專利名稱：感染性克隆的制作方法
技術領域：
本發明涉及制備DNA或RNA的方法、應用該方法獲得的核酸及其用作疫苗和用于基因治療的用途。
背景技術：
重組DNA技術的進步使生物之間的基因轉移獲得發展。目前，為了應用基因轉移技術生產具有經濟和工業價值的化學品、藥物和生物制品，進行了巨大努力。
對原核細胞和真核細胞進行基因操作的一個重要步驟是研制載體和載體-宿主系統。一般來說，載體是能夠在宿主細胞中復制或表達的核酸分子。載體-宿主系統可定義為攜帶載體而且允許其包含的基因信息復制和表達的宿主細胞。
已經應用DNA病毒基因組和RNA病毒基因組研制載體。從DNA病毒獲得能夠在宿主細胞核復制的病毒載體的缺點是能夠整合入所述細胞的基因組，因此這樣的病毒載體一般不是非常安全。相反，從RNA病毒獲得的病毒載體在宿主細胞細胞質中復制，它們比基于DNA病毒的載體更安全，因為復制是通過細胞核外的RNA進行的。因而這樣的載體整合入宿主細胞基因組的可能性非常小。
已經從以下正極性單鏈RNA病毒[ssRNA(+)]獲得了cDNA克隆例如微小RNA病毒(Racaniello & Baltimore，1981)、雀麥花葉病毒(Ahlquist等，1984)、甲病毒屬(包括新培斯病毒、無名森林病毒(Semliki Forest Virus)(SFV)和委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒(VEE)(Rice等，1987；Liljestrm和Garoff 1991；Frolov等，1996；Smerdou和Liljestrom，1999)、黃病毒和瘟病毒(pestivirus)(Rice和Strauss，1981；Lai等，1991；Rice等，1989)以及星狀病毒科病毒(Geigenmuller等，1997)。同樣，已經用與ssRNA(+)病毒基因組互補的DNA克隆研制獲得表達異源基因的載體，所述ssRNA(+)病毒例如甲病毒屬，包括新培斯病毒、無名森林病毒(SFV)和委內瑞拉馬腦脊髓炎(VEE)病毒(Frolov等，1996；Liljestrm，1994；Pushko等，1997)。然而，應用RNA病毒制備重組病毒的所有方法仍然非常復雜，因為大多數RNA病毒含有細菌毒性序列。所以，制備病毒RNA的cDNA，然后使cDNA亞克隆入細菌，常常導致細菌宿主DNA序列缺失或重排。為此，大多數常用亞克隆及表達載體不能用來制備重組RNA病毒來源的DNA大片段。但是，研制藥物、尤其是疫苗在許多方面需要獲得可攜帶外源長DNA序列的載體。
冠形病毒是RNA病毒中具有最大已知基因組的ssRNA(+)病毒，其長度為約25-31千堿基對(kb)(Siddell，1995；Lai & Cavanagh，1997；Enjuanes等，1998)。在冠形病毒感染期間，其基因組RNA(gRNA)復制，而且合成一套正極性和負極性亞基因組RNA(sgRNA)(Sethna等，1989；Sawicki和Sawicki，1990；van der Most & Spaan，1995)。合成sgRNA是在感染細胞細胞質中進行的RNA依賴性過程，然而其準確機制仍然不完全清楚。
關于構建編碼某些冠形病毒(例如小鼠肝炎病毒(MHV)、傳染性氣管炎病毒(IBV)、牛冠形病毒(BCV)(Chang等，1994)和豬胃腸炎病毒(TGEV)(西班牙專利申請P9600620；Méndez等，1996；Izeta等，1999；Sanchez等，1999))的干擾缺損(DI)病毒基因組(其復制和轉錄需要存在互補病毒的缺失突變體)的cDNA已有介紹。但是仍然不能構建編碼冠形病毒完整基因組的cDNA克隆，其原因是冠形病毒基因組太大以及存在毒性序列。
總而言之，盡管已經研制成功了大量在宿主細胞復制和表達異源核酸的病毒載體，但是大多數表達異源基因的已知載體不是非常適合亞克隆RNA病毒。此外，如此獲得的病毒載體因為缺乏種特異性和靶器官或靶組織限制以及其克隆能力有限而存在若干缺點，限制其在基礎研究和應用研究中應用的可能性。
所以，需要開發能夠克服上述缺點、表達異源基因的新型載體的方法。具體來說，最好獲得表達異源基因的安全性和克隆能力高的大載體，可以進行設計使其種特異性和向性受到控制。
發明概述按照本發明應用一種制備DNA的方法解決上述問題，該方法包括多個步驟，其中將一種如下DNA克隆入細菌人工染色體(BAC)(a)包含RNA病毒的全長拷貝基因組RNA(gRNA)的DNA；或者(b)包含一個或若干個RNA病毒gRNA片段的DNA，所述片段編碼RNA依賴性RNA聚合酶和至少一種結構蛋白或非結構蛋白；或者(c)與(a)或(b)的序列具有至少60％同源性的DNA。
意想不到的是，本發明人發現，采用BAC作克隆載體可克服使用現有技術方法亞克隆和表達得自病毒gRNA的長DNA序列遇到的問題。使用BAC的特別好處是這些載體在細菌中以每個細胞一個或多個拷貝存在，大大限制了毒性而且減小質粒間重組的可能性。
本發明進一步提供制備病毒RNA或病毒體的多步驟方法，其中按照一種上述方法制備DNA，表達所述DNA，分離病毒RNA或病毒體。進一步公開了包括上述制備DNA方法的步驟的制備藥物、尤其是疫苗的方法。
另一方面，本發明提供包含得自冠形病毒基因組RNA(gRNA)的序列的DNA，所述序列與冠形病毒天然序列的同源性至少為60％，而且編碼RNA依賴性RNA聚合酶和至少一種結構蛋白或非結構蛋白，其中所述DNA的一個片段能夠轉錄為RNA，該RNA能夠裝配為病毒體。本發明還包括制備相應DNA的方法。
本發明還提供載體，更準確地說是包含相應核酸的細菌人工染色體(BAC)。按照一個進一步的實施方案，本發明涉及宿主細胞和包含本發明DNA或RNA的感染性減毒或失活病毒。
本發明還提供藥用制劑，例如包含本發明核酸、載體、宿主細胞或病毒體的單價或多價疫苗。
最后，本發明提供生產病毒體或病毒RNA的方法以及應用該方法獲得的病毒RNA，所述方法包括多個步驟，其中轉錄按照本發明的DNA，然后回收病毒體或病毒RNA。
附圖簡述

圖1圖示構建編碼TGEV感染性RNA的cDNA克隆。圖1A圖示TGEV的遺傳結構，以字母和數字(1a、1b、S、3a、3b、E、M、N和7)標示基因名稱。圖1B圖示cDNA克隆策略，該策略在于完成了DI-C基因組。標示出了為了重建全長cDNA而完成的缺失Δ1、Δ2和Δ3。DI-C基因組結構下面的數字指示所述DI-C基因組各缺失兩側的核苷酸。圖1C圖示構建完成缺失Δ1的4個cDNA片段和連接時使用的主要限制性位點位置。插入片段Δ1使cDNA毒性增加。
圖2圖示用于克隆TGEV感染性cDNA的質粒pBeloBAC(Wang等，1997)的結構。pBeloBAC質粒由H.Shizuya和M.Simon(CaliforniaInstitute of Technology)提供，包含7,507個堿基對(bp)，它包含大腸桿菌F因子復制起點(oriS)、保持一個細胞一個拷貝質粒需要的基因(parA、parB、parC和repE)以及氯霉素抗性基因(CMr)。指出了T7和SP6啟動子和獨特的限制性位點的位置。CosN有助于構建pBAC質粒的λcosN部位；lac Zβ-半乳糖苷酶基因。還指出了制備質粒時使用的序列lxoP。
圖3圖示構建TGEV cDNA時使用的基礎質粒結構。pBAC-TcDNAΔClaI質粒包含除了一個5,198 bp的ClaI-ClaI片段之外的所有TGEV RNA信息。在巨細胞病毒(CMV)立即早期表達(IE)啟動子控制下克隆cDNA，3’末端側為24個A殘基的多聚腺苷酸尾、丁型肝炎病毒(HDV)的核酶和牛生長激素(BGH)終止序列和聚腺苷酸化序列。pBAC-B+C+D5’質粒包含完成pBAC-TcDNAΔClaI直至所述cDNA為全長所需要的ClaI-ClaI片段。pBAC-TcDNAFL質粒含有TGEV全長cDNA。SAP蝦堿性磷酸酶。
圖4圖示TGEV PUR46-MAD(MAD)和C11克隆的S基因核苷酸序列的差異。數字指示取代核苷酸的位置，每個基因的第一個核苷酸為起始密碼子的A。條圖中的字母指示所示位置的相應核苷酸。條圖下面的字母指示指示位置周圍的核苷酸編碼的取代氨基酸(aa)。Δ6nt指示6個核苷酸的缺失。箭頭指示S基因終止密碼子的位置。
圖5圖示從全長TGEV cDNA拯救感染性TGEV遵循的策略。使pBAC-TcDNAFL質粒轉染ST細胞(豬睪丸細胞)，轉染后48小時用上清液感染新的ST細胞。按照所示時間傳代病毒。每次傳代時，分別收集等份上清液和單層細胞進行病毒滴定以及分離RNA進行RT-PCR分析。vgRNA全長病毒RNA。
圖6圖示TGEV cDNA在轉染ST細胞產生的致細胞病變作用(CPE)。非感染(對照)ST細胞沒有CPE(圖6A)，pBAC-TcDNAFL轉染ST細胞后14小時和20小時觀測到CPE(分別為圖6B和6C)。
圖7圖示病毒滴度隨傳代的變化。所示圖為pBAC-TcDNAFL轉染后不同傳代數的2個系列單層細胞(1和2)上清液的病毒滴度。模擬物1和2是指非轉染ST細胞。TcDNA1和2是指pBAC-TcDNAFL轉染ST細胞。
圖8圖示對pBAC-TcDNAFL轉染ST細胞后回收的病毒進行序列分析的結果。上圖顯示TGEV基因組的結構。同樣，指出了從pBAC-TcDNAFL(TcDNA)質粒回收的病毒與TGEV克隆C8和C11之間的核苷酸序列差異(遺傳標記)。條圖上的數字指示所述核苷酸之間不同的位置。通過對RT-PCR(逆轉錄和聚合酶鏈式反應)獲得的片段進行測序，確定TcDNA病毒和C11克隆的cDNA序列。C8克隆的序列正待公開(Penzes等，1999)，它列在該專利的后面。以通過RT-PCR獲得的片段的ClaI和DraIII顯示限制圖譜，所述片段包含TcDNA和C8病毒的核苷酸18,997和20,990。限制圖譜顯示這些病毒的cDNA中是否存在ClaI和DraIII位點。該分析結果表明，回收的TcDNA病毒存在預期的分離克隆C11的S基因序列。MWM分子量標記。
圖9顯示回收病毒的RT-PCR分析結果。在細胞聚合酶pol II識別的CMV啟動子控制下表達病毒RNA。通常該RNA在轉運至細胞質的過程中進行剪接。為了研究情況是否如此，使用預測人DNA序列剪接位點的程序確定高剪接概率的RNA位點(2.1.5.94版，Department of Cell Biology，Baylor College of Medicine)(Solovyev等，1994)。最高剪接概率的潛在剪接位點是nt7,243的剪接供體位點和nt7,570的剪接受體位點(圖9A)。為了研究該結構域是否進行剪接，從第零代和第二代非轉染培養物的RNA(對照)或者具有反向ClaI片段的TcDNA(TcDNAFL(-ΔClaI)RS)轉染的ST細胞或者具有正向ClaI片段的TcDNA(TcDNAFL)轉染的ST細胞制備nt7,078和nt7,802之間的RT-PCR片段(圖9B)，以瓊脂糖凝膠分析RT-PCR獲得的產物。圖9C(第0代)和9D(第二代)顯示所獲得的結果。
