專利名稱：一種改良水稻營養品質的方法
技術領域：
本發明屬于生物基因工程技術領域，具體涉及一種改良水稻營養品質的方法。
背景技術：
水稻作為全球最重要的糧食作物之一，產品的市場潛力十分廣闊，伴隨人民生活水平的提高，對于多種用途優質稻米與特殊米粉的需求與日俱增。水稻品質性狀的改良包括食味品質、食品加工品質和營養品質三個方面。食味品質主要與籽粒硬度、淀粉組分和蛋白質組分等相關；食品加工品質的改良以米粉的烘烤與膨化為主；營養品質的改良以提高水稻籽粒中的賴氨酸、蘇氨酸等限制性必需氨基酸的含量為主。稻米主要由胚乳和少量胚組成，而胚乳主要由淀粉粒和種子貯藏蛋白組成。種子貯藏蛋白是決定稻米品質的主要因素，其富含含硫氨基酸而缺少賴氨酸等必需氨基酸。根據蛋白質在不同溶劑的溶解度與在離解劑中分子大小主要分為醇溶蛋白(Prolamin)和稻谷蛋白(Glutenin)兩類。另外，還有稻清蛋白(Albumin)及稻球蛋白(Globulin)等，但含量較少。
水稻谷蛋白不溶于水而溶于稀酸或稀堿，約占種子總蛋白的70％以上，分子量約60kD，常常通過二硫鍵形成多聚體而存在于液泡內(Yamga，H.等.1982 Plant Physiol.701094-1100；Argos，P.，1985EMBO J 41111-1117)。其富含含硫氨基酸。該蛋白由多基因家族編碼(Masumura，T.et.al.1989 PlantMol.Biol.12723-725；Takaiwa，F.等1991 Plant Mol.Biol.1649-58)。而水稻醇溶蛋白則占種子總蛋白的16％左右，至少包括三類分子10kD、13kD和16kD，其中13kD是主要成分(Hibino，T.等.1989Agric.Biol.Chem.，53513-518)。該蛋白也是由多基因家族編碼(Kim，S.Y.and Wu，R.1990 Nucleic Acids Res.，5186845-6852；Masumura，T.等.1990 Mol.Gen.Genet.，2271-7)。
大豆種子貯藏蛋白中以球蛋白為主，約占種子蛋白總量的70％，是大豆種子貯藏蛋白的主要成分，它決定著大豆蛋白質的功能性。其賴氨酸的含量較高。大豆球蛋白含量高，具有良好的保水性、乳化性、粘結性、凝膠形成性、粘彈性、薄膜形成性、吸油性、熱穩定性、聚合和解離作用等功能特性。大豆球蛋白中二硫鍵多，凝膠形成速度快(Kitamura，1993 Kitamura K.Trends in Food Science&Technology，4426-430)，硬度大。其凝膠形成的溫度為90℃，因此大豆球蛋白具有很強的熱穩定性(Moreira MA，et.Al.，1979，J Biol Chem，2549921～9926)。隨二硫鍵的增多，發泡性增高(劉珊珊等，2002，大豆科學，2138～143)。編碼大豆球蛋白的基因(pgy)已被克隆(潘照明等2003，生物工程雜志，增刊，90-91)。
近年來隨著農業結構調整及我國加入WTO，對水稻品質的研究越來越受到重視。目前，常規的雜交育種方法仍是最為有效的獲得新品種的方法。近代發展起來的其它育種方法如遠緣雜交育種、輻射育種、單倍體育種等等在水稻的品質與品種改良中起了一定的推動作用。但這些方法由于自身的局限性，因而作用范圍十分有限。
利用遠緣雜交方法可以開發和利用來自水稻近緣野生種屬中的優良野生基因，通過染色體的交換，削減和代換，從而大大豐富水稻的種質與基因庫，但由于遠緣雜交的不親和性，種子無生命力不育，后代性狀分離大，時間長，極不易穩定等致命弱點，在通過染色體工程方法轉移獲得優良目的性狀與基因的同時，也會將逐多不良的野生基因與性狀帶給水稻，很難在生產上直接推廣利用。
