專利名稱：5′呈味核苷酸的生物合成方法
技術領域：
本發明涉及5′呈味核苷酸的制備方法，特別是涉及一種生物合成5′呈味核苷酸的方法。
背景技術：
上個世紀50年代，研究人員發現5’-肌苷酸(5’-IMP)和5’-鳥苷酸(5’-GMP)與谷氨酸鈉(MSG)混合時產生協同效應(又稱相乘作用)，可使食品鮮度提高數倍至數十倍。因此，以5’-肌苷酸和5’-鳥苷酸為代表的呈味核苷酸的應用引起了國內外的廣泛關注。如今，呈味核苷酸作為一種新型的添加劑，已廣泛應用于醫療衛生、營養、食品和醫藥等領域。
自上世紀60年代日本率先進行呈味核苷酸的工業化生產以來，已有多種生產呈味核苷酸及其衍生物的方法。按生產工藝進行歸納，主要有三種化學合成法、RNA酶解法及微生物發酵法。這三種方法的生產工藝及其產品均有很大差別。
化學合成法主要是利用核苷進行磷酸酯化反應。常用的磷酸化試劑主要是磷酸或焦磷酸的活性衍生物。焦磷酸的活性衍生物可為焦磷酰氯或雙-對-硝基苯焦磷酸等，而工業上廣泛采用的是三氯氧化磷。要在核苷的5’位上導入磷酸基，需在磷酸化反應前，保護核苷上核糖的2’和3’位的羥基。磷酸化完成后，再脫去保護劑，得到5’-核苷酸。
由于化學合成法所用試劑較昂貴，致使生產成本偏高，且具有一定毒性，一般用于生產一些有特殊用途的核苷酸及其衍生物。
酶解法生產5’-核苷酸的歷史最長、技術也最成熟。利用桔青霉發酵，得到5’-磷酸二酯酶與從酵母中提取的RNA進行反應，可生成四種5’-核苷酸的混合物，將混合物經離子交換樹脂分離純化，即可得到四種核苷酸的純品。
通常采用固體發酵或深層發酵法制備5’-磷酸二酯酶。前者簡便、成本低，但占地面積大，生產效率低，且產生的分生孢子易污染環境，后者成本偏高。利用5’-磷酸二酯酶酶解RNA后，需要將四種核苷酸混合物進行分離純化，才能得到5’-肌苷酸的純品。但要獲得5’-IMP，則是將5’-AMP進行化學或酶轉化，生產工藝復雜，成本偏高。
早期用酶法得到的與呈味無關的5’-CMP(5’-胞苷酸)、5’-UMP(5’-尿苷酸)，在當時無法利用，使得成本更高，因此，在谷氨酸發酵研究成功的基礎上，日本開始了核酸類物質的發酵研究。
微生物發酵法又分一步法和二步法。一步法主要用于5’-肌苷酸和5’-黃苷酸的生產。二步法即直接由碳源發酵生產或先發酵生成核苷，再經化學磷酸化，獲得了相應的核苷酸。
1961年，日本科學家利用枯草芽孢桿菌(Bacillus subitilis)的腺嘌呤缺陷型生成了5’-肌苷酸、肌苷。隨后又報道了高產肌苷的枯草芽孢桿菌腺嘌呤缺陷型菌株，并建立了肌苷的工業化生產(Konjo K，Imai K，et al.Annual Congress Agr.Chem.Soc.1963 Abstracts，P.40)。1968年，在深入研究腺嘌呤缺陷型的產氨短桿菌(B.Ammoniagenes)時，在培養基中加入錳離子，以觀察對其生長的影響，結果篩選到了對錳離子不敏感的菌株，能夠高產肌苷酸。上述研究結果表明，一步法生產菌株的選育比較復雜，產生的肌苷酸易于分解，而且解決或解除終產物反饋調節問題也比較復雜，這都極大地限制了一步法生產肌苷酸的工業應用；而二步法得到的中間產物，如肌苷、鳥苷等本身也是很重要的發酵產品，其調控相對容易，因此二步法生產工藝的關鍵問題在于中間產物發酵后，如何高效地轉化成目標核苷酸。
1999年日本Asano等發現，Morganella morganii等許多腸桿菌的酸性磷酸酶具有選擇性磷酸酶轉移酶活性。該磷酸酶可利用焦磷酸和核苷酸為底物，特異性催化5’肌苷酸的生成，從而為酶法進行核苷的5’磷酸化提供了新方法。而且，在核苷磷酸化方面，由于酶催化具有反應條件溫和、低成本、低毒性和特異性高等優點，展現了較大的發展潛力。然而迄今為止，有關酸性磷酸酶轉移酶活性的酶學動力學、細胞催化、融合蛋白催化及酶相關催化過程的參數還沒有被系統報道過。
通過以上分析可見，上述合成5’呈味核苷酸的方法各有不足，開發生產呈味劑的新方法是核苷酸發酵工業發展的重要方向之一。目前，我國發酵法生產肌苷和鳥苷已經實現工業化，以此為基礎進一步開發生產5’-肌苷酸技術的關鍵是如何實現肌苷和鳥苷的特異性磷酸化。酶法轉化因其具有簡便高效和選擇性強等優點，具有很大的發展潛力，而開發具有特異性催化合成5’呈味核苷酸潛力的菌株和工藝，是解決問題的關鍵。

發明內容
本發明的目的是提供一種產量較高、成本低廉的生物合成5′呈味核苷酸的方法。
為實現上述目的，本發明采取以下技術方案一種生物合成5′呈味核苷酸的方法，是將含有酸性磷酸酶基因的產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌體作為催化劑添加到含底物焦磷酸和肌苷(Inosine)或鳥苷(Guanosine)的反應溶液中，在25-35℃，pH 4.0-8.4下反應，得到5’-肌苷酸(5’-IMP)或5’-鳥苷酸(5’-GMP)。