圖10圖示對TcDNA轉染的ST細胞培養物產生的病毒的免疫熒光分析結果。用TGEV PUR46-MAD分離株特異性抗體和pBAC-TcDNAFL質粒轉染后回收的病毒特異性抗體進行免疫熒光染色。為此，使用結合兩種分離株或者只結合PUR46-MAD的TGEV特異性單克隆抗體(Sanchez等，1990)。結果證實所述TcDNA病毒具有預期抗原性。TGEV特異性多克隆抗血清結合兩種病毒，但是不結合非感染培養物，只有預期的S(ID.B12和6A.C3)、M(3B.B3)和N(3B.D8)蛋白特異性單克隆抗體結合所述TcDNA病毒(Sanchez等，1999)。
圖11圖示在基因間(IG)序列的5’側翼區不同的不同轉錄調節序列(TRS)之下表達GUS。在CMV啟動子控制下克隆小基因組M39。在該小基因組中插入多克隆序列(PL1，5’-CCTAGGATTTAAATCCTAAGG-3’；SEQ ID NO2)和轉錄單位，轉錄單位的組成是選定的轉錄調節序列(TRS)、另一個多克隆序列(PL2，5’-GCGGCCGCGCCGGCGAGGCCTGTCGAC-3’；SEQ ID NO3；或者PL3，5’-GTCGAC-3’；SEQ ID NO4)、具有Kozak(Kz)結構域結構的序列、β-半乳糖苷酶(GUS)基因和再一個多克隆位點(PL4，5’-GCTAGCCCAGGCGCGCGGTACC-3’；SEQ ID NO5)。這些序列的3’末端側1為小基因組M39的3’序列、HDV核酶和BGH的終止序列和聚腺苷酸化序列。TRS在IG序列(CUAAAC)1的5’末端具有不同數量(0、-3、-8和-88)核苷酸，如圖所示，它們來自N、S或M基因。用不同質粒轉染ST細胞，用互補病毒(PUR46-MAD)感染，傳代上清液6次。利用Izeta介紹的方案(Izeta等，1999)測定感染細胞的GUS活性。根據GUS表達與傳代數關系獲得的結果總結在圖12B中。
圖12圖示在IG序列的3’側翼區改變的不同TRS之下表達GUS(見圖11A)。應用相當于TGEV N基因的-88核苷酸和IG序列(CUAAAC)的5’-側翼區的轉錄單位，修飾3’-側翼序列。如圖12A所示，這些序列相當于不同TGEV基因(S、3a、3b、E、M、N和7)的序列。在兩種情況下，3’-序列被包含限制性位點(SalI)和優化Kozak序列(Kz)的其它序列代替或者被與第一個IG序列之后的序列相同的序列代替，第一個IG序列之前為病毒基因組的前導序列。應用上述方案(Izeta等，1999)測定感染細胞的GUS活性。cL12指示與TGEV基因組“前導”序列3’末端序列相同的12個核苷酸序列(參見最后標示的病毒序列)。根據GUS表達與傳代數關系獲得的結果總結在圖12B中。
圖13圖示小基因組中表達模塊的插入位點對GUS表達水平的影響。在小基因組M39的4個限制性位點(圖13A)中插入包含IG序1需要指出的是，CTAAAC和CUAAAC對于本專利具有相同含義。第一種為DNA序列，第二種為相應的RNA。列(CUAAAC)5’末端側的N基因的-88nt和3’末端側的Kz序列(參見圖12A)的GUS轉錄單位，以確定是否所有這些位點都同樣允許表達異源基因。用這些質粒轉染ST細胞，并用互補病毒(PUR46-MAD)感染。按照上述方案(Izeta等，1999)測定沒有傳代(P0)時感染細胞的GUS活性。獲得的結果總結于圖13B。
發明詳述按照本發明提供制備DNA的方法，該方法包括多個步驟，其中將一種下列DNA克隆入細菌人工染色體(BAC)中(a)包含RNA病毒全長拷貝的基因組RNA(gRNA)的DNA；或者(b)包含RNA病毒的一個或若干個gRNA片段的DNA，所述片段編碼RNA依賴性RNA聚合酶和至少一種結構蛋白或非結構蛋白；或者(c)與(a)或(b)的序列具有至少60％同源性的DNA。
按照所述應用，“細菌人工染色體”是包含F因子序列的DNA序列。包含該序列的質粒(所謂的F質粒)能夠穩定維持低拷貝數(每個細胞一個或兩個拷貝)的300Kb以上的異源序列。相應的BAC是本領域已知的(Shizuya等，1992)。
按照本發明，克隆入BAC的DNA與RNA病毒天然序列的同源性為至少60％、優選75％、更優選85％或95％。最好使用可從歐洲生物信息學研究所(European Bioinformatics Institute，EBI)獲得的Clustal計算機程序確定序列同源性。
按照本發明所述方法，克隆入BAC的DNA還可包含所述病毒的一種結構蛋白或非結構蛋白以外的若干種或全部蛋白的編碼序列。
在本發明的一個優選實施方案中，克隆入BAC的DNA還包含編碼一個或若干個異源基因的序列。按照本發明應用，如果一種基因不是來源于用作編碼所述RNA依賴性RNA聚合酶和所述結構蛋白或非結構蛋白的基因來源的病毒，則所述基因稱為“異源基因”。因此，“異源基因”也指來源于一種病毒而且以包含來源于另一種病毒的序列的載體表達的基因。任何目的異源基因均可以插入本發明的核酸中。特別優選插入的基因編碼被哺乳動物免疫系統識別為感染性因子抗原的一種或若干種肽或蛋白。另一方面，可以應用編碼至少一種干擾感染因子復制的分子或者針對感染因子提供保護的抗體的異源基因，實施本發明的方法。異源序列可以包括編碼免疫調節蛋白、細胞因子、免疫增強物和/或抗炎化合物的序列。
可以使用任何大小的DNA克隆入BAC來實施本發明方法。然而，如果使用大序列，相對于從病毒制備亞克隆DNA的已知方法，本發明方法具有特別突出的優勢。所以，克隆入BAC的DNA長度至少為5Kb，其中特別優選至少15、25或30Kb大小的DNA。
按照特別優選的本發明實施方案，提供這樣的方法其中所述BAC包含控制克隆入BAC中的DNA轉錄的序列。這使得允許轉錄病毒RNA，由此能夠表達所述病毒。為此可使用本領域已知的控制轉錄的任何序列，包括驅動來自DNA基因組或RNA基因組的基因表達的序列。優選應用巨細胞病毒(CMV)的立即早期(IE)啟動子。
克隆入BAC的DNA的3’-末端側也可以為聚腺苷酸尾。該核酸可以包括牛生長激素(BGH)的終止序列和/或聚腺苷酸化序列。此外/或者，所述核酸可以包含編碼核酶(例如丁型肝炎病毒(HDV)的核酶)的序列。
如果至少一種所述病毒基因通過取代、缺失或加入核苷酸進行了修飾，則還可以實現其它優勢。例如修飾控制病毒向性的基因可以獲得向性不同的病毒。或者可以用另一種病毒的相應基因取代控制所述病毒向性的基因。優選在所述病毒的S、M和/或N基因中進行修飾。
在本發明的一個優選實施方案中，提供如下一種方法其中克隆入BAC的DNA能夠轉錄為RNA，該RNA可以裝配為病毒體。所裝配的病毒體可以為感染性、減毒性、復制缺陷型或失活病毒。
在本發明方法中可以使用任何RNA病毒。所述病毒可以是例如微小RNA病毒、黃病毒、披膜病毒、冠形病毒、toroviruses、arterivurses、calcivirus、彈狀病毒、副粘病毒、線狀病毒、博爾納病毒(bornavirus)、正粘病毒、布尼病毒、沙粒病毒或呼腸孤病毒。優選使用天然存在正鏈基因組的病毒。
此外，本發明提供制備病毒RNA或病毒體的方法，該方法包括多個步驟，其中按照一種上述方法制備DNA，在合適的宿主細胞中表達所述DNA，從所述宿主細胞分離病毒RNA或病毒體。可以使用本領域已知的從細胞培養物分離病毒的任何方法。本發明公開了制備病毒RNA或病毒體的替代方法，其中使用化學品、生物試劑和/或細胞提取物轉錄或翻譯本發明DNA，然后分離所述病毒RNA或病毒體。對于某些實施方案，所述病毒隨后被滅活或殺死。
本發明還提供制備藥用組合物的方法，該方法包括多個步驟，其中按照一種上述方法制備DNA、病毒RNA或病毒體，然后使其與藥學上可接受的佐劑和/或載體混合。大量佐劑和載體以及稀釋劑是先有技術中已知的，而且可以用于本發明。所述藥物優選為保護人類或動物抵抗傳染性疾病的疫苗。所述藥物也可以有益地用于基因治療。
本發明進一步首次提供包含得自冠形病毒基因組RNA(gRNA)的序列的DNA，所述序列與冠形病毒天然序列具有至少60％同源性，而且編碼RNA依賴性RNA聚合酶和至少一種結構蛋白或非結構蛋白，其中一種所述DNA片段能夠轉錄為可裝配為病毒體的RNA。
按照本發明，術語“得自冠形病毒的序列”用以指與冠形病毒天然序列具有至少60％、優選75％、更優選85或95％同源性的核酸序列。可使用歐洲生物信息學研究所(EBI)提供的Clustal計算機程序測定序列同源性。
術語“冠形病毒”按照本發明用以指一組這樣的病毒具有25-33Kb的線性、正義、ssRNA單個分子。這些病毒通常含有7-10個結構基因，即編碼決定病毒結構的蛋白的基因。這些基因在病毒基因組中的排列順序通常為5’復制酶-(血凝素-酯酶)-刺突-包膜-膜-核蛋白-3’。此外，所述病毒基因組可以含有無數編碼具有共同3’末端的一個嵌套組mRNA而且大部分是非必需的非結構基因。
術語“能夠轉錄為可裝配為病毒體的RNA”用以特征性描述這樣的DNA序列它一旦引入合適宿主細胞，就可以轉錄為RNA而且產生病毒體。所述病毒體最好為感染性病毒，但是也可以為包含所述RNA的失活病毒、減毒病毒或復制缺陷型病毒。最好是表達所述病毒體必需的所有信息都由本發明的DNA序列編碼。
本發明核酸可以進一步包含編碼一個或若干個目的異源基因的序列。按照本發明，如果一種基因不是來源于用作編碼所述RNA依賴性RNA聚合酶和結構蛋白或非結構蛋白的所述基因的源病毒的冠形病毒時，則所述基因稱為“異源基因”。因此，“異源基因”也指得自一種冠形病毒而且在包含得自另一種冠形病毒的序列的載體中表達的基因。在本發明核酸中可以插入任何目的異源基因。特別優選插入的基因編碼被哺乳動物免疫系統識別為感染性因子抗原的肽或蛋白。因此，異源基因可以編碼至少一種適合誘導抗感染因子的免疫應答的抗原、至少一種干擾感染因子復制的分子或者針對感染因子提供保護的抗體。或者/此外，異源基因可以編碼免疫調節蛋白、細胞因子、免疫增強物和/或抗炎化合物。
轉錄為RNA的本發明DNA片段的大小最好為至少25Kb。特別優選至少30Kb大小的片段。
按照本發明的一個優選實施方案，所述DNA進一步包含得自冠形病毒的序列，所述序列編碼除了一種冠形病毒結構蛋白或非結構蛋白以外的若干或所有蛋白。另一方面，本發明的DNA進一步包含編碼冠形病毒所有結構蛋白或非結構蛋白的序列。
按照再一個實施方案，本發明核酸包含控制來源于冠形病毒gRNA的序列轉錄的序列。為此可以使用本領域已知的控制轉錄的任何序列，包括驅動來自DNA或RNA基因組的基因表達的序列。優選使用巨細胞病毒(CMV)的立即早期(IE)啟動子。
按照本發明的核酸的3’末端側也可以為聚腺苷酸尾。所述核酸可以包含牛生長激素(BGH)的終止序列和/或聚腺苷酸化序列。此外/或者，所述核酸可以包含編碼核酶如丁型肝炎病毒(HDV)核酶的序列。
本發明核酸可以包含得自任何冠形病毒的序列，例如得自以下病毒分離株的序列豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、傳染性氣管炎病毒(IBV)、牛冠形病毒(BoCV)、犬冠形病毒(CCoV)、貓冠形病毒(FcoV)或人冠形病毒。按照一個優選實施方案，所述核酸得自傳染性胃腸炎病毒。
