專利名稱：：基因活性分類器在患感染性/非感染性多器官功能衰竭患者基因表達譜的體外分類中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及基因活性標簽對患感染性和非感染性多器官功能衰竭的患者分別進行分類的應用。本發明進一步涉及所述基因活性分類器(geneactivityclassificator)作為儀器中的儲存數值參數對患感染性或非感染性多器官功能衰竭的患者進行體外診斷的應用。此外，本發明涉及一種用于對患感染性和非感染性多器官功能衰竭的患者分別進行體外診斷的儀器。另外，本發明涉及應用基因活性標簽/分類器對患者基因表達譜分類，從而分別評估治療感染性和非感染性多器官功能衰竭患者的活性物質的治療效果。盡管有病理生理認識和支持治療上的進步，多器官功能衰竭綜合癥(MOFS)和多器官功能衰竭(MOF)分別是重癥監護患者最多發的死亡原因，并且在世界范圍內繼續增加。其發展的結果不僅對患者個人相當嚴重，而且對公共衛生保健體系的費用和許多醫療領域內的醫學進展具有巨大的影響。多器官功能衰竭被定義為兩個或多個重要器官系統同時或在短時間內發生衰竭。多器官功能衰竭綜合癥是在MOF之前發生的最初的器官功能不全[l]。現在對多器官功能衰竭的定義是兩個或多個器官同時或在短時間內喪失功能，而緩慢穩定的器官功能衰竭被排除在外[2]。對MOF的預后與所涉及器官系統的數量密切相關。如果一個器官衰竭，24小時內的死亡率是22%;7天后的死亡率是41%。在3個器官系統衰竭的情況下，死亡率升高到第一天為80%，4天后是100%[3]。對于MOFS和MOF嚴重程度的臨床評分，通常使用GORIS等的多器官功能衰竭評分(MOF-評分)，或者敗血癥相關器官功能衰竭評估(SOFA)評分[5]。MOF評分提供了一種對器官功能快速的臨床上簡易的3個可能等級的分類。在臨床文獻中，MOF評分大于4時通常記錄為MOF[6]。SOFA評分是一個快速對功能的臨床評估打分的評分系統，其對下述器官系統評分呼吸(肺)、凝血、肝臟、心血管系統、中樞神經系統和腎臟。此評分系統使用4個等級。在臨床上，MOF的分3個階段發展[7]:1.器官休克觸發的生理病理機制是完全不同成因的灌注不足。其發生在數小時之內，還不會導致永久傷害。2.器官功能喪失如果持續的灌注不足一直維持幾天，就會導致水腫局部內的SIRS發生(系統炎癥反應綜合癥，根據[8]分類)和細胞損傷。這一時期被稱為多器官功能喪失綜合癥(MODS)。3.器官衰竭持續的灌注不足導致內臟區域的淤滯，從而造成腸內的內毒素的重復感染和轉移。這使得臨床癥狀加重，敗血癥的全面發生。器官功能喪失變為器官衰竭。MODS和MOF是具有復雜生理病理性質的臨床表現。目前對可觸發SIRS和相應心臟和循環系統效應的嚴重感染和外傷的免疫-炎癥宿主反應的發展和復雜性的確切分子原因還不完全清楚。MODS和MOF都可以導致感染性的和非感染性的發生。MODS和MOF通常發展為外傷造成休克后患敗血癥的患者、使用心肺機進行外科手術后的患者、在器官移植后的患者、及其他患者的一個臨床上重要的并發癥(圖1)。MODS和MOF發展的一個重要致病機制是系統炎癥綜合癥(SIRS,[8])的發展。起動SIRS的生理病理過程不僅包括免疫系統的所有部分，還干擾到心臟和循環系統的所有水平，并且不局限于心肌抑制和血管舒張。尤其在微循環水平上的心臟和循環系統的變化形成了常見的最終距離(finaldistance)并產生組織缺氧，后者被認為是多器官功能衰竭發病機理的一個重要協同因子。圖1顯示了根據目前標準對MODS和MOF發展的最重要機理的示例性描述[10]:似乎過度活化的免疫系統在多器官功能衰竭的發展中發揮了決定性的作用。在此文中，內皮通過分泌細胞因子和賦予白細胞粘附起到了核心的關鍵作用。在內皮細胞內的信號轉導級聯被活化，導致轉錄因子的表達和激活。仍然沒有能夠區分感染性和非感染性原因的靈敏/特異診斷的原因是因為對MODS和MOF早期過程的不完全了解。新類型的生物標簽和診斷，如今甚至在基因表達水平，可能提供了多器官功能衰竭早期診斷以及區分MODS和MOF感染性和非感染性原因的重要診斷信息。