在上述5′呈味核苷酸的合成方法中，反應條件優選為30℃，pH 4.6。
為獲得更高的合成效率，可將含有酸性磷酸酶基因的產氣腸桿菌菌體細胞破碎后，用破碎細胞液進行上述催化反應，此時的反應條件優選為30℃，pH 7.6。
可用常規方法對產氣腸桿菌菌體細胞進行破碎處理，如超聲、化學破碎法或酶學破碎法等。所述破碎菌體的方法可為將菌體置于pH 7.2-8.4，0.1mM的Tris·HCl緩沖液中，在0℃冰水浴中超聲50-150次，每次超聲時間為2-4sec，間隔時間為2-4sec。
上述反應液中肌苷的濃度為5-40mg/mL，優選為10mg/mL；鳥苷的濃度為5-40mg/mL，優選為10mg/mL；焦磷酸的濃度為200-300mg/mL，優選為250mg/mL；產氣腸桿菌菌體細胞的濃度為10-80mg/mL，優選為20mg/mL。
此外，為提高酶促反應效率，在上述反應液中還可添加濃度為0.1-0.4mg/mL的硫酸鎂，以提供Mg2+。
所述含有酸性磷酸酶基因的產氣腸桿菌可按照常規培養方法獲得，如將產氣腸桿菌接種于LB液體培養基中，在30-37℃，100-250rpm下培養。
本發明提供了一種生物合成呈味核苷酸(5′-IMP和5′-GMP)的方法。該方法是以焦磷酸和肌苷(或鳥苷)為底物，利用產氣腸桿菌所具有的酸性磷酸酶活性將肌苷(或鳥苷)特異性催化生成5′-IMP(或5′-GMP)，反應原理見圖1。本發明具有以下優點1)選用的菌株具有酸性磷酸酶活性高，生長速度快和環境適應性強的優點，在好氧及厭氧條件下均可生長，適于工業化生產；2)合成方法簡單，目的產物的產量高，5′-肌苷酸的濃度可達6.21mg/mL、5′鳥苷酸的濃度可達6.0mg/mL；3)原料來源廣泛，對設備要求低，生產成本低廉。
本發明將在5′呈味核苷酸的工業化生產中發揮重要作用，應用前景廣闊。
下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。


圖1為本發明5’-肌苷酸合成方法的原理圖。
圖2為pH值對產氣腸桿菌整細胞催化合成5′-肌苷酸影響的檢測結果。
圖3為最適pH值產氣腸桿菌整細胞催化合成5′-肌苷酸隨時間變化關系的檢測結果。
圖4為產氣腸桿菌整細胞催化合成5′-肌苷酸時底物肌苷的轉化率與目標產物5′-肌苷酸的轉化率隨時間變化關系的檢測結果。
圖5為用產氣腸桿菌細胞破碎液進行催化5′-肌苷酸的生物合成時不同pH酶活力影響的檢測結果。
圖6為最適pH值時產氣腸桿菌細胞破碎液催化合成5′-肌苷酸隨時間變化關系的檢測結果。
圖7為產氣腸桿菌細胞破碎液催化合成5′-肌苷酸時底物肌苷的轉化率與目標產物5′-肌苷酸的轉化率隨時間變化關系的檢測結果。
圖8為產氣腸桿菌內酸性磷酸轉移酶的存在方式檢測結果。
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
實施例1、用產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)整細胞催化5′-肌苷酸的生物合成及不同pH對整細胞催化合成5′-肌苷酸的影響1、產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌體的獲得挑取產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)(購自日本東京大學應用微生物研究所(IAM)菌種庫)的單菌落，將其接種于50mL盛有20mL LB液體培養基的小三角瓶中，在37℃、100rpm搖床培養12小時(過夜)作為種子液；再取1.5mL種子液，將其接種到盛有150mL LB液體培養基的250mL三角瓶中，在37℃、180rpm下培養至OD600值為1.8時，12000rpm離心8min，棄上清，得到產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenesIAM1183)菌體細胞。
2、產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)整細胞催化5′-肌苷酸的生物合成時不同pH對整細胞催化合成5′-肌苷酸的影響向含10mg/mL肌苷，250mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.2mg/mL MgSO4·7H2O的溶液反應體系中添加步驟1獲得的0.4g產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌體細胞(相當20mg/mL)，然后在30℃及不同pH(4.0-5.6)下反應16h后，離心取上清，稀釋一倍，用高壓液相色譜法對合成的5′-肌苷酸進行定性、定量測定，以檢測不同pH對產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)整細胞催化合成5′-肌苷酸的影響。檢測結果如圖2所示(縱坐標為5′-肌苷酸的濃度(mg/mL)，橫坐標為pH值)，pH值為4.0-5.6時均能生成5′-肌苷酸，且在pH值約為4.8時，5′-肌苷酸的合成速率最快。