隨著分子生物學的飛速發展以及基因克隆技術和重組DNA技術的建立肯與漸趨完善，利用植物基因工程方法和以多種分子標記方法為主體的分子標記輔助選擇育種為手段，直接在分子水平開展植物的品種改良已逐步成為現實和可能，稱為“分子育種”，它是以微觀水平的核酸、蛋白質、酶、乃至單個基因等的差異作為“性狀”來考察研究與改良。與“傳統育種”方法相比，“分子育種”來得更為直接，準確，可靠，展示在育種家面前的是植物種質或育種后代材科更深層次分子水平性狀的差異。
長期以來，優質稻育種進展較緩慢，沒有大的突破性進展，這主要原因在于一方面影響稻米品質的因素十分復雜，除品種遺傳特性外，還與環境因子有關，另外，育種技術沒有突破，大多采用常規雜交選育育種技術，因存在著純合慢、周期長(一個新的培育需8-10年)。稻米的主要成分是淀粉和蛋白質。由于影響淀粉的因素復雜，它不但受多基因控制，而且其合成受環境條件，尤其溫度的影響很大，因此對其組分及含量的改良難度較大，目前尚無良策。而蛋白質性狀則恰恰相反，是質量性狀，受溫度影響較小。因此通過改良蛋白質的特性可以達到改良稻米品質的目的。
由于大豆與水稻在在營養成分上具有互補性(前者富含蛋白質及賴氨酸等必需氨基酸，而缺乏含硫氨基酸；而后者卻與之相反)，因此把大豆種子蛋白基因導入水稻中將可以大幅度提高水稻種子的蛋白質含量并改善水稻中氨基酸的組成，對于改良水稻營養品質和提高蛋白利用率都具有重要意義。

發明內容
技術問題本發明的目的是針對大豆種子貯藏蛋白(pgy)基因還沒有在植物轉基因育種工程技術中得到應用的現狀，提供一種大豆種子貯藏蛋白基因重組載體及轉基因植物育種方法，將pgy基因構建在植物表達的轉化質粒，轉化水稻，獲得轉基因植株。其基因重組載體作為商業用途的品種、品系或作為基因資源在生產上直接使用或進行農業生物育種和轉基因植物以提高作物營養品質、加工性能和改善農作物其它生產性狀。
技術方案本發明的目的是提供一種利用基因工程手段改良水稻營養品質的方法。
為實現上述目的，本發明采用以下技術方案一種改良水稻營養品質的方法將大豆種子貯藏蛋白的編碼基因pgy導入栽培水稻中。
與所述pgy基因一同導入栽培水稻中的還有編碼抗潮霉素的hptII基因或抗除草劑草丁膦(又稱為膦化麥黃酮，商品名，Basta*，主要成分為PPT)。PPT是一種非選擇性滅生除草劑，為谷氨酰胺類似物，它可有效阻斷與抑制植物谷氨酰氨合成酶(GS)的作用，從而造成NH4+的大量積累，使植物細胞氨中毒死亡。Balaphos是含PPT的三肽(2個丙氨酸殘基和1個PPT殘基)，它的作用與PPT類似，但更為有效，用量可大大降低。從潮濕鏈霉菌分離出來的bar基因所編碼的PPT乙酰轉移酶(PAT)，可以乙酰輔酶A為輔助因子，使PPT和Bialaphos乙酰化而失去抑制CS活性的作用。本發明以bar基因為選擇基因，將其導入水稻可使水稻具有PPT抗性而免受傷害。
上述的bar基因可以以包括其內含子的玉米Ubil啟動子來驅動bar基因的表達，也可以以包括其內含子的水稻Actin啟動子來驅動bar基因的表達。
本發明以hpt(hygromycin B phosphotransferase，hpt，潮霉素磷酸轉移酶)基因為選擇基因，將其導入水稻可使水稻具有潮霉素抗性而免受傷害。hpt是一種廣泛使用的抗生素標記基因，它可使潮霉素(hygromycin B，hyg)a位的磷酸轉移至第4位羥基上而失活，從而提供對潮霉素的抗性。以hpt為選擇標記基因在食品安全上比nptII更具優越性，因為它僅作為獸用藥而不應用于人類的臨床治療，所以不必擔心由于DNA重組使人類獲得對潮霉素的抗性。另外，與其它作物不同，水稻轉化實驗中應用最多的選擇標記基因是hpt基因，經大量實驗室操作證明，潮霉素作為水稻轉化的選擇試劑，比卡那霉素或除草劑有更高的篩選效率，這對我國這樣一個水稻食用及消費的大國意義重大。