另外，它們對闡明系統炎癥的生理病理機制也很重要。經常在臨床實踐中使用的預先征兆，如發燒、白細胞增多、心動過速和呼吸急促，對于MODS或MOF的診斷以及區分MODS和MOF感染性和非感染性原因是非特異的。在早期階段檢測微循環不規律的參數，例如腸粘膜pH[11]和毛細管床的乳酸水平[12]的變化、原因不在肺部的呼吸不足的出現[2]、白細胞彈性蛋白酶的升高[14、15]、新蝶呤的高水平[16]、多形核白細胞的激活和IL-6的高水平[17]、只在有限程度下適于作為MODS和MOF發展晚期的早期參數，但它們對區分MODS和MOF感染性和非感染性原因無效。這樣，急需全新的診斷方法，用來提高本領域技術人員在早期階段區分非感染性和感染性MODS和MOF以及預測患者如何對特定治療產生反應的能力。然而，正是MODS和MOF感染性和非感染性原因間的區別在醫學上是極其重要的，例如通過這一區別可以使抗生素的使用更有效，這有利于節省可觀的費用和避免抗生素非特異應用產生的副反應。此外對于非感染性MODS或MOF，有可能避免在時間和人員上細致深入的診斷檢測，同時也有可能避免所有與患者有關的整形外科材料例如靜脈導管的互換的風險，其中，所述診斷檢測對患者是產生壓力的，所述診斷檢測(例如，送到CT/MRI)是用于鑒定感染的部位，需要實施復雜微生物方法(例如，血液培養物的檢驗，其也需要患者提供大量的血液)。反之亦然，對MODS或MOF感染性原因的快速鑒定可以確保這些檢測迅速進行并因此降低其死亡率。技術的進步，尤其是微陣列技術的發展，使得本領域內的技術人員有可能同時比較10,000個或更多的基因及它們的基因產物。這種微陣列技術的應用可以提供關于健康狀況、調節機制、生化相互作用和信號傳遞網絡的信息。由于在生物體對感染如何作出反應上的理解的進步，可推動感染性衰竭的檢測、診斷和治療的增強方法的發展。微陣列起源于"Southern印跡"，其提出了固定DNA分子的第一種方法，從而可以在固體基質上三維尋址。第一個微陣列由DNA片段組成，經常是未知序列，并且以網點式置于微孔膜(通常是尼龍)上。常用cDNA、基因組DNA或質粒文庫，雜交物質用放射性基團標記[20-22]。現在，同時應用玻璃作為基質和使用熒光檢測，在高密度下合成和使用核苷酸的新技術發展可以小型化核苷酸陣列。同時，實驗通量和信息內容也提高了[23-25]。通過癌癥研究領域內的臨床試驗對微陣列技術的應用進行了第一次說明。在此，證明了表達譜對于鑒定單個基因或基因群的活性是有價值的，這些活性與特定的臨床表現是相關的[26]。分析了許多具有或不具有急性白血病或彌漫性B細胞淋巴瘤個體來源的樣品，并發現了基因表達標簽(RNA),隨后將其用于這些類型癌癥的臨床相關分類[26，27]。Golub等發現單獨一個基因不足以得到可靠的預測，而基于53個基因(選自微陣列卜:的6000多個基因)轉錄變化的預測是很準確的[26]。由WO03/002763可知，主要使用微陣列基因表達譜的檢測可以用于敗血癥和敗血癥類似狀況的診斷。申請人的德國專利申請DE10340395.7，DE10336511.7，DE10315031.5和102004009952.9描述了例如通過微陣列技術得到的基因表達譜在原理上對SIRS、廣泛性發炎性炎癥、敗血癥和嚴重敗血癥的診斷是有用的。這些應用在此通過引用的方式納入本文。由Feezor等[28]可知，由于外科治療患具有多器官功能喪失綜合癥(MODS)的SIRS的患者，與在同樣外科治療后患不具有MODS的SIRS的患者相比，其基因活性存在差異。然而，因為在這些患者中沒有檢測到感染，所以這些研究沒有對非感染性MOF與感染性MOF的區別做出陳述。為了對基因表達譜分類，已經有多種方法及其對基因表達數據的應用，例如線性禾卩二次判另lj分析(linearandquadraticdiscriminationanalysis)、復合協變預觀U(CompoundCovariantPredictor)、最緊鄰分類？