按照本發明的再一個實施方案，本發明DNA為質粒的組成部分、優選為細菌人工染色體(BAC)的組成部分。
本發明進一步提供包含相應核酸或載體的宿主細胞。該宿主細胞可以是真核細胞或原核細胞。另一方面，本發明提供包含按照本發明的核酸的病毒體。相應的病毒體例如可以從本發明核酸轉染或感染的細胞培養物中分離獲得。
按照又一實施方案，本發明提供制備病毒體或病毒RNA的方法，該方法包括多個步驟，其中將本發明DNA導入宿主細胞中，在允許所述DNA表達的情況下培養含有所述DNA的宿主細胞，回收病毒體或病毒RNA。此外，提供這樣的制備病毒體或病毒RNA的方法其中使本發明DNA與化學品、生物試劑和/或細胞提取物在允許表達所述DNA的條件下體外混合，回收病毒體或病毒RNA。本發明還包括通過以上兩種方法中任何一種方法獲得的病毒體和病毒RNA。優選攜帶異源基因的RNA和病毒體。如此獲得的病毒可以為傳染性、減毒、復制缺陷型或失活病毒形式。
所述病毒可以含有修飾基因，例如修飾的S、N或M基因。在本發明的一個特別實施方案中，對S、N或M基因的修飾產生減毒病毒或向性不同的病毒。
按照再一個實施方案，本發明提供包含按照本發明的核酸、宿主細胞或病毒體的藥用制劑。按照一個優選實施方案，所述藥用制劑為能夠保護動物抗感染性因子引起的疾病的疫苗。疫苗可以包含例如至少一種適合誘導抗感染性因子的免疫應答的抗原的序列或者包含對所述感染性因子提供保護的抗體的序列。疫苗可以包含表達至少一種干擾所述感染性因子復制的分子的DNA。或者，所述疫苗可以包含表達至少一種抗原的載體，所述抗原能夠誘導抵抗在呼吸道或腸道粘膜或其它組織中繁殖的不同感染性因子的系統免疫應答和/或粘膜免疫應答。所述疫苗也可以為能夠保護動物抗一種以上感染性因子引起的感染的多價疫苗，該多價疫苗包含一種以上的本發明核酸，其中每種核酸表達能夠誘導抗各所述感染性因子的免疫應答的抗原，或表達針對各所述感染性因子提供保護的抗體，或者表達干擾任何一種感染性因子復制的其它分子。
本發明疫苗還可以包含技術水平已知的藥學上可接受的任何載體或稀釋劑。
本發明還提供如下的制備本發明DNA的方法，該方法包括多個步驟，其中將在啟動子表達之下的冠形病毒來源的干擾缺陷型基因組克隆入BAC載體，重新插入所述缺陷型基因組中的缺失。該方法還包括多個步驟，其中在重新插入其它基因組DNA之前鑒定所述病毒基因組中的毒性序列。所述病毒基因組中的毒性序列最好是在完善所述基因組之前最后重新插入的序列。按照本發明，這種方法適合產生冠形病毒感染性克隆，該冠形病毒感染性克隆在細菌中穩定至少80代，因而提供非常有效的克隆載體。
本發明提供對得自冠形病毒的cDNA感染性克隆的研制(Almazan等，2000)以及從還包含插入所述克隆的異源核酸序列的所述感染性克隆構建的載體。本發明提供的感染性克隆和載體在基礎研究和應用研究中均具有無數用途，而且克隆能力高，可以對其進行設計使得其種特異性和向性容易控制。
本專利介紹這樣的研制方法這種方法使得在冠形病毒歷史上首次可獲得編碼冠形病毒基因組的全長感染性cDNA克隆(Almazan等，2000)。
研制了以用編碼冠形病毒基因組RNA(gRNA)的感染性cDNA克隆制備的冠形病毒為基礎的表達異源核酸的新型載體或系統。在本發明的一個具體實施方案中，所述冠形病毒是豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)。
所述新型表達系統可用于基礎研究或應用研究，以便例如獲得作為疫苗載體的目的產物(蛋白、酶、抗體等)，或者可用于人類和動物的基因治療。可以用常規遺傳工程技術操作得自感染性cDNA克隆的感染性冠形病毒，這樣可以將新的基因導入所述冠形病毒基因組，因而這些基因可以組織特異性和種特異性方式表達，以便誘導免疫應答或用于基因治療。此外。通過選擇可以增加百倍以上表達水平的新型轉錄調節序列(TRS)而優化所述表達。
得自冠形病毒、尤其是TGEV的載體相對于不在粘膜中復制的其它表達系統存在以下多個誘導粘膜免疫的優點(i)TGEV感染腸道粘膜和呼吸道粘膜(Enjuanes和Van der Zeijst，1995)，也就是說，感染誘導分泌型免疫的最佳部位；(ii)其向性可以通過修飾S(刺突)基因進行控制(Ballesteros等，1997)；(iii)存在開發依賴于互補病毒的表達系統的非致病株(Sanchaz等，1992)；(iv)冠形病毒是胞質RNA病毒，它可以復制但是不通過中間DNA期傳代(Lai和Cavanagh，1997)，使其幾乎不可能整合入細胞染色體。
能夠從編碼冠形病毒gRNA的cDNA回收感染性冠形病毒的方法包括以下策略(i)在合適啟動子控制下表達所述冠形病毒的RNA；
(ii)以細菌人工染色體(BAC)克隆所述冠形病毒基因組；(iii)鑒定對細菌具有直接或間接毒性的冠形病毒cDNA序列；(iii)鑒定編碼冠形病毒感染性RNA的cDNA組分(啟動子、轉錄終止序列、聚腺苷酸化序列、核酶等)連接的準確順序；(iv)鑒定一組綜合允許有效拯救cDNA的感染性冠形病毒的技術和方法(BAC的生長條件、對BAC DNA純化方法的改進、轉化技術等)。
啟動子對于增強病毒RNA在細胞核內表達起重要作用，病毒RNA在細胞核內合成，然后轉運到胞質中。
BAC的應用構成本發明方法的一個關鍵點。眾所周知，克隆細菌質粒中的真核細胞序列常常因為所述外源性序列對細菌的毒性而失敗。在這樣的情況下，所述細菌通常通過修飾所導入的序列而消除毒性。然而，隨之而產生的策略是，為了避免這些病毒序列的可能毒性，進行必要的克隆以便獲得在BAC中的完整冠形病毒cDNA。這些質粒在每個細胞中僅有一個拷貝，最多一個細胞兩個拷貝，這樣明顯限制其毒性以及降低質粒間重組的可能性。
通過鑒定冠形病毒的細菌毒性cDNA序列，可以完成編碼冠形病毒完整基因組cDNA的構建，而不包括所述毒性序列，毒性序列在構建完整基因組的最后一步中加入，即恰好在轉染真核細胞之前，這樣可以避免細菌對其進行修飾。
所以，本發明的一個目的在于編碼冠形病毒gRNA的感染性雙鏈cDNA克隆以及獲得它的方法。
本發明的再一個目的在于一組重組病毒載體，該組病毒載體包含所述感染性克隆和插入其中的異源核酸序列。
本發明又一個目的在于制備重組冠形病毒的方法，該方法包括將所述感染性克隆導入宿主細胞中，在允許所述感染性克隆復制的條件下培養所述轉化細胞，產生重組冠形病毒，從所述培養物回收重組冠形病毒。
本發明另一個目的在于制備修飾重組冠形病毒的方法，該方法包括將所述重組病毒載體導入宿主細胞中，在允許病毒載體復制和修飾重組冠形病毒產生的條件下培養轉化細胞，從所述培養物回收修飾的重組冠形病毒。
本發明另一個目的在于制備目的產物的方法，該方法包括在允許表達異源DNA序列的條件下培養包含所述重組病毒載體的宿主細胞。
包含上述感染性克隆或重組病毒載體的細胞構成本發明再一個目的。
本發明又一個目的在于一組疫苗，所述疫苗保護動物抗感染性因子引起的感染。所述疫苗包含感染性載體和藥學上可接受的賦形劑，所述感染性載體表達至少一種適于誘導抗各感染性因子的免疫應答的抗原或者至少一種對所述感染性因子提供保護的抗體。根據所述載體是表達一種還是多種能夠針對一種或多種感染性因子誘導免疫應答的抗原或者是表達一種還是多種針對一種或多種感染性因子提供保護的抗體，所述疫苗可以為單價疫苗或多價疫苗。
本發明提供的另一個目的包括免疫動物的方法，該方法在于給予所述疫苗。
本發明提供編碼冠形病毒感染性RNA的cDNA克隆，然后，本發明的感染性克隆包括(1)一個拷貝的冠形病毒感染性基因組RNA(gRNA)的互補DNA(cDNA)或者病毒RNA本身；(2)另一個基因的表達模塊，該表達模塊包含優化轉錄增強序列。
在本發明的一個特別實施方案中，所述冠形病毒為TGEV分離株、尤其是PUR46-MAD分離株(Sanchaz等，1990)，PUR46-MAD中存在的修飾是該病毒的S基因被C11克隆TGEV分離株的S基因代替或者被犬或人冠形病毒的S基因代替。
轉錄增強序列或啟動子為位于冠形病毒各信使RNA(mRNA)5’末端的RNA序列，病毒聚合酶RNA與其結合以開始轉錄信使RNA(mRNA)。在一個特別優選的實施方案中，應用CMV的IE啟動子由cDNA表達所述病毒基因組，因為使用該啟動子獲得高水平表達(Dubensky等，1996)，而且我們實驗室以前獲得的結果表明，得自TGEV冠形病毒的大的缺陷型基因組(9.7kb和15kb)表達的RNA在從其合成的細胞核轉移至胞質的過程中不會發生剪接。
本發明的感染性克隆還包含轉錄終止序列和聚腺苷酸信號，例如來自BGH基因的序列。這些終止序列必須位于聚腺苷酸尾的3’末端。在一個特別實施方案中，本發明的感染性克隆包含24個A殘基的聚腺苷酸尾以及BGH終止序列和聚腺苷酸化序列，它們之間間隔有HDV核酶序列。
所述病毒感染性cDNA已經插入其中的質粒為具有復制起點的DNA分子，因此，所述質粒有可能在合適細胞中復制。所使用的質粒是適合在合適宿主細胞例如細菌(例如大腸桿菌)中維持和擴增本發明感染性克隆的復制子。所述復制子一般帶有抗生素抗性基因(例如cat)，使得可以對攜帶它的細胞進行選擇。
在實施例1中介紹了在CMV的IE啟動子控制下構建TGEV感染性克隆。所述cDNA的3-末端側為24nt聚腺苷酸化序列、HDV核酶和BGH轉錄終止序列。
獲得本發明感染性克隆的程序是由冠形病毒gRNA構建全長cDNA，然后連接轉錄調節元件。
為了提高cDNA的穩定性，由以BAC在合適啟動子控制下克隆為cDNA的冠形病毒產生的DI基因組獲得編碼冠形病毒感染性gRNA的cDNA。然后鑒定細菌毒性序列，為了消除其毒性，去除所述毒性序列，在構建完成完整基因組之時、恰好在轉染真核細胞之前插入所述毒性序列。通過包含所述冠形病毒基因組的BAC質粒轉染支持病毒復制的真核細胞，可以重新構建病毒子代。
利用常規技術(Maniatis等，1989)連接轉錄調節元件。
可以應用常規遺傳工程技術操作本發明的感染性克隆，以便插入至少一種編碼確定活性的異源核酸序列，該序列處于所述感染性克隆中存在的啟動子以及獲得的表達載體包含的調節序列的控制之下。
本發明的感染性克隆具有許多用途，例如它既可以在基礎研究中使用，例如用于研究冠形病毒的復制和轉錄機制，也可以在應用研究中使用，例如用于開發表達目的產物(蛋白、酶、抗體等)的有效系統。
可以用本發明感染性cDNA克隆轉化合適細胞，并可以回收獲得的包含所述冠形病毒完整基因組的病毒體。因此，本發明還提供制備重組冠形病毒的方法，該方法包括將本發明的感染性cDNA導入宿主細胞中；在允許表達和復制所述感染性克隆的條件下培養所述宿主細胞；回收由所述重組冠形病毒獲得的病毒體，該病毒體包含所述冠形病毒的感染性基因組。可以用各種方法將本發明的感染性克隆導入宿主細胞中，例如用由本發明感染性克隆體外轉錄的RNA轉染所述宿主細胞，或者用本發明感染性cDNA克隆感染所述宿主細胞。包含本發明感染性克隆的所述宿主細胞構成本發明的又一個目的。
本發明還提供一組得自本發明感染性克隆的重組病毒載體，此后稱為本發明病毒載體。本發明病毒載體包括修飾后包含異源核酸的本發明感染性cDNA克隆，所述異源核酸在允許其表達的條件下插入所述感染性克隆中。
