濃度，沒有特別的限制，但是可以適當設(shè)定在約10～1000mM，優(yōu)選約100～500mM的范圍內(nèi)。
而且，在上述反應(yīng)體系中，上述(1)和(2)的酶反應(yīng)不同，不必向反應(yīng)體系中加入防止焦磷酸分解的酶和用于防止GalNAc1-P分解的氟化鈉。
如此所得的UDP-GalNAc可以通過糖核苷酸常用的分離精制手段(離子交換層析法、吸著層析法、鹽析等)進行分離精制。
實施例下面，顯示實施例對本發(fā)明進行具體說明，然而本發(fā)明并不限于此是顯而易見的。而且，實施例中，采用HPLC法對反應(yīng)液中的UDP-GalNAc進行定量。即，分離時用YMC公司制造的ODS-AQ312柱，洗脫液采用0.5M磷酸一鉀溶液。DNA的制備、利用限制性酶進行的剪切、利用T4DNA連接酶進行的DNA連接、以及大腸桿菌的性狀轉(zhuǎn)變法都參照《分子克隆》(Maniatis等編，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork(1982))進行。限制性酶、ExTaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶從タカラバイオ(株)獲得。
實施例1(1)編碼來源于人腎臟的N-乙酰半乳糖胺激酶的GALK 2基因的克隆將來源于人腎臟的c DNA庫(可以從クロンテツク公司獲得)作為模板，按照常規(guī)方法合成下面所示的兩種引物DNA，通過PCR法使人腎臟GALK 2基因(提交到國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)，登錄號為NM_002044，(Submitted to NCBI、Accession No.NM_002044))擴增。
引物(A)5’-CGGGGATCCATGGCTACAGAGAGCCCTGCT-3’引物(B)5’-TACGTCGACTTAGGCCTCAAGCAAAACCAA-3’利用PCR法使GALK 2基因擴增時，使用タカラバイオ公司制造的DNA熱循環(huán)儀使反應(yīng)液100μl(50mM氯化鉀、10mM Tris鹽酸(pH8.3)、1.5mM氯化鎂、0.001％明膠、0.2mM dATP、0.2mM dGTP、0.2mM dCTP、0.2mM dTTP、模板DNA0.1ng、引物DNA(A)和(B)各自0.2μM、ExTaqDNA聚合酶2.5U)分別進行熱變性(94℃、1分鐘)、退火(59℃、1分)、延伸反應(yīng)(72℃、2分鐘)的步驟，反復(fù)30次。
基因擴增后，按照文獻(分子克隆，前述)的方法，通過瓊脂糖凝膠電泳使DNA分離，精制相當于1.4kb的DNA片段。用限制性酶BamH I及Sal I剪切該DNA，同樣用限制性酶BamH I及Sal I消化質(zhì)粒pMAL-c2x(從New England BioLabs公司獲得)再用T4DNA連接酶連接。使用連接反應(yīng)液使大腸桿菌K12株JM109菌(從タカラバイオ株式會社獲得)進行性狀轉(zhuǎn)變，從所得耐氨芐青霉素的性狀轉(zhuǎn)變體中分離出質(zhì)粒pMAL-hGLK2。pMAL-hGLK2是在麥芽糖結(jié)合蛋白基因的3′-末端下游的BamH I-Sal I剪切部位插入含有人腎臟GALK 2結(jié)構(gòu)基因的BamH I-Sal I DNA片段的質(zhì)粒。
(2)人腎臟GALK 2基因產(chǎn)物的制備將具有質(zhì)粒pMAL-hGLK2的大腸桿菌JM109菌接種在100ml含有100μg/ml的氨芐青霉素的培養(yǎng)基(2％蛋白胨、1％酵母浸膏、0.5％NaCl、0.1％葡萄糖)中，于37℃振蕩培養(yǎng)。當菌數(shù)達到4×108個/ml時，添加IPTG使培養(yǎng)液的最終濃度分別達到0、0.01、0.1或1.0mM，然后在25℃分別繼續(xù)振蕩培養(yǎng)20小時。培養(yǎng)結(jié)束后，離心分離(4℃、9000xg，10分鐘)回收菌體，使其懸浮于20ml緩沖液(50mM磷酸鉀(pH7.5))中。使用ブランソン公司制造的超聲波粉碎機(モデル450ソニフア一)于冰冷下進行超聲波處理(50W，2分鐘，3次)，在4℃、12000xg的條件下離心分離20分鐘，回收可溶性部分(上清液)。
將所得上清液部分作為酶樣品，測定該酶樣品中的N-乙酰半乳糖胺激酶活性。將其結(jié)果示于下表。
表1