所述導入基因pgy的外植體為栽培水稻的幼胚、幼穗、花藥、胚芽鞘或胚性愈傷組織。
在導入基因pgy時可以編碼葡萄糖苷酸酶的GUS基因為報告基因，也可以不用。
被導入的基因pgy優選取自栽培優質大豆品種“中黃14”。
導入基因pgy的栽培水稻可以為粳稻(如粳稻9804、中作93等)、秈稻(如IR24、IR64等)、或早秈稻(如早秈213、竹青、粵香占、湘早19、湘早24等)。
pgy基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示本發明的優點是可以在較短時間內有效地選育出品質優良的水稻新種質，顯著優越于常規雜交育種改良品質技術，使稻米尤其早秈稻品質改良研究有新突破。
植物基因工程技術與方法的發展為水稻營養品質性狀的改良提供了其它方法所無法比擬的全新途徑，通過基因工程方法將來自優質大豆品種的種子貯藏蛋白基因pgy導入水稻優良品種，在不影響水稻產量和抗病性的前體下，可使水稻品種性狀大大改善，具有巨大的經濟效益和社會效益。
用本發明的方法將大豆種子貯藏蛋白基因pgy導入并整合到水稻基因組，改良水稻的營養品質，目標單一，無不利基因的連鎖問題，無種屬的限制，已經獲得的轉基因植株蛋白質含量和質量都明顯提高，米粉的加工性狀和質量得到了較大改善。用于導入的目的基因可來自任何生物體，同時可利用當前農業生產中推廣的優良品種為受體，轉基因植物能夠直接在生產上利用。
下面結合附圖對本發明做進一步說明


圖1、為RT-PCR擴增的大豆種子貯藏蛋白基因pgy。
圖2、顯示基因槍法轉化水稻幼胚的篩選與抗性愈傷組織的分化。
圖3、顯示自水稻抗性愈傷分化獲得的轉基因水稻植株。
圖4、為農桿菌介導法轉化水稻愈傷組織后的結果顯示抗性愈傷組織的篩選與分化。
圖5、為轉基因植株在田間生長情況。
圖6、為轉基因植株pgy基因PCR鑒定結果。
具體實施例方式
在下面實施例中所要用到的材料為1、品種粳稻9804、中作93、早秈213、竹青、粵香占、湘早19、湘早24、IR24或IR64。
2、外植體花藥(單核靠邊期)；幼胚(開花后12～15天)；胚性愈傷組織；胚芽鞘。
3、質粒pSP72(Promega Co.)；pBluescript(Stragene Co.)；pAHC25；pBARGUS；pCAMBIA1300。
4.大腸桿菌菌株DH5α；JM109(Promega)。
5、試劑酶類(國產華美公司；進口Promega Co.，BM Co.，Biolabs Co.)；地高辛標記與檢測試劑盒(BM Co.)；地高辛化學發光檢測試劑盒(BM Co.)。
6、基因槍JQ700火藥基因槍；高壓放電基因槍；PDS-1000/He(BioRad).
7、農桿菌菌株EHA105、LBA4404培養基A.花藥接種培養基N6基本培養基，加2，4-D 2mg/L，蔗糖308/L，瓊脂粉7g/L，pH5.8。
B.幼胚接種培養基MS本培養基，加2，4-D 2mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂粉7g/L，pH5.8。
C.成熟胚與胚芽鞘接種培養基MS基本培養基，加2，4-D 2mg/L，蔗糖30g/L，0.3％植物凝膠(Sigma公司)，pH5.8D.篩選繼代培養基據不同接種外植體和過程，在上述培養基中添加100～200mg/L噻孢霉素、Basta 2～25mg/L(或Bialaphos 0.5～8mg/L或潮霉素25～50mg/L)。
E.分化篩選培養基MS基本培養基，添加BA 0.5mg/L，KT 1mg/L，Zeatin 0.1～0.4mg/L，噻孢霉素100～200mg/L，Basta 0.5mg/L(或潮霉素25～50mg/L)，蔗糖20g/l，植物凝膠0.3％(Sigma公司)，pH5.8.