在本說明書中使用的術語“核酸”包括基因或基因片段，而且一般包括任何DNA或RNA分子。
在本發明使用的意義上，用于核酸的術語“異源”是指用以將所述異源核酸導入宿主細胞的載體中通常不存在的核酸序列。
可以包含在本發明病毒載體中的異源核酸可以是編碼蛋白、肽、表位或任何目的基因產物(例如抗體、酶等)的基因或片段。所述異源核酸可以利用常規基因工程技術插入到本發明感染性克隆cDNA的任何合適區段中，例如在ORF 1b之后或者基因N和7之間、起始密碼子(AUG)之后以及所述基因的讀框內；或者，在相當于其它ORF的區段中進行插入。構建本發明病毒載體時，插入異源核酸必須不能干擾任何基本病毒功能。
本發明病毒載體可以表達一種或多種活性。在表達多種活性的情況下，所述病毒載體包括與所要表達的活性同樣多的異源核酸序列，異源核酸序列之前存在一個或多個啟動子、或者一個啟動子和不同核糖體識別位點(IRES，內部核糖體進入位點)或者不同啟動子和一個核糖體識別位點。
因此，本發明提供生產目的產物的方法，該方法包括在允許所述異源核酸表達和允許目的產物回收的條件下培養包含本發明病毒載體的宿主細胞。包含本發明病毒載體的所述宿主細胞構成又一個本發明目的。
可以設計本發明病毒載體使得其種特異性和向性能夠容易地受到控制。因為所述特性，本發明病毒載體的一個非常有趣的應用是作為目的基因載體或疫苗載體用于基因治療，以便誘導針對不同病原體的免疫應答。
本發明還提供能夠保護動物抗感染性因子引起的感染的疫苗，該疫苗包含(i)至少一種本發明病毒載體，該載體表達至少一種適合誘導針對所述感染性因子的免疫應答的抗原，或者表達抗所述感染性因子的保護抗體，以及任選包含(ii)藥學上可接受的賦形劑。
在本發明使用的意義上，“誘導保護”應該理解為本發明病毒載體通過適當機制在接受生物(所免疫的動物)體內誘導免疫應答，所述適當機制例如增強細胞應答的物質(白介素、干擾素等)、細胞壞死因子和保護動物抗感染性因子引起的感染的相似物質誘導免疫應答的機制。
術語“動物”包括任何物種、優選哺乳動物(包括人類)的所有動物。
在本發明使用的意義上，術語“感染性因子”包括可以感染動物并且使動物致病的任何病毒、細菌、真菌、寄生蟲或其他感染性因子。
在一個特別實施方案中，本發明提供的疫苗包含至少一種這樣的本發明病毒載體該載體表達至少一種能夠誘導針對在呼吸道粘膜或腸道粘膜內繁殖的不同感染性因子的系統免疫應答和/或粘膜免疫應答的抗原。本發明載體特別適合誘導粘膜免疫以及乳性免疫，乳性免疫對保護新生動物抗腸道感染具有特別的意義。
在另一個具體實施方案中，本發明提供的疫苗包含至少一種這樣的本發明病毒載體它表達至少一種編碼任何同種型抗體(例如IgG1、IgA等)的輕鏈和重鏈的基因，所述抗體保護性抗感染性因子。
可以控制種特異性，使得所述病毒載體可表達感染各種目標動物(人、狗、貓、豬等)的冠形病毒包膜的S蛋白，該S蛋白適合被相應動物種細胞受體識別。
本發明提供的疫苗可以是單價或多價疫苗，是單價還是多價疫苗取決于本發明病毒載體是表達一種還是多種能夠誘導針對一種或多種感染性因子的免疫應答的抗原或者是表達一種還是多種抗一種或多種感染性因子的保護抗體。
在本發明的一個特別實施方案中，本發明提供的單價疫苗能夠保護人、豬、狗和貓抵抗不同的人、豬、犬和貓感染性因子，而且通過表達具有需要種特異性的冠形病毒S糖蛋白控制向性。
針對豬感染性因子的單價疫苗可以包含表達一種抗原的載體，所述抗原選自基本上由以下豬病原體抗原組成的抗原組大葉性肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、豬放線桿菌(Actinobacillus suis)、副豬嗜血菌(Haemophilus parasuis)、豬細小病毒、鉤端螺旋體屬(Leptospira)、大腸桿菌、豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelotrixrhusiopathiae)、多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、支氣管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、梭菌屬菌(Clostridium sp.)、豬痢疾小蛇菌(Serpulina hydiosenteriae)、豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬呼吸道冠形病毒、輪狀病毒，或者引起以下疾病的病原體豬呼吸及生殖綜合征、Aujeszky氏病(假性狂犬病)、豬流感、或傳染性胃腸炎；以及萎縮性鼻炎和增生性回腸炎的致病因子。針對犬感染性因子的單價疫苗可以包含表達一種抗原子的表達載體，所述抗原選自基本上由以下犬病原體抗原組成的抗原組犬皰疹病毒、1型和2型犬腺病毒、1型和2型犬細小病毒、犬呼吸道腸道病毒、犬輪狀病毒、犬冠形病毒、犬副流感病毒、犬流感病毒、犬瘟病毒、狂犬病毒、逆轉錄病毒和犬杯狀病毒。
針對貓感染性因子的單價疫苗可以包含表達一種抗原的表達載體，所述抗原選自基本上由以下貓病原體抗原組成的抗原組貓杯狀病毒、貓免疫缺陷病毒、貓皰疹病毒、貓全白細胞減少癥病毒、貓呼吸道腸道病毒、貓輪狀病毒、貓冠形病毒、貓傳染性腹膜炎病毒、狂犬病毒、貓鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci)和貓白血病病毒。
所述載體可表達抗感染性因子的保護抗體，所述感染性因子例如豬、犬或貓感染性因子，例如以上列舉的感染性因子。在一個具體實施方案中，所述載體表達中和TGEV的重組單克隆抗體(稱為6A.C3)，該重組單克隆抗體表達為同種型IgG1或IgA，其中所述免疫球蛋白恒定部分為豬來源；或者所述載體表達中和人輪狀病毒和豬輪狀病毒的抗體。
關于所述賦形劑，可以使用諸如生理鹽水或其它相似鹽溶液的稀釋劑。同樣，所述疫苗也可以含有通常用于水型疫苗制劑和油型疫苗制劑的佐劑，水型疫苗制劑使用的佐劑有例如氫氧化鋁、QuilA、鋁凝膠懸浮液等，所述油型疫苗以礦物油、甘油酯、脂肪酸衍生物及其混合物為基質。
本發明疫苗也可以含有增強細胞應答(CRP)的物質，即增強輔助T細胞亞群(TH1和TH2)的物質，例如白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、γ-IFN(γ干擾素)、細胞壞死因子和理論上可以刺激接種動物的細胞免疫的相似物質。這些CRP物質可用于水型佐劑或油型佐劑的疫苗制劑。也可以使用另一種類型調節和免疫刺激細胞應答的佐劑，例如MDP(胞壁酰二肽)、ISCOM(免疫刺激復合物)或脂質體。
本發明提供能夠預防和保護動物抗不同感染性因子引起的感染的多價疫苗。所述多價疫苗可以由編碼相應抗原的不同序列插入同一重組載體中的本發明病毒載體制得，或者通過構建獨立的重組載體，然后將其混合在一起以聯合接種，從而制得所述多價疫苗。因此，所述多價疫苗包含含一種以上異源核酸序列的病毒載體，所述異源核酸編碼一種以上抗原；或者所述多價疫苗包含不同病毒載體，其中每種病毒載體表達至少一種不同抗原。
同樣，可以使用編碼抗感染性因子的保護抗體的序列代替編碼所述抗原的序列，制備包含多價載體的多價疫苗。
在本發明的一個具體實施方案中，提供能夠分別免疫人、豬、犬和貓抵抗不同的人、豬、犬和貓感染性因子的疫苗。為此，所述疫苗中包含的病毒載體必須表達以上列舉的人、豬、犬或貓病原體的不同抗原或者其他抗原。
本發明疫苗可以以液體形式或凍干形式提供，而且可通過使所述重組系統懸浮在所述賦形劑中而制得。如果所述系統為凍干形式，則所述賦形劑本身可以為復制物質。
另一方面，本發明提供的疫苗可以與其他常規疫苗聯合使用，本發明疫苗或者構成其中的一部分或者為用其他常規疫苗或重組疫苗稀釋的稀釋部分或凍干部分。
本發明提供的疫苗可以通過口服、經鼻、皮下、皮內、腹膜內、肌內或以氣霧劑給予動物。
本發明還提供免疫動物、尤其是豬、犬和貓抵抗一種感染性因子或者同時抵抗不同感染性因子的方法，該方法包括口服、經鼻、皮下、皮內、腹膜內、肌內或氣霧劑(或其組合方式)給予包含免疫有效量的本發明提供的重組系統的疫苗。
另外，本發明還提供保護新生動物抵抗感染所述動物的感染性因子的方法，該方法在于在妊娠期間或之前將本發明提供的疫苗口服、經鼻、皮下、皮內、腹膜內、肌內或者氣霧劑給予(或者其組合給予)雌性動物，或者給予其子代。
下面借助實施例闡明本發明，實施例詳細介紹了如何獲得感染性克隆以及如何構建本發明病毒載體。不應該認為這些實施例限制本發明范圍，而只是為了舉例說明本發明。在所述實施例中，按照下面介紹的方法學進行細菌轉化和培養、DNA純化、序列分析和評價質粒穩定性的測定。
細菌轉化全部質粒均通過電穿孔導入大腸桿菌DH10B菌株(Gibco BRL)，只是對以前介紹的方法(Shizuya等，1992)進行了略微改進。對于每次轉化，在0.2-cm培養皿(BioRad)中混合2μL連接混合物和50μL感受態細菌，以200Ω、2.5kV和25μF進行電穿孔。然后，在每各轉化物中加入1mL SOC培養基(Maniatis等，1989)，于37℃溫育細胞45分鐘，最后，在含12.5μg/mL氯霉素的LB SOC培養基(Maniatis等，1989)平板上檢測重組菌落。
細菌的生長條件原初質粒中克隆有TGEV不完整基因組(圖3)，于37℃培養含有原初質粒的細菌，該細菌顯示正常生長動力學。另一方面，于30℃培養含有完整cDNA的BAC，目的是盡可能使穩定性最大化。盡管如此，菌落仍然變小，為了獲得正常大小的菌落，必須使培養時間延長至24小時。
純化DNA按照Woo介紹的方法(Woo等，1994)進行，只進行略微的改進。將單一菌落接種到4L含有氯霉素(12.5μg/ml)的LB中。于30℃培養18小時后，以6,000G離心收集細菌，采用Qiagen PlasmidMaxipreparations試劑盒按照生產商的建議純化質粒。利用這種方法觀測到，獲得的質粒DNA污染了細菌DNA。為了消除污染的細菌DNA，利用在氯化銫梯度上以55,000rpm離心16小時純化質粒DNA。根據質粒的大小，獲得產率為15-30μg/L。
序列分析應用熒光染料標記的雙脫氧核苷酸和溫度抗性聚合酶(PerkinElmer)在自動測序儀(373DNA測序儀，Applied Biosystems)上對DNA進行測序。所述試劑通過Applied Biosystems公司的試劑盒(ABIPRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Rcaction Kit)獲得。用以進行測序反應的熱循環儀為“GeneAmpPCR System 9600”(PerkinElmer)。
分別采用SeqMan II和Align(DNASTAR)程序連接序列以及進行其與TGEV共有序列的比較。檢測發現與共有序列沒有差異。