另外，N-乙酰半乳糖胺激酶活性是按照下面所示方法測定由ATP和GalNAc磷酸化為GalNAc1-P的活性而算出的值。即，在100mM Tris鹽酸緩沖液(pH7.5)、10mM氯化鎂、5mMGalNAc、5mM ATP·3Na、5mM氟化鈉中添加N-乙酰半乳糖胺激酶酶樣品，于37℃反應(yīng)10分鐘。將反應(yīng)液煮沸5分鐘使反應(yīng)停止，用糖分析儀HPAEC-CD(偶聯(lián)有導(dǎo)電計檢測的高效陰離子交換色譜法)進行分析。分離時使用ダイオネクス公司制造的Carbopac PA1柱(4×250mm)，洗脫液采用(A)0.1M NaOH溶液和(B)0.1M NaOH，0.5M乙酸鈉溶液的濃度梯度(0-15分鐘B＝1％-50％、15-20分鐘B＝100％)。從HPAEC-CD分析結(jié)果可以算出反應(yīng)液中的GalNAc1-P生成量，將37℃時1分鐘內(nèi)生成1μmol的GalNAc1-P的活性計為1單位(U)。
(3)UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的制備由大腸桿菌(IFO3972＝NBRC3972)的染色體DNA，按照文獻中公知的方法(Biosci.Biotechnol.Biochem.，64(2)，386-392(2000))制得的大腸桿菌JM109[pTrc--glmU]，在含有100μg/ml氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基(Methods Enzymol.，153，3-11，(1987))10ml中于37℃下培養(yǎng)一晚。將其接種到含有100μg/ml氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基500ml中。37℃下培養(yǎng)2小時后，添加IPTG使得終濃度為0.1mM，37℃下連續(xù)培養(yǎng)一夜。培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心分離(4℃，9000xg，20分鐘)回收菌體。將回收的菌體懸浮于50mMTris鹽酸(pH7.5)中，使用ブランソン公司制造的超聲波粉碎機(モデル450ソニフア一)粉碎后(50W，2分鐘，3次)，在4℃、15000rpm的條件下離心分離20分鐘，回收可溶性部分(上清液)。
將由此獲得的上清液部分作為酶樣品，測定酶樣品中的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性。將其結(jié)果與對照菌(具有pTrc99A的大腸桿菌JM109菌)一起示于下表2。
表2


另外，UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性是按照Biosci.Biotechnol.Biochem.，64(2)，386-392(2000))中所示的方法，即測定由UDP-GlcNAc和焦磷酸分解為N-乙酰葡糖胺1-磷酸和UTP的活性而算出的值。即，在50mM Tris鹽酸緩沖液(pH7.5)、5mM氯化鎂、3mM焦磷酸鈉、1mM UDP-GlcNAc中添加UDP-GlcNAc焦磷酸化酶酶樣品，于37℃反應(yīng)5分鐘。此外，使用水替代焦磷酸鈉溶液進行同樣的反應(yīng)，依次作為對照。
將反應(yīng)液煮沸5分鐘使反應(yīng)停止，用HPLC進行分析。分離時使用YMC公司制造的ODS-AQ312柱，洗脫液采用0.5M磷酸鉀溶液。從HPLC分析結(jié)果可以算出反應(yīng)液中產(chǎn)生的UTP量，將37℃時1分鐘內(nèi)生成1μmol的UTP的活性計為1單位(U)。
(4)用大腸桿菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶酶合成UDP-GalNAc在含有50mMTris鹽酸緩沖液(pH7.5)、5mM氯化鎂、1mM 5′-UTP·3Na、1mM GalNAc1-P的溶液0.5ml中添加上述(3)制得的規(guī)定活性量的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶酶液(4.8U)，于37℃下進行反應(yīng)。在反應(yīng)過程中從反應(yīng)液中取出適量，煮沸5分鐘后離心分離，將其上清液進行HPLC分析。
反應(yīng)開始后進行反應(yīng)液的分析的結(jié)果證實，由1mM的UTP和1mM的GalNAc 1-磷酸合成0.33mM的UDP-GalNAc。另外通過向反應(yīng)液中添加無機焦磷酸酶(シグマ公司制造)使平衡向UDP-GalNAc合成側(cè)傾斜，也證實合成收率提高(提高60％左右)。
實施例2(1)用人N-乙酰半乳糖胺激酶和大腸桿菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶合成UDP-GalNAc在含有100mM Tris鹽酸緩沖液(pH7.5)、10mM氯化鎂、5mM 5′-UTP·3Na、5mM GalNAc、5mM 5′-ATP·3Na、5mM氟化鈉的0.2ml溶液中添加上述實施例1制得的規(guī)定活性量的N-乙酰半乳糖胺激酶酶液(0.094U)和UDP-GlcNAc焦磷酸化酶酶液(4.4U)和無機焦磷酸酶(シグマ公司制造、0.5U)，37℃下進行反應(yīng)。