去(NearestNeighborClassification)、分類樹(ClassficationTrees)或支持向量機(SupportVectorMachines)[26，29，30，31，32]。分析基因表達數據的分類方法應用的一般概況見[33]。分類方法的目標是開發出多元分類器(multivariantclassficators)，其可以對一個新數據組是否屬于某個類別作出預測。這樣，例如患者可以通過分離器依據它們對某個特定治療的反應被劃分為反應類或非反應類。大致上，分類器通過3步進行1.從一大組數據中選擇統計學相關的特征。對基因表達分析來說，根據它們的表達模式，單變量檢驗作為第一步以從多種分類中選擇統計學相關基因。2.通過不同分類方法確定分分類器，其最終提供了分類器的訓練集。3.通過基因表達譜的新的、未被分類的檢驗集確認這一訓練集，并優化該訓練集。WO2004/108957大體描述了生物標簽(核苷酸)的分類及其分別在SIRS和敗血癥診斷上的應用。但沒有描述用于對感染性和非感染性多器官功能衰竭進行診斷的生物標簽的分類和/或應用。在先德國專利申請102004049897.041第一次描述了區分感染性和非感染性多器官功能衰竭的基因活性標簽。該申請描述了1297個不同基因在體外分別診斷患感染性和非感染性多器官功能衰竭患者的應用。本發明超越了DE102004049897.041中描述的技術狀況，因為通過患者樣品來源的基因表達譜的特異檢驗方法，本發明發現了基因活性可用于在體外診斷以區分非感染性和感染性多器官功能衰竭的分類器。本專利申請中公開的發明的基本點在于基因活性分類器可以用于對分別患非感染性和感染性MOF的患者的基因表達譜進行分類。這些分類器的應用可以方便地與臨床參數一起用于診斷，然而，其對重癥監護中的特定治療的啟動是重要的。這樣，本發明的目的是使用基因活性分類器用于區分未被感染且無多器官功能衰竭的患者、非感染性多器官功能衰竭的患者和感染性多器官功能衰竭的患者。本發明的目的是通過根據權利要求1中的基因活性標簽，根據權利要求5中的分類方法，根據權利要求7中的微陣列和根據權利要求8中的儀器來實現的。在下文中，名詞"ITS-對照"用來標識處于重癥監護中然而并未檢測到感染和多器官功能衰竭的患者。本發明尤其涉及基因活性分類器的應用，基于此應用，體外獲得的患者樣品的基因表達譜被分為非感染性多器官功能衰竭和感染性多器官功能衰竭。使用該分類器，本發明進一步可用于在治療期間評估非感染性多器官功能衰竭和感染性多器官功能衰竭的患者的療程。本發明的基因活性分類器進一步在臨床試驗2-4期用作由非感染性或感染性原因造成的多器官功能衰竭的患者的納入或排除標準。本發明的一個優選實施例涉及基因活性分類器進一步用于電子處理以及制作軟件，該軟件可用于描述患者的個體預后、診斷和/或患者數據管理系統。在本文中，基因活性分類器作為診斷儀器中體外檢測的基因表達譜的自動評估的依據。在此，基因表達分類器作為數值參數儲存于軟件、集成電路、可擦可編程只讀儲存器(EPROM)或其他本領域技術人員己知的數值參數儲存器件(means)。本發明的另一個優選實施例涉及將基因活性分類器儲存為數值參數的儀器，其可以體外診斷非感染性和感染性多器官功能衰竭的患者。除了作為數值參數儲存的基因活性分類器，所述儀器還包括將患者樣品中未被分類的基因表達譜與儲存的基因活性分類器進行比較并將相應結果以技術顯示輸出的器件。這可以通過，例如基因活性分類器的數值參數的電子化處理一一轉化為電子信號，并且與從待檢測基因表達譜獲得的電子信號相比較來實現。比較的結果是分別將待檢測基因表達譜分類到非感染性多器官功能衰竭和感染性多器官功能衰竭類別中。類似的和/或數字的展示，例如評分系統(與在體外診斷中已經使用的APACHE或SOFA評分相似)或電子膠、聲音信號或其他本領域技術人員己知的方法作為技術顯示。在一個優選實施例中，該儀器也能夠產生與儲存的基因活性分類器相比較的基因表達譜。為達到這一目的，該儀器的組成為用于體外獲得患者樣品的樣品制備模塊、用于將患者樣品與來自基因活性分類器的基因活性探針雜交的模塊、讀取雜交信號的模塊、另一個對讀取的雜交信號進行圖形分析的模塊、能夠與儲存的基因活性分類器自動比較的模塊、還有可以顯示比較結果的模塊。