實施例2、用產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)整細胞催化5′-肌苷酸的生物合成時5′-肌苷酸隨時間的變化關系用與實施例1相同的方法得到產氣腸桿菌菌體細胞，然后向含10mg/mL肌苷，250mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.2mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加實施例1步驟一獲得的0.4g產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌體細胞(相當20mg/mL)，然后在28℃、pH4.8下進行催化反應，每隔2小時取樣，離心取上清，用高壓液相色譜法對合成的5′-肌苷酸進行定性、定量測定，以檢測產氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes IAM1183)整細胞催化合成5′-肌苷酸隨時間的變化關系。檢測結果如圖3所示(縱坐標為5′-肌苷酸的濃度(mg/mL)，橫坐標為反應時間)，隨著反應時間的延長，5′-肌苷酸的濃度近似呈線性增加，表明反應速度并無明顯下降，即底物濃度相對過量，反應速度仍保持最大速度，產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenesIAM1183)的磷酸轉移酶仍具有較高活力，酶活穩定。
實施例3、用產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)整細胞進行5′肌苷酸的生物合成及底物轉化率與目標產物轉化率隨時間的變化關系用與實施例1相同的方法得到產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌體細胞，然后向含8mg/mL肌苷，300mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.4mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加實施例1步驟一獲得的0.4g產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenesIAM1183)細胞(相當20mg/mL)，然后在30℃、pH4.8下進行催化反應，每隔2小時取樣，離心取上清，用高壓液相色譜法對合成的5′-肌苷酸及底物濃度進行定性、定量測定。以檢測底物肌苷的轉化率與目標產物5′-肌苷酸的轉化率隨時間的變化關系。檢測結果如圖4所示(縱坐標為轉化率(％)，橫坐標為反應時間)，肌苷轉化率隨時間的變化關系較為平緩，隨反應時間的變化不大，表明肌苷對于細胞膜的滲透性較強，能夠較容易地進入細胞；而5′-肌苷酸的生成隨時間變化較為明顯，且近似線性，這與5′-肌苷酸的滲透性較差有關，合成的5′-肌苷酸需逐步釋放到胞外。
實施例4、檢測用產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)細胞破碎液催化5′-肌苷酸的生物合成時不同pH對游離磷酸轉移酶活力的影響用與實施例1相同的方法得到產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌體，然后用超聲法破碎菌體細胞，方法為將菌體置于pH 7.6，0.1mM的Tris·HCl緩沖液中，在0℃冰水浴中超聲99次，每次超聲時間為3sec，間隔時間為3sec。再向含10mg/mL肌苷，250mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.2mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加20mg/mL產氣腸桿菌(Enterobacter aerrogenes IAM1183)菌體破碎液，然后在30℃及不同pH(5.2-8.4)下反應10min后，用0.15mL濃鹽酸終止反應。用高壓液相色譜法對合成的5′-肌苷酸進行定性、定量測定。酶活性檢測結果如圖5所示(縱坐標為游離的磷酸轉移酶活力(U)，MES表示醋酸鈉緩沖溶液pH5.2-6.8，Tris·HCl表示pH7.2-8.4橫坐標為pH值)，在pH為7.6時，游離的磷酸轉移酶活力最高，且具有最大的催化反應速度，為最佳反應的pH值，同時也說明pH值對游離磷酸轉移酶的活力影響比用產氣腸桿菌整細胞進行催化合成時更為明顯。