在反應(yīng)過程中從反應(yīng)液中取出適量，煮沸5分鐘后進行離心分離，將該上清液進行HPLC分析。反應(yīng)開始4小時后進行反應(yīng)液的分析的結(jié)果證實，在有N-乙酰半乳糖胺激酶、UDP-GlcNAc焦磷酸化酶及無機焦磷酸酶的情況下，合成3.2mM的UDP-GalNAc。而且，在沒有N-乙酰半乳糖胺激酶，僅有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶和無機焦磷酸酶的反應(yīng)條件下不能生成UDP-GalNAc。
實施例3(1)使用干燥酵母和人N-乙酰半乳糖胺激酶和大腸桿菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶合成UDP-GalNAc在含有200mM葡萄糖、50mM GalNAc、50mM UMP、200mM磷酸鉀(pH8.0)、20mM氯化鎂、3％(w/v)干燥面包酵母(オリエンタル酵母工業(yè))的1ml溶液中，添加實施例1中制得的重組酶(N-乙酰半乳糖胺激酶；0.32U，UDP-GlcNAc焦磷酸化酶；10.4U)，于26℃下以300rpm的攪拌速度攪拌的同時進行反應(yīng)。而且，在反應(yīng)開始后的第16、24、40、48小時向反應(yīng)液中各自添加2M的葡萄糖溶液0.1ml。不同時間的反應(yīng)液進行分析的結(jié)果于圖2所示。反應(yīng)49小時時UDP-GalNAc的蓄積量達到32mM。
實施例4實施例2和3中顯示了使用二種酶的反應(yīng)例，然而這里顯示使用使二種酶以融合蛋白質(zhì)生產(chǎn)來進行UDP-GalNAc合成反應(yīng)的結(jié)果。
(1)大腸桿菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶和來源于人腎臟的N-乙酰半乳糖胺激酶的融合將大腸桿菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶基因表達用質(zhì)粒，pTrc-glmU作為模板，使下面所示的兩種引物DNA按照常法合成，利用PCR法使含有g(shù)lmU基因的DNA片段擴增。
引物(C)5’-GAGCGGATAACAATTTCAC-3’引物(D)5’-CCAGGATCCCTTTTTCTTTACCGGACGACG-3’利用PCR法使含有g(shù)lmU基因的DNA片段擴增時，使用タカラバィオ公司制造的DNA熱循環(huán)儀使反應(yīng)液100μl(50mM氯化鉀、10mM Tris鹽酸(pH8.3)、1.5mM氯化鎂、0.001％明膠、0.2mM dATP、0.2mM dGTP、0.2mM dCTP、0.2mM dTTP、模板DNA0.1ng、引物DNA(A)和(B)各自0.2μM、ExTaqDNA聚合酶2.5U)分別進行熱變性(94℃、1分鐘)、退火(64℃、1分鐘)、延伸反應(yīng)(72℃、2分鐘)的步驟，反復(fù)30次。
DNA片段擴增后，按照文獻(分子克隆，前述)的方法，通過瓊脂糖凝膠電泳使DNA分離，精制相當于1.4kb的DNA片段。用限制性酶EcoR I及BamH I剪切該DNA，同樣用限制性酶EcoR I及BamH I消化質(zhì)粒pTrc99A(從フアルマシア公司獲得)再用T4DNA連接酶連接。使用連接反應(yīng)液使大腸桿菌K12株JM109菌(從タカラバイオ株式會社獲得)進行性狀轉(zhuǎn)變，從所得耐氨芐青霉素的性狀轉(zhuǎn)變體中分離出質(zhì)粒pTrc-glmU 3。pTrc-glmU 3的glmU基因是，取代缺失的起始密碼子，插入BamH I識別部位的基因。
接下來，使pTrc-hGLK2經(jīng)限制性酶BamH I和Sal I消化，分離精制相當于1.4kb的DNA片段。同樣用限制性酶BamH I和Sal I對其消化的質(zhì)粒pTrc-glmU 3和T4DNA連接酶進行連接。使用連接反應(yīng)液使大腸桿菌JM109菌進行性狀轉(zhuǎn)變，從所得耐氨芐青霉素的性狀轉(zhuǎn)變體中分離質(zhì)粒pTrc-glmU·hGLK2。pTrc-glmU·hGLK2是在glmU基因的3′-末端下游構(gòu)架一致地連接hGLK2基因的質(zhì)粒。接下來使pTrc-glmU·hGLK2經(jīng)限制性酶Sac I和SalI消化，分離精制相當于1.4kb的DNA片段。同樣用限制性酶Sac I和Sal I使其消化的質(zhì)粒pTrc12-6和T4DNA連接酶連接。采用連接反應(yīng)液使大腸桿菌DH1株(ATCC 33849)進行性狀轉(zhuǎn)變，從得到的耐卡那霉素的性狀轉(zhuǎn)變體中分離質(zhì)粒p12-6-glmU·hGLK2。