質粒穩定性在20mL含氯霉素(12.5μg/mL)的LB培養基中于30℃和37℃培養得自original glycerolates的含有重組pBeloBAC11質粒的細菌。該培養細菌被認為是第0代細菌。將細菌稀釋106倍，然后于30℃和37℃培養16小時。連續8天進行連續傳代(每次培養傳代相當于約20個世代細菌)。在第0代和第8代(160個世代)應用Miniprep純化質粒DNA，并應用限制性內切核酸酶進行分析。含有部分TGEV基因組的2種質粒非常穩定，而含有TGEV完整基因組的質粒在40個世代后呈現一定的不穩定性(此時約80％DNA呈現正確的限制圖譜)。
實施例1構建基于得自TGEV的感染性cDNA克隆的重組載體1.1制備TGEV感染性cDNA為了獲得編碼完整TGEV基因組的cDNA，我們以編碼缺陷型DI-C基因組的cDNA為最初的基礎材料(Méndez等，1996)。該cDNA長度大約為TGEV基因組的三分之一，以低拷貝pACNR1180質粒對其進行克隆(Ruggli等，1996)并測序。借助于互補病毒有效拯救(復制和包裝)編碼缺陷型基因組的cDNA(Méndez等，1996；Izeta等，1999)。
DI-C基因組在ORF 1a、1b以及S基因和7之間分別存在約10、1和8千堿基(kb)的3個(Δ1、Δ2和Δ3)缺失(參見圖1)。
完成編碼感染性TGEV基因組的cDNA序列遵循的策略是逐步摻入DI-C基因組缺失的序列，分析新制備的構建物的細菌毒性。該方面是非常重要的，因為科學文獻充分證明，提供RNA病毒的cDNA的重組質粒一般生長差而且不穩定(Boyer和Haenni，1994；Rice等，1989；Mandl等，1997)。
要完成的第一個缺失是ORF 1b的缺失Δ2(1kb)，獲得穩定的重組質粒。通過克隆cDNA片段A、B、C和D導入缺乏ORF 1a的序列(圖1)(Almazan等，2000)，使得復制酶基因需要的所有信息是完整的。獲得的重組質粒在細菌中是不穩定的，產生在片段B中導入添加和缺失的新質粒(Almazan等，2000)。有趣的是，消除包含核苷酸4,417和9,615之間含有的基因組區段的5,198bp ClaI-ClaI限制性片段(Penzes等，1999)獲得在大腸桿菌DH10B菌株中相對穩定的質粒。然后通過克隆TGEV基因組3’末端的所有結構蛋白和非結構蛋白遺傳信息加入缺失Δ3序列(圖1)。
為了增強TGEV cDNA的穩定性，決定采用pBeloBAC11質粒(Kim等，1992)以BAC亞克隆TGEV cDNA(見圖2)。pBeloBAC11質粒由H.Shizuya和M.Simon(California Institute of Technology)惠贈。該質粒7,507bp大小，包括來自parB、parC、大腸桿菌F因子的復制起點(oriS)和保持每個細胞一個拷貝質粒必需的基因(parA和repE)。該質粒還提供作為選擇標記的氯霉素抗性基因(cat)。在CMV的IE啟動子控制下克隆所述cDNA，因為采用這種啟動子獲得高水平表達(Dubensky等，1996)，而且我們實驗室以前獲得結果表明，大的(9.7kb和15kb)TGEV來源缺陷型基因組表達的RNA在從細胞核內(RNA在細胞核內合成)轉運到細胞質時不會被剪接(Izeta等，1999；Penzes等，1999；Almazan等，2000)。產生的TGEV cDNA(pBAC-TcDNA-ΔClaI)包含復制酶基因信息(缺失的5,198bp ClaI片段除外)和所有的結構蛋白和非結構蛋白基因信息。該cDNA的3’末端側為24nt聚腺苷酸化序列、HDV核酶和BGH轉錄終止序列(Izeta等，1999)。另一方面，制備TGEV完整基因組必需的ClaI片段以BAC克隆，獲得包含4,310和9,758之間的TGEV基因組區的質粒pBAC-B+C+D5’(見圖3)。兩種質粒均在大腸桿菌DH10B菌株中生長而且測定其整個序列。獲得的序列與本文獻結尾提供的TGEV的PUR46-MAD分離株的共有序列(SEQ ID NO1)相同，例外的是在核苷酸6,752(AG，沉默突變)和18,997(TC，沉默突變)位置存在兩個取代，以及分離株C11的D基因取代PUR46-MAD的S基因的變化(這些變化在圖4中標示出)。
此外，為了制備編碼毒性TGEV的cDNA，用TGEV克隆11(此后稱為C11)的S基因完全取代PUR46-MAD分離株的S基因，前者在呼吸道(＜106PFU/mL)和腸道(＜106PFU/mL)二者中的復制滴度均高，后者在呼吸道的復制水平高(＞106PFU/g組織)而在腸道的復制水平低(＜103PFU/mL)(Sabchaz等，1999)。C11的S基因的14個核苷酸不同于PUR46-MAD分離株的S基因，而且在C11的S基因的5’末端插入了6個核苷酸(見圖4)(Sanchaz等，1999)。我們實驗室以前的結果(Sanchaz等，1999)表明，直接重組獲得、C11腸道分離株的S基因取代TGEV的PUR46-MAD分離株S基因的突變體獲得腸道向性而且毒力增強，而不同于在感染豬的腸道復制非常低或者根本沒有的TGEV的天然PUR46-MAD分離株。
通過以pBAC-TcDNA-ΔClaI質粒克隆從pBAC-B+C+D5’質粒獲得的5,198bp ClaI-ClaI片段，由含有腸道分離株C11S基因的TGEVPUR46-MAD分離株構建cDNA，獲得含有編碼完整TGEV基因組的cDNA的pBAC-TcDNAFL質粒(圖3)。
通過在大腸桿菌中生長160代后，分析構建感染性cDNA克隆使用的質粒(pBAC-TcDNA-ΔClaI和pBAC-ClaIF)以及含有完整cDNA的質粒(pBAC-TcDNAFL)在細菌中的穩定性。借助于限制性酶消化純化DNA分析穩定性。沒有檢測到缺失或插入，但是不能排除所使用的分析技術不能檢測出pBAC-TcDN A-ΔClaI質粒和pBAC-B+C+D5’質粒中存在的微小變化。在含有TGEV完整基因組的pBAC-TcDNA質粒的情況下，40代后檢測到一定的不穩定性(此時約80％DNA呈現正確的限制圖譜)。然而，這種略微的不穩定性并不妨礙拯救感染性病毒，因為細菌生長20代(4L培養物)足以產生允許拯救所述病毒的質粒DNA量。
1.2由編碼完整基因組的cDNA拯救感染性TGEV用pBAC-TcDNAFL質粒轉染ST細胞。轉染后48小時，收集培養物上清液，傳代入ST細胞6次(見圖5)。從第二代開始，感染后14小時細胞病變明顯，之后在感染后20小時擴展至幾乎所有形成單層的細胞均呈現細胞病變(見圖6)。另一方面，拯救病毒的滴度隨傳代迅速增高，從第三代起滴度達到約108PFU/mL(見圖7)。重復實驗5次，在所有5次情況都回收到相似滴度的感染性病毒，而在非轉染ST細胞或用相似質粒(ClaI-ClaI片段的存在方向相反)轉染的ST細胞情況下，從未回收到病毒。
為了消除所獲得的病毒為污染產物的可能性，對使用拯救病毒基因組RNA作為模板通過RT-PCR擴增的cDNA片段進行測序，測定位置6,752和18,997的序列。序列分析確定位置6,752和18,997的核苷酸是所述cDNA中存在的核苷酸。而且，在S基因的cDNA序列中，拯救病毒于位置20,990存在限制性位點DraIII，同對C11的S基因的預料相同(圖8)。這3個遺傳標記的存在證實所述分離病毒來自所述cDNA。
在更深入表征所制備的病毒時，通過對用pBAC-TcDNAFL質粒轉染后回收到的病毒(TcDNA)感染細胞或者TGEV的PUR46-MAD分離株感染細胞進行免疫熒光檢測，從而進行比較分析。為此，使用識別C11分離株和PUR46-MAD分離株二者或者只識別后者的特異性多克隆抗體和單克隆抗體(見圖10)。所獲得的結果證實新TcDNA病毒的預期抗原性。TGEV特異性多克隆抗體、預期的S蛋白特異性單克隆抗體(ID.B12和6A.C3)以及M(3B.B3)和N(3B.D8)蛋白特異性單克隆抗體均識別TcDNA和PUR46-MAD二者。所獲得的數據說明，所制備的病毒存在PUR46-MAD分離株的M和N蛋白以及C11分離株的S蛋白，正如用原初cDNA所設計的一樣。
1.3體內感染性和毒力為了分析TcDNA病毒的體內感染性，用從第六代克隆的病毒接種一組新生小豬(5只)，分析其死亡率。接種的5只小豬在接種后3-4天死亡，說明TcDNA病毒是毒性病毒。相反，僅用稀釋的TcDNA病毒接種而且維持在相同條件下的2只小豬沒有任何變化。
1.4通過修飾轉錄調節序列優化表達水平冠形病毒通過RNA依賴性過程合成RNA，其中mRNA從負極性模板轉錄。在TGEV中，出現的保守共有序列CUAAAC恰好位于大多數基因之前。這些序列是亞基因組mRNA轉錄的信號。根據冠形病毒和宿主的類型，冠形病毒中存在6-8種大小不同的mRNA。最大的mRNA對應于基因組RNA，它再用作ORF1a和1b的mRNA。其余mRNA對應于各亞基因組mRNA。這些RNA從大到小命名為mRNA1-7。另一方面，在最初描述的mRNA組之后發現的某些mRNA的命名為相應的mRNA名稱-數字，例如mRNA 2-1。所述各種mRNA相對于基因組RNA結構存在共同末端結構。除了最小的mRNA之外，其余mRNA在結構上為多順反子mRNA，盡管一般來說僅最靠近5’的ORF被翻譯。
采用最小基因間(IG)序列CUAAAC5’末端側不同序列(圖11)、IG序列3’末端側不同序列(圖12)和不同插入位點(圖13)研究了標記基因(GUS)的表達效率。獲得的結果(圖11-13)表明，以下組成的TRS實現最佳表達(i)TGEVN基因共有序列側的-88核苷酸；(ii)IG序列；(iii)S基因的IG序列3’側序列。此外，與有關異源基因插入點獲得的結果一致，當異源基因位于基因組3’末端時表達水平最高。諸如已經介紹的TRS可使GUS的表達水平為2-8μg/106細胞。
1.5表達系統的組織特異性許多病原體通過粘膜進入宿主。為了防止這種感染，重要的是開發可誘導高水平分泌型免疫的表達系統。通過給予呼吸道和腸道相關性淋巴結抗原，基本可達到此目的。為了達到此目的，而且一般來說為了使基因表達控制在目的組織，研究了TGEV向性的分子基礎。這些研究表明，通過構建含有需要向性的冠形病毒S基因的重組病毒，可以改進TGEV組織特異性(Ballesteros等，1997；Sanchez等，1999)。該信息使得可以構建以具有呼吸道或腸道向性的冠形病毒cDNA基因組為基礎的表達系統。
1.6使用感染性cDNA表達PRRSV ORF5編碼的病毒抗原為了優化異源基因表達水平，構建物的組成為可交換模塊式載體，其兩側為促進TRS和載體中的異源基因交換的克隆序列。以下結構獲得最佳表達(約10μg/106細胞)PRRSV(豬呼吸及生殖綜合征病毒)的ORF5，其5’末端側為最小IGS共有序列(CUAAAC)，共有序列之前為病毒核衣殼基因(N)側翼-88個核苷酸；其3’末端側為限制性位點SalI(GTCGAC)和類似于Kozak(AC)GACC的序列。原則上，這樣的異源基因表達水平高于誘導免疫應答需要的水平。異源基因插入先前由病毒非必需基因3a和3b占據的位置。