F.壯苗培養基1/2MS培養基，蔗糖20g/l，瓊脂粉7g/L，pH5.8。
GUS基因表達的檢測
標記基因GUS(編碼葡萄糖苷酸酶)用作報告基因，通過其瞬時表達結果推測轉化體系的效率。
起作用底物為X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-葡萄糖苷酸)。GUS基因檢測染色溶液組成成分為0.1N磷酸鉀緩沖液(pH7.0)，10mMEDTA-Na，5mMK3[Fe(CN)6]，5mM K4[Fe(CN)6].3H2O，0.1％Triton X-100，0.1％(w/v)X-Gluc，過濾滅菌，-20℃保存。將轉化后3-7天的材料進行GUS染色以檢測瞬時表達效率，或將轉基因植株葉片進行GUS染色以檢測其是否穩定表達。染色方法是，將材料置于GUS檢測染色液中，37℃黑暗下24小時，然后用70％乙醇或FAA固定液脫色。
實施例1、大豆種子貯藏蛋白基因pgy的克隆與質粒載體的構建1、克隆基因引物的設計根據大豆種子貯藏蛋白基因序列設計基因上游引物為5′CGACCATGGCCGCCAAGCTA3′(20bp)；下游引物為5′CGAGCTCCTAAGCCACAGCT3′(20bp)。
hpt基因上游引物為5’GGCTGGATCCTGACTCACCGCGAC3’(24bp)；下游引物為5’GCGGTACCTATTCCTTTGCCCTCG3’(24bp)。
2、RT-PCR反應與克隆以未成熟大豆種子的總RNA(Trizol試劑盒法)為模板，在3′端引物的參與下，通過M-MLV反轉錄酶合成cDNA第一條鏈。再以cDNA為模板，加入合成的上游和下游引物，在Taq DNA聚合酶作用下，進行PCR擴增反應，反應體系50ul10×buffer 5uL；2mM dNTP 5ul；25mM MgCl24ul；50ul上下游引物各1ul；模板DNA(1ug/ul)1ul；Taq DNA聚合酶2.5U；加ddH2O補至50ul。PCR反應條件為95℃5分鐘，95℃1分鐘，55℃30秒，72℃3分鐘，35個循環。PCR產物上樣電冰(0.8％瓊脂糖)，分別回收1.5kb的目的片段條帶，如圖1所示右邊泳道是1kb DNAmarker；左泳道是pgy基因。用Promga公司DNA純化試劑盒(A7280)純化并溶于50ul ddH2O。
純化的目的片段由于Taq酶特性而帶有3’dA，可直接插入pGEM-T載體，篩選白斑，獲得的克隆經酶切分析鑒定，并進行逐步分段測序，獲得序列正確無誤目的基因編碼區域的克隆，定名為pTGY。
3、表達載體的克隆與構建質粒提取，純化，酶切，瓊脂糖電泳，轉化，感受態細胞制備，基因連接與篩選等方法參見《分子克隆》(Maniatis等，1989)。
pgy基因從pTGY用NcoI酶切并補平后，再用SacI酶切分離回收，插入質粒pAHC25的SmaI和SacI位點，獲得質粒pUGY(8.5kb)。該質粒含有以編碼抗除草劑PPT與Bialaphos的bar基因為標志基因，以玉米Ubil啟動子與內含子來驅動編碼大豆種子貯藏蛋白的基因。
組成型表達啟動子玉米Ubil(Christensen，AH，et al，Plant Molec Biol.18675-689，1992)和內含子片段(2.0kb)、pgy-NOS片段(1.77kb)從質粒pUGY(8.5kb)分離，回收得到3.77kb片段，，插入到pCAMBIA1300獲得重組質粒pCY1300。
同時選擇CaMV35S啟動子與Adhl內含子(0.55kb)來驅動編碼潮霉素抗性的hpt基因，將有助于提高hpt基因在水稻中的表達，提高轉化選擇效果。
實施例2、基因槍轉化不同的外植體及植株再生1、微粒子彈的準備稱取60mg金粉(BioRad Co.，1um直徑)或鎢粉(M10)于1.5ml離心管中，加1ml 70％乙醇，用旋渦混合器或超聲波充分震蕩混合，10000rpm離心5分鐘，去上清，用無菌重蒸水重復洗3次，加入1ml 50％的無菌甘油，并用渦旋混勻。取50ul上述制備的金粉或鎢粉顆粒至一無菌離心管中，順序加入5ul質粒DNA(1ug/ul)、50ul 2.MCaCl2和50ul 0.1N亞精胺(現配)將混合物渦旋10分鐘，10000rpm離心5分鐘，去上清液。用70％乙醇和100％乙醇各洗沉淀1次，最后用48ul 100％乙醇重新懸浮顆粒并用超聲波粉碎儀處理5秒，分散顆粒。
2、轉化水稻花藥愈傷組織由于花粉母細胞為單細胞，轉化體存在嵌合性的可能性小，因而具有其它組織不可比擬的優越性。實驗選用粳稻9801和早秈213兩個品種，取單核靠邊期的花藥接種20天后，取愈傷組織進行轉化，質粒為pAHC25和pUGY。誘導培養基中附加Bialaphos 2mg/L；分化培養基中附加以Bialaphos 0.5～2mg/L。用pAHC25質粒轉化的花藥，7天后用X-Gluc檢測，發現瞬時表達極強。用質粒pUGY轉化后在28～30℃進行誘導篩選培養1個月，然后在26～28℃下培養，分化在25℃下進行，最終從粳稻9801和早秈213獲得了綠苗分別為10株和5株(如圖2、表1所示)。從研究結果可以看出，不同基因型之間的花藥培養再生頻率差異相當大，是以花藥作為轉化受體的弱點。