另外，質(zhì)粒pTrc12-6是以質(zhì)粒載體πAG1(具有質(zhì)粒載體πAG1的大腸桿菌K-12株TNC111菌的保藏號FERMBP-6901號平成11年9月30日保藏)和pTrc99A DNA為基礎(chǔ)構(gòu)建，pTrc99A的β-內(nèi)酰胺酶基因完全缺失(第567-1816位缺失)，在該缺失部位插入來源于Tn903的耐卡那霉素的基因的質(zhì)粒(特開2001-103973)。
(2)大腸桿菌glmU基因產(chǎn)物和人腎臟GALK 2基因產(chǎn)物的融合蛋白質(zhì)的制備將具有質(zhì)粒p12-6-glmU·hGLK2的大腸桿菌DH1株接種于含有100μg/ml的卡那霉素的培養(yǎng)基(2％蛋白胨、1％酵母浸膏、0.5％NaCl、0.1％葡萄糖)50ml中，37℃下振蕩培養(yǎng)。菌數(shù)達到4×108個/ml時向培養(yǎng)液中添加IPTG使得最終濃度為0.1mM，再于25℃下連續(xù)振蕩培養(yǎng)20小時。培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心分離(4℃，9000xg，10分鐘)回收菌體，將其懸浮于20ml的緩沖液(50mM磷酸鉀(pH7.5))中。于冰冷下經(jīng)過超聲波處理將菌體破碎，再離心分離(4℃，12000xg，10分鐘)除去菌體殘渣。
將由此獲得的上清液部分作為酶樣品，按照實施例1中記載的方法測定酶樣品中的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性和N-乙酰半乳糖胺激酶活性。其結(jié)果示于下表3。
表3


(3)使用融合蛋白質(zhì)的UDP-GalNAc的合成使用上述融合酶樣品進行UDP-GalNAc合成。即，在含有200mM葡萄糖、50mM GalNAc、28mM UMP、200mM磷酸鉀(pH8.0)、20mM氯化鎂、3％(w/v)干燥面包酵母(オリエンタル酵母工業(yè))的2.5ml溶液中添加上述重組融合酶液(N-乙酰半乳糖胺激酶；1.75U、UDP-GlcNAc焦磷酸化酶；88.9U)，于27℃、100rpm下攪拌的同時進行反應(yīng)。反應(yīng)開始后的第14、24、40小時向反應(yīng)液中添加葡萄糖0.09g。此外，在反應(yīng)開始24小時后向反應(yīng)液中添加0.5M的UMP溶液110μl。
將分析不同時間的反應(yīng)液的結(jié)果示于圖3。使用融合蛋白質(zhì)與分別將制得的兩種酶混合使用大致相同地合成UDP-GalNAc，反應(yīng)40小時時UDP-GalNAc達到30mM。
(4)大腸桿菌glmU基因產(chǎn)物和人腎臟GALK 2基因產(chǎn)物的融合蛋白質(zhì)的制備(放大試驗)將具有質(zhì)粒P12-6-glmU·hGLK2的大腸桿菌DH1株接種到含有100μg/ml的卡那霉素的培養(yǎng)基(2％蛋白胨、1％酵母浸膏、0.5％NaCl、0.1％葡萄糖)3mL中，37℃下振蕩培養(yǎng)一夜。將該培養(yǎng)液全部接種到125mL的相同培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)8-11小時。將該培養(yǎng)液全部接種到5L相同培養(yǎng)基中，在37℃、通氣量1.0vvm、攪拌翼轉(zhuǎn)數(shù)300rpm的條件下培養(yǎng)。菌數(shù)達到4×108個/ml時添加IPTG使得在培養(yǎng)液中的最終濃度為0.1mM，使培養(yǎng)溫度降低至28℃繼續(xù)培養(yǎng)14小時。培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心分離(9000xg，10分鐘)回收菌體，然后將其懸浮于500ml的緩沖液(50mM磷酸鉀(pH7.5))中。于冰冷下經(jīng)超聲波處理將菌體破碎，同時經(jīng)離心分離(12000xg，10分鐘)除去菌體殘渣。
將由此獲得的上清液部分作為酶樣品，以實施例1中記載的方法測定UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性。該值是9.50U/mg蛋白質(zhì)。
(5)UDP-GalNAc合成反應(yīng)的放大試驗使用融合酶樣品進行UDP-GalNAc合成反應(yīng)的放大試驗，在發(fā)酵缸中進行。即，添加200mM葡萄糖、50mM N-乙酰半乳糖胺、28mM UMP、200mM磷酸鉀(pH8.0)、20mM氯化鎂、3％(w/v)干燥面包酵母(オリエンタル酵母工業(yè))、和上述重組融合酶液(UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性為525000U)加注至1500ml，在27℃、通氣量0.1vvm、攪拌翼轉(zhuǎn)數(shù)150rpm的條件下進行反應(yīng)。從反應(yīng)開始的第14，24，38小時向反應(yīng)液中添加葡萄糖54g。此外，在反應(yīng)開始24小時后向反應(yīng)液中添加0.5M的UMP溶液66mL。