1.7在豬體內誘導對所述cDNA源性病毒載體表達的抗原的免疫應答使用得自上述cDNA和TRS的相同類型的病毒載體，高水平表達編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因(20μg蛋白/106豬睪丸細胞、ST細胞)。在細胞培養物中表達水平穩定20代以上。此外，經口、鼻內和胃內途徑給予活病毒載體免疫一組豬，檢測到對所述病毒載體和GFP二者的強體液免疫應答。有趣的是，給予3劑所述病毒載體后，沒有在接種的豬觀測到繼發效應。
1.8構建表達外源基因而不產生感染性病毒的安全病毒載體對于人類載體設計，生物安全性是優先考慮的因素。為了達到此目的，需要在載體內工程操作3種類型的安全保證措施。其中2種操作的基礎是缺失病毒復制必需的2種病毒組分，這2種病毒組分作圖在病毒基因組的不同位置。包裝細胞系反式提供這些組分。這種細胞(幼蒼鼠腎臟，BHK)表達缺失的編碼所述病毒必需的結構蛋白(包膜E蛋白和膜M蛋白)的基因。第三種安全保證是使病毒基因組的包裝信號改變位置，這樣防止重組恢復產生感染性病毒，從而產生有效表達異源基因但是甚至不能感染最近的相鄰細胞的自殺載體。
關于設計用于人類的新型載體，我們還不能生產可在人類繁殖的新型病毒，因為這種載體不能在人體內細胞之間傳遞。所述載體基于復制缺陷型病毒。它通過利用互補所述病毒缺失的包裝細胞而僅在疫苗工廠內生長。這些安全保證是工程冠形病毒的新措施。具有新的向性的重組病毒至少可在貓細胞中復制，因為貓細胞可復制人、豬、犬和貓冠形病毒。
微生物保藏攜帶含有本發明感染性克隆的質粒的大腸桿菌鑒定為大腸桿菌pBAC-TcDNAFL，已經于1999年11月24日保藏于西班牙典型保藏物中心(CECT)(Burjassot(Valencia)，其保藏號為CECT5265。
文獻目錄Ahlquist，P.，R.French，M.Janda和L.S.Loesch-Fries.(1984)，源于克隆病毒cDNA的多組分RNA植物病毒的感染，Proc.Natl.Acad. Sci.USA.817066-7070。
Almazan，F.，J.M.Gonzalez，Z.Penzes，A.Izeta，E.Calvo，J.Plana-Duran和L.Enjuanes.(2000)，最大RNA病毒基因組工程為感染性細菌人工染色體，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.975516-5521。
Ballesteros，M.L.，C.M.Sanchez和L.Enjuanes.(1997)，傳染性胃腸炎冠形病毒刺突蛋白N末端兩個氨基酸改變導致腸向性喪失，Virology.227378-388。
Baron，M.D.和T.Barrett.(1997)，從克隆cDNA拯救牛瘟病毒，J.Virol.711265-1271。
Boyer，J.C.，A.L.和Haenni.(1994)，RNA病毒的感染性轉錄物和cDNA克隆，Virology.198415-426。
Chang，R.Y.，M.A.Hofmann，P.B.Sethna和D.A.Brian.(1994)，冠形病毒前導序列在干擾缺損性RNA復制中的順式作用，J.Virol.688223-8231。
Collins，P.L.，M.G.Hill，E.Camargo，H.Grosfeld，R.M.Chanock和B.R.Murphy.(1995)，用克隆dCNA產生感染性人呼吸道合胞病毒證實M2mRNA5’近端可讀框的轉錄延長因子在基因表達中的基本作用而且提供了開發疫苗的可能性，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9211563-11567。
Davis，N.L.，L.V.Willis，J.F.Smith和R.E.Johnston.(1989)，由cDNA克隆體外合成感染性委內瑞拉馬腦炎病毒RNA分析存活缺失突變體，Virology.171189-204。
Dubensky，J.，T.W.，D.A.Driver，J.M.Polo，B.A.Belli，E.M.Latham，C.E.Ibanez，S.Chada，D.Brumm，T.A.Banks，S.J.Mento，D.J.Jolly和S.M.W.Chang.(1996)，新培斯病毒DNA型病毒載體體外和體內基因轉移的應用，J.Virol.70508-519。
Durbin，A.P.，S.L.Hall，J.W.Siew，S.S.whitehead，P.L.Collins和B.R.Murphy.(1997)，用cDNA回收感染性人3型副流感病毒，Virology.235323-332。
Enjuanes，L.，S.G.Siddell和W.J.Spaan.1998.Coronaviruses andArteriviruses.Plenum Press，New York。
Enjuanes，L.和B.A.M.Van der Zeijst.1995，傳染性胃腸炎冠形病毒流行病學的分子基礎，載于Coronaviridae，S.G.Siddell編著，PlenumPress，New York。
Frolov，I.，T.A.Hoffman，B.M.Pragai，S.A.Drvga，H.V.Huang，S.Schlesinger和C.M. Rice.(1996)，甲病毒型表達載體策略與應用，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9311371-11377。
Garcin，D.，T.Pelet，P.Calain，L.Roux，J.Curran和D.Kolakofsky.(1995)，用于由cDNA回收感染性仙臺副粘病毒的高度重組系統新一代重組系統，EMBO J.146087-6094。
Geigenmuller，U.，N.H.Ginzton和S.M.Matsui.(1997)，構建人1血清型星狀病毒的基因組長度cDNA克隆以及合成感染性RNA轉錄物，J.Virol.711713-1717。
Izeta，A.，C.Smerdou，S.Alonso，Z.Penzes，A.Mendez，J.Plana-Durna和L.Enjuanes.(1999)，傳染性胃腸炎冠形病毒來源的合成微小基因組的復制和包裝，J.Virol.731535-1545。
Kim，U.-J.，H.Shizuya，P.de Jong，B.W.Birren和M.I.Simon.(1992)，在F因子型載體中穩定繁殖粘粒大小的人DNA插入物，Nucleic AcidsRes.201083-1085。
Lai，C.-J.，B.Zhao，H.Hori和M.Bray.(1991)，從4型登革病毒穩定克隆的全長cDNA轉錄感染性RNA，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.885139-5143。
Lai，M.M.C.和D.Cavanagh.(1997)，冠形病毒的分子生物學，Adv.VirusRes.481-100。
Lai，M.M.C.，C.-L.Liao，Y.-J.Lin和X.Zhang.(1994)，冠形病毒大RNA病毒基因組如何復制和轉錄，Infect.Agents Dis.398-105。
Liljestrom，P.(1994)，甲病毒表達系統，Curr.Opin.Biotech.5495-500。
Liljestrom，P.和H.Garoff(1991)，基于無名森林病毒復制子的新一代動物細胞表達載體，Bio/Technology.91356-1361。
Luytjes，W.，M.Krystal，M.Enami，J.D.Parvin和P.Palese.(1989)，流感病毒對外源基因的擴增、表達和包裝，Cell.591107-1113。
Mandl，C.W.，M.Ecker，H.Holzmann，C.Kunz，F.X.Heinz.(1997)，蜱傳腦炎病毒歐洲亞型原型株Neudoerfl和高毒力株Hypr的感染性cDNA克隆，J.Gen.Virol.781049-1057。
Maniatis，T.，E.F.Fritsh和J.Sambrook，(1989)，分子克隆實驗室手冊，Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York。
Mendez，A.，C.Smerdou，A.Izeta，F.Gebauer和L.Enjuanes.(1996)，傳染性胃腸炎冠形病毒缺陷干擾基因組的分子特征包裝和異質性，Virology.217495-507。
Penzes，Z.，A.Izeta，C.Smerdou，A.Mendez，M.L.Ballesteros和L.Enjuanes.(1999)，傳染性胃腸炎冠形病毒株PUR46-MAD的完整核苷酸序列，提交出版中。
Pushko，P.，M.Parker，G.V.Ludwing，N.L.Davis，R.E.Johnston和J.F.Smith.(1997)，減毒委內瑞拉馬腦炎病毒的復制輔助系統異源基因的體外表達和體內抗異源病原體的免疫，Virology，239389-410。
Racaniello，V.R.和D.Baltimore.(1981)，克隆的脊髓灰質炎病毒cDNA在哺乳動物細胞中是感染性的，Science.214916-919。
Radecke，F.，P.Spielhofer，H.Schneider，K.Kaelin，M.Huber，C.Dotsch，G.Christiansen和M.A.Billeter.(1995)，用克隆DNA拯救麻疹病毒，EMBO J.145773-5784。
Rice，C.M.，A.Grakoui，R.Galler和T.J.Chambers.(1989)，用體外連接制備的全長cDNA模板轉錄感染性黃熱RNA，New Biologist.1285-296。
Rice，C.M.，R.Levis，J.H.Strauss和H.V.Huang.(1987)，應用新培斯病毒cDNA克隆產生感染性RNA轉錄物作圖致死突變、拯救溫度敏感型標記和體外誘變產生限定突變體，J.Virol.613809-3819。Rice，C.M.和J.H.Strauss.(1981)，合成、切割和序列分析與新培斯病毒26S信使RNA互補的DNA，J.Mol.Biol.150315-340。
Ruggli，N.，J.D.Tratschin，C.Mittelholzer，M.A.Hofmann.(1996)，典型豬熱病毒株Alfort/187的核苷酸序列以及由穩定克隆的全長cDNA轉錄感染性RNA，J.Virol.703479-3487。
Sanchez，C.M.，G.Jimenez，M.D.Laviada，I.Correa，C.Sune，M.J.Bullido，F.Gebauer，C.Smerdou，P.Callebaut，J.M.Escribano和L.Enjuanes.(1990)，與傳染性胃腸炎病毒有關的冠形病毒之間的抗原同源性，Virology.174410-417。
Sanchez，C.M.，F.Gebauer，C.Suen，A.Mendez，J.Dopazo和L.Enjuanes(1992)，傳染性胃腸炎冠形病毒的遺傳進化和向性，Virology.19092-105。