實施例5、在最佳pH 7.6下用產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)破碎細胞液催化生物合成5′-肌苷酸隨時間的變化關系。
與實施例1相同的方法得到產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌體，然后用與實施例4相同的方法破碎細胞，再向含15mg/mL肌苷，250mg/mLNa4P2O7·10H2O和0.2mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加40mg/mL產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌體破碎液，然后在30℃、pH 7.6條件下進行催化反應，每隔2小時取樣，加入0.15mL濃鹽酸終止反應。在20℃、8000rmp下離心20min，將上清液稀釋1倍，用高壓液相色譜法對合成的5′-肌苷酸進行定性、定量測定；以檢測產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)破碎細胞催化合成5′-肌苷酸隨時間的變化關系。檢測結果如圖6所示(縱坐標為5′-肌苷酸的濃度(mg/mL)，橫坐標為反應時間)，破碎細胞催化能力較強，反應10分鐘可將加入肌苷總量的38.4％轉化為5′-肌苷酸，當5′-肌苷酸濃度達到5.8mg/mL時，反應速度明顯下降，說明酶活受到產物的抑制。
實施例6、在最佳pH7.6下用產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)破碎細胞液進行5′-肌苷酸的生物合成及底物轉化率與目標產物轉化率隨時間的變化關系用與實施例1相同的方法得到產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌體，然后用與實施例4相同的方法破碎菌體細胞，再向含10mg/mL肌苷，250mg/mLNa4P2O7·10H2O和0.1mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加15mg/mL產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌體破碎液，然后在30℃、pH7.6下進行催化反應，每隔2小時，用0.15mL濃鹽酸終止反應。用高壓液相色譜法對合成的5′-肌苷酸及底物濃度進行定性、定量測定，以檢測底物肌苷的轉化率與目標產物5′-肌苷酸的轉化率隨時間的變化關系。檢測結果如圖7所示(縱坐標為轉化率(％)，橫坐標為反應時間)，在初始較短的時間內，反應可以很快地進行，在10min內，5′-肌苷酸的濃度可以達到5.85mg/mL，而在此后5′-肌苷酸的濃度隨反應時間的變化并不明顯，到達16h后，5′-肌苷酸的濃度可達6.21mg/mL。
實施例7、檢測產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)內酸性磷酸轉移酶的存在方式用與實施例1相同的方法得到產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌體，然后用與實施例4相同的方法破碎細胞，然后在20℃、8000rmp下離心20min，分離上清液和沉淀，再將破碎菌體的上清液和沉淀，以及未進行離心分離的破碎菌體和含全菌體的培養菌液分別作為催化物加到含10mg/mL肌苷，250mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.2mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中在30℃、pH 7.6條件下進行催化反應，以無催化物的反應體系為陰性對照，用高壓液相色譜法測定產物的5′-肌苷酸的濃度。檢測結果如圖8所示(縱坐標為5′-肌苷酸的濃度(mg/mL)，橫坐標為反應時間)，產氣腸桿菌細胞破碎液上清的催化能力遠大于破碎沉淀物的催化能力，說明產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)的酸性磷酸轉移酶處于細胞內，并且具有可溶性強的特點。