表1基因槍轉化水稻花藥的結果

3、轉化水稻幼胚用質粒pUGY轉化粳稻9801、中作37、竹青和早秈213，這4個品種的幼胚共5060個，經過篩選和分化，共獲得了160株轉基因植株，占總接種數的2.9％(如表2所示)。從表2中可以看出不同品種幼胚的愈傷形成率和綠苗分化率差異均很大，變化幅度分別為26.5％～76.4％和0.8％～5.2％。其中寧早秈213最差，接種1600個幼胚，僅形成424塊愈傷組織，分化出綠苗3棵；竹青次之，接種1200個幼胚，形成403塊愈傷組織，誘導率為33.6％，最終分化出6棵抗性綠苗。粳稻9801和中作37的愈傷形成率與抗性綠苗分化率均較高，分別為76.4％、74.2％與5.2％、3.6％。
表4基因槍轉化水稻幼胚的篩選與愈傷組織的分化

實施例3、農桿菌介導法轉化不同的外植體及植株再生1、水稻外植體的準備分別采用水稻成熟胚、花藥為外植體進行農桿菌介導的遺傳轉化。
水稻成熟胚愈傷組織的誘導按Hiei等(1994 Plant Mol.Biol.，35205～218)的方法。將去殼的水稻種子用1～1.3％次氯酸鈉溶液滅菌30min，或0.1％升汞溶液滅菌10～15min，無菌水沖洗4～5次；于MS固體培養基上26℃避光培養，誘導愈傷組織。約20天后，將從成熟胚盾片處長出的愈傷組織剝下，進行繼代培養1～3次，直至出現胚性愈傷組織，用于農桿菌轉化的受體。
水稻花藥用70％乙醇消毒1min，再用1～1.3％次氯酸鈉溶液滅菌20min，無菌剝離花藥(Anther)作為轉化受體。
2、農桿菌的活化挑取農桿菌單菌落，接種于2ml含50mg/L鏈霉素(或利福平)和50mg/L氨芐青霉素的YEB培養基中，28℃、200rpm培養過夜。吸取2ml培養物轉入50ml含50mg/L鏈霉素和50mg/L氨芐青霉素的YEB培養基中，28℃、200rpm繼續暗培養至OD600值約為1.0左右。然后將菌液轉至無菌離心管中，5000rpm離心2min；菌體沉淀用液體培養基重懸，使OD600值約為0.2～0.4左右，用于水稻愈傷組織的侵染。
3、農桿菌轉化水稻胚性愈傷組織選直徑0.2～0.4cm大小的胚性愈傷組織顆粒，于上述農桿菌懸液中侵染20～25min；將愈傷組織在無菌濾紙上吸干，轉移到鋪有兩層無菌濾紙的共培養基上，25℃暗培養2～3天；然后用無菌水漂洗并且用無菌濾紙吸干愈傷組織后，轉移到選擇培養基上，25℃暗培養，進行篩選，統計抗性愈傷組織的數量(表5)。
表5、農桿菌介導法轉化水稻產生抗性愈傷組織數

將新長出的抗性愈傷組織轉移到分化培養基上進行培養(28℃每天10～14h光照)，待長出完整小苗，轉入壯苗培養基(圖4)，并待長出新根后移栽到土壤中(圖5)。
農桿菌法轉化水稻后所產生的抗性愈傷組織數因品種而異，粳稻品種高于秈稻品種。
實施例4、轉基因水稻植株的PCR鑒定根據目的基因DNA序列設計如下引物1、pgy基因的上游引物P15′-ATGGCCGCCAAGCTAGTT-3′(18bp)；下游引物P25′-CTAAGCCACAGCTCTCTFCT-3′(20bp)；陽性轉基因植株可擴增出1500bp片段。
2、hpt基因的上游引物P35’-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3’(20bp)；下游引物P45’-TACACGCCATCGGTCCAGA-3’(19bp)；陽性轉基因植株可克隆出850bp片段。
3、bar基因上游引物5’-CCATCGTCAACCACTACATCGAG-3’(23bp)；下游引物5’-CTGAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3’(22bp)；陽性植株可克隆出440bp片段。
采用hpt基因、pgy基因進行PCR反應，如圖6所示，最終從168株轉基因植株鑒定出65株為陽性，陽性率為39％，圖中1～21轉基因植株；22.非轉化陰性對照；23、24pTGY質粒DNA(陽性對照)；251kb plus DNAmarke。