Sanchez，C.M.，A.Izeta，J.M.Sanchez-Morgado，S.Alonso，I.Sola，M.Balasch，J.Plana-Duran和L.Enjuanes.(1999)，定向重組證實傳染性胃腸炎冠形病毒的刺突基因是其腸向性和毒力的決定因素，J.Virol.737607-7618。
Sawicki，S.G.和D.L.Sawicki.(1990)，冠形病毒轉錄亞基因組小鼠肝炎病毒復制中間體在RNA合成中的作用，J.Virol.641050-1056。Schnell，M.J.，T.Mebatsion和K.-K.Conzelmann.(1994)，得自克隆cDNA的感染性狂犬病毒，EMBO J.134195-4203。
Sethna，P.B.，S.-L.Hung和D.A.Brian.(1989)，冠形病毒亞基因組負鏈RNA和mRNA復制子的潛在作用，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.865626-5630。
Shizuya，H.，B.Birren，U.-J.Kim，V.Mancino，T.Slepak，Y.Tachiiri和M.Simon.(1992)，使用F因子型載體在大腸桿菌中克隆和穩定維持300kbp人DNA片段，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.898794-8797。
Siddell，S.G.1995，The Coronaviridae.Plenum Press，New York，第418頁。
Smerdou，C.和P.Liljestrom.(1999)，用于基因轉移的非病毒擴增系統基于甲病毒的載體，Curr.Opin.Mol.Therap.1244-251。
Taniguchi，M.和F.A.P.Miller.(1978)，用富集抑制T細胞和AT淋巴瘤細胞系融合物獲得的雜交瘤產生特異性抑制因子，J.Exp.Med.148373-382。
van der Most，R.G.和W.J.M.Spaan.1995，冠形病毒復制、轉錄和RNA重組，載于The Coronaviridae.S.G.Siddell編著，Plenum Press，NewYork.11-31。
Wang，K.，C.Boysen，H.Shizuya，M.I.Simon和L.Hood.(1997)，兩代細菌人工染色體克隆載體的完整核苷酸序列，BioTechniques.23992-994。
Woo，S.-S.，J.Jiang，B.S.Gill，A.H.Paterson和R.A.Wing.(1994)，構建和表征Sorghum bicolor的細菌人工染色體文庫，Nucleic Acids Res224922-4931。
Zhang，X.，C.L.Liao和M.M.C.Lai.(1994)，冠形病毒前導RNA反式和順式調節和起始亞基因組mRNA轉錄，J.Virol.684738-4746。
序列表<110>康斯喬最高科學研究公司(Consejo Superior de Investigaciones Cientificas)<120>
<130>
<150>ES 9902673<151>1999-12-03<160>5<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>28588<212>DNA<213>豬傳染性胃腸炎病毒(Porcine Transmissable Gastroentertitis V)<400>1acttttaaag taaagtgagt gtagcgtggc tatatctctt cttttacttt aactagcctt 60gtgctagatt ttgtcttcgg acaccaactc gaactaaacg aaatatttgt ctttctatga 120aatcatagag gacaagcgtt gattatttcc attcagtttg gcaatcactc cttggaacgg 180ggttgagcga acggtgcagt agggttccgt ccctatttcg taagtcgcct agtagtagcg 240agtgcggttc cgcccgtaca acgttgggta gaccgggttc cgtcctgtga tctccctcgc 300cggccgccag gagaatgagt tccaaacaat tcaagatcct tgttaatgag gactatcaag 360tcaacgtgcc tagtcttcct attcgtgacg tgttacagga aattaagtac tgctaccgta 420atggatttga gggctatgtt ttcgtaccag aatactgtcg tgacctagtt gattgcgatc 480gtaaggatca ctacgtcatt ggtgttcttg gtaacggagt aagtgatctt aaacctgttc 540ttcttaccga accctccgtc atgttgcaag gctttattgt tagagctaac tgcaatggcg 600ttcttgagga ctttgacctt aaaattgctc gcactggcag aggtgccata tatgttgatc 660aatacatgtg tggtgctgat ggaaaaccag tcattgaagg cgattttaag gactacttcg 720gtgatgaaga catcattgaa tttgaaggag aggagtacca ttgcgcttgg acaactgtgc 780gcgatgagaa accgctgaat cagcaaactc tctttaccat tcaggaaatc caatacaatc 840tggacattcc tcataaattg ccaaactgtg ctactagaca tgtagcacca ccagtcaaaa 900agaactctaa aatagttctg tctgaagatt acaagaagct ttatgatatc ttcggatcac 960cctttatggg aaatggtgac tgtcttagca aatgctttga cactcttcat tttatcgctg 1020ctactcttag atgcccgtgt ggttctgaaa gtagcggcgt tggagattgg actggtttta 1080agactgcctg ttgtggtctt tctggcaaag ttaagggtgt cactttgggt gatattaagc 1140ctggtgatgc tgttgtcact agtatgagcg caggtaaggg agttaagttc tttgccaatt 1200gtgttcttca atatgctggt gatgttgaag gtgtctccat ctggaaagtt attaaaactt 1260ttacagttga tgagactgta tgcacccctg gttttgaagg cgaattgaac gacttcatca 1320aacctgagag caaatcacta gttgcatgca gcgttaaaag agcattcatt actggtgata 1380ttgatgatgc tgtacatgat tgtatcatta caggaaaatt ggatcttagt accaaccttt 1440ttggtaatgt tggtctatta ttcaagaaga ctccatggtt tgtacaaaag tgtggtgcac 1500tttttgtaga cgcttggaaa gtagtagagg agctttgtgg ttcactcaca cttacataca 1560agcaaattta tgaagttgta gcatcacttt gcacttctgc ttttacgatt gtaaactaca 1620agccaacatt tgtggttcca gacaatcgtg ttaaagatct tgtagacaag tgtgtgaaag 1680ttcttgtaaa agcatttgat gtttttacgc agattatcac aatagctggt attgaggcca 1740aatgctttgt gcttggtgct aaatacctgt tgttcaataa tgcacttgtc aaacttgtca 1800
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<400>5gctagcccag gcgcgcggta cc 2權利要求
1.一種制備DNA的多步驟方法，其中將一種下列DNA克隆入細菌人工染色體(BAC)中(a)包含全長拷貝RNA病毒基因組RNA(gRNA)的DNA；或者(b)包含RNA病毒的一個或多個gRNA片段的DNA，所述片段編碼RNA依賴性RNA聚合酶和至少一種結構蛋白或非結構蛋白；或者(c)與(a)或(b)序列的同源性至少為60％的DNA。
2.權利要求1的方法，其中克隆入BAC的DNA還包含編碼除了一種病毒結構蛋白或病毒非結構蛋白以外的若干或所有蛋白的序列。
3.權利要求1或2的方法，其中克隆入BAC的DNA還包含編碼一種或若干種異源基因的序列。
4.權利要求3的方法，其中所述異源基因編碼至少一種適合誘導抗感染因子的免疫應答的抗原、至少一種干擾感染因子復制的分子、抗感染因子的保護抗體、免疫調節蛋白、細胞因子、免疫增強劑或抗炎化合物。
5.權利要求1-4任一項的方法，其中克隆入BAC的DNA大小至少為5Kb。
6.權利要求1-5任一項的方法，其中克隆入BAC的DNA大小至少為15Kb。
7.權利要求1-6任一項的方法，其中克隆入BAC的DNA大小至少為25Kb。
8.權利要求1-7任一項的方法，其中所述BAC包含控制克隆入BAC的DNA轉錄的序列。
9.權利要求1-8任一項的方法，其中一種所述病毒基因通過取代、缺失或加入核苷酸進行了修飾。
10.權利要求9的方法，其中所述病毒向性控制基因已經進行了修飾。
11.權利要求1-10任一項的方法，其中所述病毒向性控制基因已經被另一種病毒的相應基因取代。
12.權利要求1-11任一項的方法，其中克隆入BAC的DNA能夠轉錄為可裝配成病毒體的RNA。
13.權利要求12的方法，其中所述病毒體是感染性、減毒、復制缺陷型或滅活病毒。
14.權利要求1-13任一項的方法，其中所述病毒天然存在正鏈基因組。
15.權利要求1-14任一項的方法，其中所述病毒為微小RNA病毒、黃病毒、披膜病毒、冠形病毒、torovims、arterivurs、calcivirus、彈狀病毒、副粘病毒、線狀病毒、博爾納病毒(bomavims)、正粘病毒、布尼病毒、沙粒病毒或呼腸孤病毒。
16.一種制備病毒RNA的多步驟方法，其中按照權利要求1-15任一項制備DNA，使制得的DNA在合適宿主細胞中表達或者使所述DNA與化學物質、生物試劑和/或細胞提取物在允許所述DNA轉錄的條件下混合，最后分離出所述病毒RNA。