實施例8、利用產氣腸桿菌(Enterbacter aerogenes IAM1183)整細胞合成5′-鳥苷酸用與實施例1相同的方法得到產氣腸桿菌(Enterbacter aerogenes IAM1183)全菌體，然后向含10mg/mL鳥苷，250mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.2mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加20mg/mL產氣腸桿菌(Enterbacter aerogenes 1AM1183)全菌體，然后在30℃、pH4.8下進行催化反應，并每隔2小時取樣，用高壓液相色譜法對合成的5′-鳥苷酸進行定性、定量測定。結果隨著反應時間的延長，5′-鳥苷酸的濃度近似呈線性增加，表明本發明所選用的菌株具有較高的酸性磷酸酶活性，可用于5′-鳥苷酸的生物合成中。
實施例9、利用產氣腸桿菌破碎細胞合成5′-鳥苷酸用與實施例1相同的方法得到產氣腸桿菌(Enterbacter aerogenes IAM1183)全菌體，然后用與實施例4相同的方法破碎細胞，再向含12mg/mL鳥苷，280mg/mLNa4P2O7·10H2O和0.3mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加50mg/mL產氣腸桿菌(Enterbacter aerogenes IAM1183)細胞破碎液，然后在32℃、pH 8.0下進行催化反應，每隔2小時用高壓液相色譜法對合成的5′-鳥苷酸濃度進行定性、定量測定。結果且隨著反應時間的延長，5′-鳥苷酸的濃度近似呈線性增加，表明本發明所選用的菌株具有較高的酸性磷酸酶活性，可用于5′-鳥苷酸的生物合成中。
實施例10、利用產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)整細胞合成5′-鳥苷酸用與實施例1相同的方法得到產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌體，然后向含10mg/mL鳥苷，250mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.2mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加20mg/mL產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌體，然后在30℃、pH4.8下進行催化反應，并每隔2小時取樣，用高壓液相色譜法對合成的5′-鳥苷酸進行定性、定量測定。結果隨著反應時間的延長，5′-鳥苷酸的濃度近似呈線性增加，到達16h后，5′-鳥苷酸的濃度可達5.9mg/mL，表明本發明所選用的菌株具有較高的酸性磷酸酶活性，可用于5′-鳥苷酸的生物合成中。
實施例11、利用產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)整細胞合成5′-鳥苷酸用與實施例1相同的方法得到產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌體，然后向含5mg/mL鳥苷和200mg/mL Na4P2O7·10H2O的溶液中添加10mg/mL產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌體，然后在25℃、pH7.6下進行催化反應，并每隔2小時取樣，用高壓液相色譜法對合成的5′-鳥苷酸進行定性、定量測定。結果隨著反應時間的延長，5′-鳥苷酸的濃度近似呈線性增加，5′-鳥苷酸的濃度可達5.5mg/mL，表明本發明所選用的菌株具有較高的酸性磷酸酶活性，可用于5′-鳥苷酸的生物合成中。
實施例12、利用產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)整細胞合成5′-鳥苷酸用與實施例1相同的方法得到產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌體，然后向含40mg/mL鳥苷，300mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.4mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加80mg/mL產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes I4M1183)全菌體，然后在35℃、pH8.4下進行催化反應，并每隔2小時取樣，用高壓液相色譜法對合成的5′-鳥苷酸進行定性、定量測定。結果隨著反應時間的延長，5′-鳥苷酸的濃度近似呈線性增加，5′-鳥苷酸的濃度可達5.9mg/mL，表明本發明所選用的菌株具有較高的酸性磷酸酶活性，可用于5′-鳥苷酸的生物合成中。