實施例5、轉基因植物的Southern雜交鑒定分析1、pgy基因為探針的鑒定分析10ug植物DNA用EcoRII和HindIII酶切消化，以入DNA/HindIII/EcoRI為標樣；未轉化的正常株(粳稻9804、早秈213)為陰性對照質粒pTGY被EcoRI酶切的樣品為陽性對照，用地高辛DIG標記的pgy基因作探針，用1％Agrose膠電泳(EB 0.5ug/ml，電壓1v/cm)；將膠置于0.25N HCl中脫嘌呤15分鐘，重蒸水洗2次；立即用785型真空吸印儀(BioRad Co.)轉印到尼龍膜上，轉移液為0.5NNaOH，0.6NNaCl，真空吸壓5mmHg柱，轉印90分鐘。2×SSC洗膜5分鐘，80℃真至烤膜2小時。如圖預雜交液為5×SSC；2％封閉劑；0.02％SDS；0.1％(w/v)肌酸鈉；50％甲酰胺；100ug/ml經變性與超聲波打斷的鯡魚精DNA，雜交溫度42℃。預雜交1-2小時，雜交液的探針濃度20-200ng/ml，雜交時間8～24小時。信號檢測用化學發光試劑盒(DIG-抗體，CSPD，BM Co.)方法，X光片曝光。
結果表明所檢測的18棵轉基因植株中14棵有目的條帶出現。這表明外源pgy已整合到了水稻基因組上。
實施例5、SDS-PAGA電泳鑒定pgy基因的表達1、水稻種子蛋白的提取樣品提取緩沖液成分，66mMTris，pH6.8，3％(w/v)SDS，3％(v/v)甘油，0.05％(w/v)溴酚蘭，2％(v/v)β-巰基乙醇。取2粒種子壓磨碎后，加0.8ml樣品提取緩沖液，充分震蕩混勻。室溫靜置1小時，100℃水浴中提取5～10分鐘(或在70℃下保溫5～8小時)。樣品以5000rpm離心2分鐘，將上清液吸取至另一1.5ml離心管，供點樣用。
2、SDS-PAGE蛋白電泳配制丙烯酰胺濃度為10％的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠，1)分離膠緩沖母液(4×)pH8.8，1.5mol/LTris-HCl，0.4％SDS。
2)濃縮膠緩沖母液(4×)pH6.8，0.5moll/LTris-HCl，0.4％SDS。
3)SDS-PAGE電極緩沖液pH8.3，192mmol/L甘氨酸，25mmol/L Tris，0.1％SDS。
4)染色液40％甲醇，10％乙酸，0.2％考馬斯亮藍R-250。
5)脫色液20％甲醇，6％乙酸。
6)10％分離膠4.0ml分離膠緩沖母液，5.3ml Arc/Bis(29.2∶0.8)，3.0ml H2O，0.1ml 10％過硫酸氨，0.008ml TEMED。
7)5.4％濃縮膠1.25ml濃縮膠緩沖母液，0.9ml Arc/Bis(29.2∶0.8)，0.015ml 10％過硫酸氨，0.005mlTEMED。
用美國BioRad公司產的ProteanIIxi型16cm長電泳槽，制0.75cm厚膠，上點樣40ul，先用100伏預電泳0.5小時，再用20伏電壓電泳24～36小時。取出凝膠用5％三氯乙酸固定30分鐘，考馬斯亮藍染色0.5～2小時，脫色處理5～12小時。
對86個用本發明方法得到的T2代單株的種子蛋白進行了分析。結果表明12株種子蛋白中只有pgy基因的表達，6個株系同時有pgy和hpt基因的表達，10個株系同時有pgy和bar基因的表達。
實施例6、轉基因水稻后代農藝性狀及種子品質性狀分析對120個用本發明方法得到的轉基因后代株系進行農藝性狀(包括株高、分蘗數、穗長、千粒重等)與品質性狀的分析，結果見表6。
應用近紅外分析儀對轉基因植株后代種子蛋白的含量進行了分析測定。為了保證數據的準確可靠，每一株轉基因植株的種子分別隨即取10粒進行分析，將測定結果取平均值，并與對照植株的種子蛋白含量進行比較，計算出蛋白質提高率％＝(轉基因植株種子蛋白質含量-對照植株的種子蛋白含量)÷對照植株的種子蛋白含量。
表6、部分轉基因植株后代農藝性狀及種子蛋白含量分析結果

從結果中可以看出，轉基因植株后代的農藝性狀與對照植株相比，幾乎沒有變異。而種子蛋白含量比對照品種有不同程度的提高，提高幅度為4.3％～48.8％。由此可以得出結論，轉化株系的營養品質(蛋白質含量)改善效果十分顯著。
實施例7、轉基因水稻后代的遺傳與變異采用幼葉葉片涂抹除草劑的方法，鑒定除草劑抗性bar基因在轉基因植株T1和T2代70個轉基因后代株系的表達。田間播種30天，取單株的葉片用8mg/L的Bialaphos進行涂抹處理，處理10～15天后觀察植株葉片對除草劑抗性的反應，確定bar基因抗性的分離規律。結果表明，bar基因的遺傳基本符合盂德爾3∶1分離比例。T1代檢測的抗性與非抗性的比例為30∶7。T2代植株中，來自18個無抗性的抹系，仍無抗性；來自具有抗性部分的后代，20個株系，抗性能穩定遺傳，另外28株系出現了分離現象。