17.一種制備病毒體的多步驟方法，其中按照權利要求1-15任一項制備DNA，使制得的DNA在合適宿主細胞中表達或者使所述DNA與化學物質、生物試劑和/或細胞提取物在允許所述DNA轉錄和翻譯的條件下混合，最后分離出所述病毒體。
18.權利要求17的方法，其中所述病毒體隨后被滅活或殺死。
19.一種制備藥用組合物的多步驟方法，其中按照權利要求1-15任一項制備DNA、按照權利要求16制備病毒RNA或者按照權利要求17或18制備病毒體，然后使其與藥學上可接受的佐劑或載體混合。
20.權利要求19的方法，其中所述藥物為保護人類或動物抗感染性疾病的疫苗。
21.權利要求19的方法，其中所述藥物用于人類或動物的基因治療。
22.一種包含得自冠形病毒基因組RNA(gRNA)的序列的DNA，所述序列與所述冠形病毒天然序列的同源性至少為60％，而且編碼RNA依賴性RNA聚合酶和至少一種結構蛋白或非結構蛋白，其中所述DNA的一個片段能夠轉錄為可裝配為病毒體的RNA。
23.權利要求22的DNA，它還包含編碼異源基因的序列。
24.權利要求23的DNA，其中所述異源基因編碼至少一種適合誘導抗感染性因子免疫應答的抗原、至少一種干擾感染性因子復制的分子、抗感染性因子的保護抗體、免疫調節蛋白、細胞因子、免疫增強劑或抗炎化合物。
25.權利要求22或24的DNA，其中所述片段的大小至少為25Kb
26.權利要求22-25任一項的DNA，它還包含來源于冠形病毒、編碼除了一種病毒結構蛋白或一種病毒非結構蛋白以外的若干或所有蛋白的序列。
27.權利要求22-26任一項的DNA，它還包含來源于冠形病毒、編碼冠形病毒所有結構蛋白或非結構蛋白的序列。
28.權利要求22-27任一項的DNA，它還包含控制所述病毒gRNA轉錄的序列。
29.權利要求22-28任一項的DNA，其中所述控制病毒gRNA轉錄的序列是巨細胞病毒(CMV)的立即早期(IE)啟動子。
30.權利要求22-29任一項的DNA，其中所述序列的3’末端側為聚腺苷酸尾、丁型肝炎病毒(HDV)核酶以及牛生長激素(BGH)的終止序列和聚腺苷酸化序列。
31.權利要求22-30任一項的DNA，其中所述病毒序列得自以下病毒分離株豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、牛冠形病毒(BoCV)、犬冠形病毒(CCoV)、貓病毒(FCoV)、人冠形病毒(HCoV)、toroviruses或arterivurses。
32.權利要求22-31任一項的DNA，其中所述病毒體是感染性病毒、非感染性病毒或復制缺陷型病毒。
33.權利要求22-32任一項的DNA，其中來源于冠形病毒的結構或非結構基因序列已經通過對天然基因序列取代、缺失或添加一個或多個核苷酸進行了修飾。
34.權利要求22-33任一項的DNA，其中所述S、N或M基因序列已經進行了修飾。
35.權利要求22-34任一項的DNA，其中已經修飾了冠形病毒來源的S基因序列，從而獲得減毒病毒體。
36.權利要求22-35任一項的DNA，其中已經修飾了冠形病毒來源的S基因序列，從而獲得向性不同于所述冠形病毒的病毒體。
37.一種載體，它包含權利要求22-36任一項的核酸。
38.權利要求37的載體，其中所述載體是質粒或細菌人工染色體(BAC)。
39.一種宿主細胞，它包含權利要求22-38任一項的核酸。
40.一種大腸桿菌菌株，它保藏于西班牙典型培養物保藏中心，保藏號為CECT 5265。
41.一種制備重組病毒體或重組病毒RNA的多步驟方法，其中將權利要求22-38任一項的DNA導入宿主細胞中，在允許表達所述DNA的條件下培養包含所述DNA的宿主細胞，最后回收所述重組病毒體或重組病毒RNA。
42.一種制備重組病毒體或重組病毒RNA的方法，其中使權利要求22-38任一項的DNA與化學物質、生物試劑和/或細胞提取物在允許所述DNA轉錄的條件下混合，最后回收所述重組病毒體或重組病毒RNA。
43.權利要求41或42的方法，其中所述DNA是權利要求23-38任一項的DNA。
44.一種病毒體，它是應用權利要求41-43任一項的方法獲得的病毒體。
45.權利要求44的病毒體，其中所述病毒體是感染性、減毒、復制缺陷型或滅活病毒。
46.權利要求44或45的病毒體，其中所述病毒體包含修飾的S、M或N基因。
47.權利要求46的病毒體，其中對所述S基因修飾獲得減毒病毒。
48.權利要求46的病毒體，其中對所述S基因修飾獲得向性不同的病毒體。
49.一種病毒RNA，它是應用權利要求41-43的方法獲得的病毒RNA。
50.一種藥用制劑，它包含權利要求22-38任一項的核酸、權利要求39或40的宿主細胞、權利要求41-48任一項的病毒體或權利要求49的病毒RNA。
51.一種能夠保護動物或人類抗感染性因子引起的疾病的疫苗，該疫苗包含權利要求22-38任一項的核酸、權利要求39或40的宿主細胞、權利要求41-48任一項的病毒體或權利要求49的病毒RNA。
52.權利要求51的疫苗，其中所述核酸包含編碼至少一種適合誘導抗所述感染性因子的免疫應答的抗原的序列、編碼至少一種干擾所述感染性因子復制的基因的序列或者編碼抗所述感染性因子的保護抗體的序列。
53.權利要求51或52的疫苗，其中所述病毒體載體表達至少一種復制干擾分子、能夠誘導抗在呼吸道粘膜或腸道粘膜或其它組織中繁殖的不同感染性因子的系統免疫應答和/或粘膜免疫應答的抗原。
54.一種能夠保護動物或人類抗一種以上感染性因子引起的感染的多價疫苗，它包含一種以上權利要求22-38任一項的核酸、權利要求39或40的宿主細胞、權利要求41-48任一項的病毒體或者權利要求49的病毒RNA，其中每一種表達一種適合誘導抗各所述感染性因子的免疫應答的抗原、一種干擾分子或一種抗各所述感染性因子的保護抗體。
55.權利要求51-54任一項的疫苗，它還包含藥學上可接受的載體或稀釋劑。
56.一種制備權利要求22-38任一項的DNA的多步驟方法，其中在表達啟動子下將來源于冠形病毒的干擾缺陷型基因組克隆入BAC載體，然后再在所述缺陷型基因組中插入缺失的序列。
57.權利要求56制備DNA的方法，其中在重新插入所述DNA之前鑒定所述病毒基因組中的毒性序列。
58.權利要求56或57制備DNA的方法，其中所述病毒基因組中的毒性序列是完成所述基因組時重新插入的最后序列。
59.一種得自冠形病毒的感染性克隆，它包含在轉錄調節序列下克隆的冠形病毒基因組RNA(gRNA)的全長拷貝互補DNA(cDNA)。
60.權利要求59的感染性克隆，其中所述冠形病毒為豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)的分離株。
61.權利要求59或60的感染性克隆，其中所述啟動子是巨細胞病毒(CMV)的立即早期(IE)表達啟動子。
62.權利要求59-61任一項的感染性克隆，其中所述全長cDNA的3’末端側為聚腺苷酸尾、丁型肝炎病毒(HDV)核酶以及牛生長激素(BGH)的終止序列和聚腺苷酸化序列。
63.權利要求59-62任一項的感染性克隆，其中用細菌人工染色體(BAC)克隆所述感染性cDNA。
64.一種獲得權利要求59-63任一項的感染性克隆的方法，該方法包括用冠形病毒gRNA構建全長cDNA以及裝配轉錄調節元件。
65.權利要求64的方法，其中構建冠形病毒gRNA的全長cDNA包括(i)用BAC在表達啟動子下克隆得自所述冠形病毒的干擾缺陷型基因組；(ii)完成缺失所述干擾缺陷型基因組，重建相對于所述感染性gRNA的缺失序列；(iii)鑒定對在其中進行克隆的細菌具有毒性的序列，取出毒性序列，恰好轉染真核細胞之前插入所述毒性序列以獲得相當于冠形病毒gRNA的cDNA克隆。
66.一種重組病毒載體，它包含權利要求59-63任一項的感染性克隆或者按照權利要求58或59任一項的方法獲得的感染性克隆，所述感染性克隆經修飾含有一種異源核酸，所述異源核酸在允許其表達的條件下插入所述感染性克隆。
67.權利要求60的載體，其中在編碼目的基因產物的基因和基因片段之間選擇所述異源核酸。
68.一種制備目的產物的方法，該方法包括在允許所述異源核酸表達和目的產物回收的條件下培養包含權利要求60或61任一項的病毒載體的宿主細胞。
69.一種制備修飾重組冠形病毒的方法，所述修飾重組冠形病毒在相當于冠形病毒基因組的cDNA序列中包含異源核酸，所述方法包括將權利要求60或61任一項的病毒載體導入宿主細胞中，在允許所述病毒載體表達和復制以及允許由所述修飾重組冠形病毒獲得的病毒體回收的條件下培養包含所述病毒載體的所述宿主細胞。
70.一種能夠保護動物抗感染性因子引起的感染的疫苗，它包含(i)至少一種權利要求60或61的病毒載體，該病毒載體表達至少一種適合誘導抗所述感染性因子的免疫應答的抗原、或者表達一種抗所述感染性因子的保護抗體，以及任選包含(ii)藥學上可接受的賦形劑。
71.權利要求64的疫苗，其中所述病毒載體表達至少一種能夠誘導抗不同感染性因子的系統免疫應答和/或粘膜免疫應答的抗原，所述感染性因子在呼吸道粘膜或腸道粘膜中繁殖。
72.一種能夠保護動物抗一種以上感染性因子引起的感染的多價疫苗，它包括(i)權利要求60或61的病毒載體，該病毒載體表達適合誘導抗所述感染因子的免疫應答的抗原、或抗所述感染性因子的保護抗體，以及任選包含(ii)藥學上可接受的賦形劑。
73.一種能夠保護動物抗一種以上感染性因子引起的感染的多價疫苗，它包含(i)一種以上權利要求60或61的病毒載體，其中每種病毒載體表達適合誘導抗各所述感染性因子的免疫應答的抗原或者抗各所述感染性因子的保護抗體，以及任選包含(ii)藥學上可接受的賦形劑。
74.一種制備重組冠形病毒的方法，該方法包括將權利要求59-63任一項的感染性克隆或者按照權利要求64或65任一項方法獲得的感染性克隆導入宿主細胞中，在允許所述感染性克隆表達和復制的條件下培養包含所述感染性克隆的所述宿主細胞，最后回收由包含所述冠形病毒完整基因組的重組冠形病毒獲得的病毒體。
全文摘要
本發明涉及多步驟制備DNA的方法，該方法包括將一種下列DNA克隆入細菌人工染色體(BAC)(a)包含基因組RNA(gRNA)或RNA病毒的全長拷貝的DNA；或者(b)包含RNA病毒的一個或若干個gRNA片段的DNA，所述gRNA片段編碼RNA依賴性RNA聚合酶和至少一種結構蛋白或非結構蛋白；或者(c)與(a)或(b)的序列具有至少60％同源性的DNA。此外，本發明還提供包含冠形病毒基因組RNA(gRNA)來源的序列的DNA，所述序列與冠形病毒天然序列的同源性至少為60％，而且編碼RNA依賴性RNA聚合酶和至少一個結構蛋白或非結構蛋白，其中所述DNA的一個片段能夠轉錄為可裝配為病毒體的RNA。本發明進一步公開了應用所述核酸制備病毒RNA或病毒體以及包含所述DNA、病毒RNA或病毒體的藥用制劑。
文檔編號C12N15/50GK1872994SQ20061007334
公開日2006年12月6日 申請日期2000年11月30日 優先權日1999年12月3日
發明者L·恩朱爾尼斯桑切斯 申請人:康斯喬最高科學研究公司