實施例13、利用產氣腸桿菌破碎細胞合成5′-鳥苷酸用與實施例1相同的方法得到產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌體，然后用超聲法破碎菌體細胞，方法為將菌體置于pH 8.4，0.1mM的Tris·HCl緩沖液中，在0℃冰水浴中超聲150次，每次超聲時間為5sec，間隔時間為2sec。再向含12mg/mL鳥苷，280mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.1mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加50mg/mL產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)細胞破碎液，然后在30℃、pH 7.6下進行催化反應，每隔2小時用高壓液相色譜法對合成的5′-鳥苷酸濃度進行定性、定量測定。結果且隨著反應時間的延長，5′-鳥苷酸的濃度近似呈線性增加，5′-鳥苷酸的濃度可達6.0mg/mL，表明本發明所選用的菌株具有較高的酸性磷酸酶活性，可用于5′-鳥苷酸的生物合成中。
權利要求
1.一種生物合成5′呈味核苷酸的方法，是將含有酸性磷酸酶基因的產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌體添加到含底物焦磷酸和肌苷或鳥苷的反應溶液中，在25-35℃，pH4.0-8.4下反應，得到5’-肌苷酸或5’-鳥苷酸。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于向反應溶液中添加濃度為0.1-0.4mg/mL的硫酸鎂。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述反應條件為30℃，pH4.6。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于破碎含有酸性磷酸酶基因的產氣腸桿菌菌體細胞，再用細胞破碎液進行反應。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述破碎菌體的方法為將菌體置于pH7.2-8.4，0.1mM的Tris·HCl緩沖液中，在0℃冰水浴中超聲50-150次，每次超聲時間為2-4sec，間隔時間為2-4sec。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述反應條件為30℃，pH7.6。
7.根據權利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于所述肌苷的濃度為5-40mg/mL，鳥苷的濃度為5-40mg/mL，焦磷酸的濃度為200-300mg/mL，產氣腸桿菌菌體的添加量為10-80mg/mL。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述肌苷的濃度為10mg/mL，鳥苷的濃度為10mg/mL，焦磷酸的濃度為250mg/mL，產氣腸桿菌菌體的添加量為20mg/mL。
全文摘要
本發明公開了一種5′呈味核苷酸的生物合成方法。該方法是將含有酸性磷酸酶基因的產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌體添加到含底物焦磷酸和肌苷或鳥苷的反應溶液中，在25－35℃，pH 4.0－8.4下反應，得到5’－肌苷酸或5’－鳥苷酸。本發明具有以下優點1)選用的菌株具有酸性磷酸酶活性高，生長速度快和環境適應性強的優點，在好氧及厭氧條件下均可生長，適于工業化生產；2)生產方法簡單，目的產物的產量高；3)原料來源廣泛，對設備要求低，生產成本低廉。本發明將在5′呈味核苷酸的工業化生產中發揮重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號C12R1/01GK1974780SQ20061016527
公開日2007年6月6日 申請日期2006年12月15日 優先權日2006年12月15日
發明者邢新會, 趙洪新, 楊成, 盧元, 張翀, 王立言 申請人:清華大學