將分析不同時間的反應(yīng)液的結(jié)果示于圖4。即使在發(fā)酵缸中進行反應(yīng)合成UDP-GalNAc，反應(yīng)40小時時UDP-GalNAc達到35mM。
保藏證明國際表格[關(guān)于國際承認的用于專利目的的微生物保藏的布達佩斯條約]本頁底部簽章的國際保藏機構(gòu)根據(jù)7.1條頒發(fā)原始保藏的受理保藏者姓名(名稱)雅瑪山醬油株式會社社長濱口道雄地址千葉縣銚子市新生町2丁目10番地1號

附圖簡述圖1圖1是顯示由GalNAc和UTP合成UDP-GalNAc的體系的圖。
圖2圖2是顯示來源于人腎臟的N-乙酰半乳糖胺激酶和大腸桿菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶共存時UDP-GalNAc的生成量隨時間變化的圖。
圖3圖3是顯示使用來源于人腎臟的N-乙酰半乳糖胺激酶和大腸桿菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的融合蛋白質(zhì)時UDP-GalNAc的生成量隨時間變化的圖。
圖4圖4是顯示在發(fā)酵缸中的合成反應(yīng)的UDP-GalNAc的生成量隨時間變化的圖。
序列表<110>YAMASA CORPORATION<120>尿苷5’-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法<130>5043-001PCT<150>JP P2004-306783<151>2004-10-21<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>30<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>擴增GALK2基因用的引物<400>1cggggatcca tggctacaga gagccctgct 30<210>2<211>30<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>擴增GALK2基因用的引物<400>2tacgtcgact taggcctcaa gcaaaaccaa 30<210>3<211>19<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>擴增glmU基因用的引物
<400>3gagcggataa caatttcac 19<210>4<211>30<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>擴增glmU基因用的引物<400>4ccaggatccc tttttcttta ccggacgacg 30
權(quán)利要求
1.一種尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺由尿苷5′-三磷酸和N-乙酰半乳糖胺1-磷酸酶促制備，特征在于，酶使用來源于除病原性微生物之外的微生物的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶。
2.如權(quán)利要求1所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，所述尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶是用來源于微生物的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因經(jīng)重組DNA法制得的酶。
3.如權(quán)利要求2所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，所述來源于微生物的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因是來源于大腸桿菌的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因。
4.如權(quán)利要求1所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，通過所述尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶合成尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺時，向反應(yīng)體系中添加將生成的焦磷酸分解的酶。