序列表SEQ ID NO.11 atg gcc aag cta gtt ttt tcc ctt tgt ttt ctg ctt ttc agt ggc tgc tgc ttc gct ttc 60M A K L V F S L C F L L F S G C C F A F61 agt tcc aga gag cag cct cag caa aac gag tgc cag atc caa aaa ctc aat gcc ctc aaa 120S S R E Q P Q Q N E C Q I Q K L N A L K121 ccg ggt aac cgt ata gag tca gaa gga ggg ctc att gag aca tgg aac cct aac aac aag 180P G N R I E S E G G L I E T W N P N N K181 cac cct gag ctg caa tgc gcc ggt gtc act gtt tcc aaa cgc acc ctc aac cgc aac ggc 240H P E L Q C A G V T V S K R T L N R N G241 tcc cac ttg cca tct tac tca cct tat ccc caa atg atc att gtc gtt caa ggg aag gga 300S H L P S Y S P Y P Q M I I V V Q G K G301 gca att gga ttt gca ttt ccg gga tgt cct gag acg ttt gag aag cca caa caa caa tca 360A I G F A F P G C P E T F E K P Q Q Q S361 agc aga aga ggc tca agg tcg cag cag caa cta caa gac agt cac cag aag att cgt cac 420S R R G S R S Q Q Q L Q D S H Q K I R H421 ttc aat gaa gga gac gta cta gtg att cct ctt ggt gtt cct tac tgg acc tat aac act 480F N E G D V L V I P L G V P Y W T Y N T481 tgt tgc cgt ttc tat tat tga cac caa cag ctt gga gaa cca gct cga cca gat gcc tag 540V A V S I I D T N S L E N Q L D Q M P R541 gag att cta tct tgc tgg gaa cca aga gca aga gtt tct aaa ata tca gca aga gca agg 600R F Y L A G N Q E Q E F L K Y Q Q E Q G601 agg tca tca aag cca gaa agg aaa gca tca gca aga aga aga aaa cga agg agg cag cat 660G H Q S Q K G K H Q Q E E E N E G G S I661 att gag tgg ctt cac cct gga att ctt gga aca tgc att cag cgt gga caa gca gat agc 720L S G F T L E F L E H A F S V D K Q I A721 gaa aaa cct aca agg aga gaa cga agg gga aga caa ggg agc cat tgt gac agt gaa 780K N L Q G E N E G E D K G A I V T V K781 agg agg tct gag cgt gat aaa acc acc cac gga cga gca gca aca aag acc cca gga aga 840G G L S V I K P P T D E Q Q Q R P Q E E841 gga aga aga aga aga gga tga gaa gcc aca gtg caa ggg taa aga caa aca ctg cca acg900E E E E E D E K P Q C K G K D K H C Q R901 ccc ccg agg aag cca aag caa aag cag aag aaa tgg cat tga cga gac cat atg cac cat960P R G S Q S K S R R N G I D E T I C T M961 gag act tcg cca caa cat tgg cca gac ttc atc acc tga cat cta caa ccc tca agc cgg1020R L R H N I G Q T S S P D I Y N P Q A G1021 tag cgt cac aac cgc cac cag cct tga ctt ccc agc cct ctc gtg gct