5.如權(quán)利要求1所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，所述N-乙酰半乳糖胺1-磷酸是使用N-乙酰半乳糖胺激酶，由N-乙酰半乳糖胺和磷酸供體在反應(yīng)體系內(nèi)制得的。
6.如權(quán)利要求5所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，所述磷酸供體是腺苷5′-三磷酸。
7.如權(quán)利要求6所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，所述腺苷5′-三磷酸是由酵母菌體產(chǎn)生的。
8.如權(quán)利要求5所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，N-乙酰半乳糖胺激酶是使用來源于動物的N-乙酰半乳糖胺激酶基因經(jīng)重組DNA法制得的。
9.如權(quán)利要求5所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，所述N-乙酰半乳糖胺激酶是采用重組DNA法，以與來源于微生物的蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的形式制得的。
10.如權(quán)利要求9所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，通過將來源于動物的N-乙酰半乳糖胺激酶基因與其它編碼來源于微生物的蛋白質(zhì)的基因的3′末端下游連接來校正所述融合蛋白質(zhì)。
11.如權(quán)利要求5所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，所述N-乙酰半乳糖胺激酶使用以與來源于微生物的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺焦磷酸化酶的融合蛋白質(zhì)的形式制得的。
12.如權(quán)利要求5所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，加入氟化鈉以防由所述N-乙酰半乳糖胺激酶制得的N-乙酰半乳糖胺1-磷酸的分解。
13.如權(quán)利要求1所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，代替使用所述尿苷5′-三磷酸的一部分或全部，組合使用采用微生物菌體或酶的尿苷5′-三磷酸生成/再生體系。
14.如權(quán)利要求1所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，代替使用所述尿苷5′-三磷酸的一部分或全部，組合使用尿苷5′-一磷酸和采用酵母菌體由尿苷5′-一磷酸產(chǎn)生的尿苷5′-三磷酸的體系。
15.如權(quán)利要求14所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，所述酵母菌體使用來源于選自酵母屬、接合酵母屬、假絲酵母屬、球擬酵母屬、漢森酵母屬、德巴利酵母屬中的一種或多種的酵母的菌體。
16.如權(quán)利要求14所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，所述酵母菌體使用干燥酵母菌體。
17.如權(quán)利要求14所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，在使用所述酵母菌體的反應(yīng)中，添加無機磷酸。
18.如權(quán)利要求14所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，在使用所述酵母菌體的反應(yīng)中，添加所需的能量源。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種使用價廉的底物，可以有效地制備尿苷5′－二磷酸－N－乙酰半乳糖胺(UDP－GalNAc)的實用的方法。涉及UDP－GalNAc的制備方法，其特征在于(1)在由UTP和GalNAc1－P酶促制備UDP－GalNAc的方法中，酶使用來源于微生物的UDP－GlcNAc焦磷酸化酶、(2)GalNAc1－P是使用N－乙酰半乳糖胺激酶，由N－乙酰半乳糖胺和磷酸供體在反應(yīng)體系內(nèi)制備的、(3)N－乙酰半乳糖胺激酶使用以與UDP－GlcNAc焦磷酸化酶的融合蛋白質(zhì)的形式制備的激酶、和/或(4)組合使用UMP和用酵母菌體由UMP生成UTP的體系代替使用UTP。
文檔編號C12N9/12GK101052724SQ20058003551
公開日2007年10月10日 申請日期2005年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月21日
發(fā)明者奧山潔, 野口利忠 申請人:雅瑪山醬油株式會社