cag act cag tgc1080S V T T A T S L D F P A L S W L R L S A1080 tgg att tgg gtc tct ccg caa gaa tgc aat gtt cgt gcc aca cta caa cct gaa cgc gaa cag1140G F G S L R K N A M F V P H Y N L N A N S1141 cat aat ata cgc att gaa tgg acg ggc att gat aca agt ggt gaa ttg caa cgg tga gag1200I I Y A L N G R A L I Q V V N C N G E R1201 agt gtt tga tgg aga gct gca aga ggg acg ggt gct gat cgt gcc aca aaa ctt tgt ggt1260V F D G E L Q E G R V L I V P Q N F V V1361 ggc tgc aag atc aca gag tga caa ctt cga gta tgt gtc att caa gac caa tga tac acc1300A A R S Q S D N F E Y V S F K T N D T P1301 cat gat cgg cac tct tgc agg ggc aaa ctc att gtt gaa cgc att acc aga gga agt gat1360M I G T L A G A N S L L N A L P E E V I1361 tca gca cac ttt caa cct aaa aag cca gca ggc cag gca ata aag aac aac aac cct ttc1420Q H T F N L K S Q Q A R Q I K N N N P F1421 aag ttc ctg gtt cca cct cag gag tct cag aag aga gct gtg gct tag1469K F L V P P Q E S Q K R A V A
權利要求
1.一種改良水稻營養品質的方法，是將大豆種子貯藏蛋白的基因導入栽培水稻中。
2.一種編碼權利要求1所述的蛋白質的核酸，其特征在于該核酸具有SEQ ID NO.1的序列或與SEQ IDNO.1中描述的氨基酸序列有至少95％同源性的功能上等價的氨基酸序列。
3.根據權利要求1所述的一種改良水稻營養品質的方法，其特征在于與所述大豆種子貯藏蛋白基因pgy一同導入栽培水稻中的還有編碼抗潮霉素的hptII基因或編碼抗除草劑PPT與Bialaphos的bar基因。
4.根據權利要求2所述的一種改良水稻營養品質的方法，其特征在于以CaMV35S的啟動子來驅動hptII基因的表達。
5，根據權利要求2所述的一種改良水稻營養品質的方法，其特征在于以包括其內含子的玉米Ubi啟動子或包括其內含子的水稻Actin啟動子來驅動bar基因的表達。
6.根據權利要求1所述的一種改良水稻營養品質的方法，其特征在于所述導入大豆種子貯藏蛋白基因pgy的外植體為栽培水稻的幼胚、幼穗、花藥、胚芽鞘或胚性愈傷組織。
7.根據權利要求1所述的一種改良水稻營養品質的方法，其特征在于以編碼葡萄糖苷酸酶的GUS基因為報告基因。
8.根據權利要求1所述的一種改良水稻營養品質的方法，其特征在于所述大豆為栽培優質大豆品種。
9.根據權利要求1所述的一種改良水稻營養品質的方法，其特征在于所述栽培水稻為中遠9804、中作93、早秈213、竹青、粵香占、湘早19、湘早24、R24或R64。
10.根據權利要求1所述的一種改良水稻營養品質的方法，其特征在于所述改良后的栽培水稻中只含有所轉入的目標蛋白基因。
全文摘要
本發明公開了一種改良水稻營養品質的方法。本發明的目的是提供一種利用基因工程手段改良水稻營養品質的方法。本發明所涉及的一種改良水稻營養品質的方法是將編碼大豆種子貯藏蛋白的基因pgy導入栽培水稻中。與所述pgy基因一同導入栽培水稻的還有編碼抗潮霉素的hptII基因或編碼抗除草劑PPT與Bialaphos的bar基因。本發明提供了轉化水稻的方法，包含提供給植物細胞含有T－DNA構建體并可以轉移所述構建體進入植物細胞基因組的重組核酸。用本發明的方法將大豆種子貯藏蛋白的基因導入并整合到水稻基因組，改良水稻的營養品質，目標單一，無不利基因的連鎖問題，無種屬的限制，已經獲得的轉基因植株蛋白質的數量和質量明顯提高，種子的加工性狀和質量得到了較大改善，并且不含篩選標記基因。
文檔編號C12N15/82GK101024832SQ20061000811
公開日2007年8月29日 申請日期2006年2月20日 優先權日2006年2月20日
發明者潘照明 申請人:潘照明