對于本領域的技術人員顯而易見的是不是所有的模塊都必須組合在所述儀器中，其由自動化程度決定。已經可以自動化/半自動化生成基因表達譜的儀器例如為Roche公司的LightCycler、Cepheid公司的SmartCycler或ClondiagChipTechnologies公司的APsystem。另外，本領域的技術人員用于分析不同基因表達的所有其他的已知方法可作為本發明應用中描述的微陣列技術生成基因表達譜的替代方法。本發明的基因活性分類器也可用于生成"電子"專家系統和/或信號轉導細胞通路的"電子"調制。作為本發明的基因活性分類器，使用的基因和/或基因片段選自SEQIDNo.1.1到ID1.9，以及這些基因的基因片段組成的組，其中所述片段具有5-2000或更多，優選為20-200，更優選為20-80個核苷酸。序列IDU至序列ID1.9的這些序列包含在本發明的范圍內，它們在所附的包含9個序列的序列表中詳細公開，這樣，該序列表作為本發明說明書的一部分，同時也是本發明公開內容的一部分。在序列表中，序列IDNo.U至序列IDNo.1.9的單個序列進一步指定了其GenBank序號。(網址http:〃www.ncbi.nlm.nih.aov/)<>在本文中，也可使用所列探針的可雜交的合成類似物(hybridizablesyntheticanalogue)。序列SEQIDNo.1.1至SEQIDNo.1.9的插入、缺失或核苷酸替代突變只要沒有實質性改變用于本發明目的的序列雜交行為，這些突變的使用也可能實現本發明的目的。只要本發明中提到基因活性標簽，則這種突變也包括在內。在另一個實施例中，根據表1的基因活性分類器SEQIDNo.1.1至SEQIDNo.1.9與基因表達譜分類的邏輯選擇規則相聯系，該基因表達譜是指非感染性和感染性多器官功能衰竭患者樣品的基因表達譜。表l:ITS對照、非感染性多器官功能衰竭和感染性多器官功能衰竭各自的選擇規則<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>個過表達基肉活性，小基w活性下調表達本發明的另一個實施例的特征是如權利要求1中所列的基因或基因片段和/或由它們RNA所衍生的序列被合成類似物、適配子以及肽核苷酸替換。本發明的另一個實施例的特征是樣品選自體液，具體地，血液、滲出液、尿、腹水、精液、唾液、穿刺液，細胞內容物或以上的混合物。本發明的另一個實施例的特征是細胞樣品如果有必要將進行裂解處理以釋放其細胞內容物。對本領域的技術人員顯而易見的是，權利要求所述的本發明各個特性可以任何希望的方式相互組合。本發明所使用的基因活性分類器包括所有衍生的DNA序列、部分序列和合成類似物(例如肽-核酸(PNA))。本發明關于在RNA水平測定基因表達的說明不應被認為是限制性的，而只是本發明的示例性應用。本發明的關于血液的說明只是本發明的一個示例性實施方式。在本發明中使用的名詞生物液體是指所有的人類體液。本發明的進一步優點和特性從工作實施例的說明以及圖示中會更清晰。圖1顯示了從不同醫療狀態開始的多器官功能衰竭的藥理療程。工作實施例對基因活性分類器的產生和確認的研究，該基因活性分類器用于將患者樣品的基因表達譜分類到以下類別中的一種ITS對照、非感染性多器官功能衰竭或感染性多器官功能衰竭。對不同基因表達進行測量，作為訓練集的基礎測試在外科重癥監護區進行治療的總共57個患者的全血樣品，測量其不同的基因表達，以區分多器官功能衰竭的非感染性和感染性原因。完整的基因表達數據構成基因活性分類器訓練集生成的基礎。全血樣品取自在重癥監護期間患感染性MOF[根據8分類]的31個患者。此外，全血樣品取自在重癥監護期間發展為非感染性MOF[根據8分類]的26個患者。另外，全新樣品取自進行重癥監護(下文記做ITS對照)的18個患者。參照樣品是SID-M5細胞系的總RNA。三組患者的所選特征見表2。信息包括年齡、性別以及作為器官系統功能的測量的SOFA評分。另外，也給出了血漿降鈣素原(procalcitonine,PCT)和CRP的血漿蛋白水平以及患者的白細胞數量。每--個患者樣品在微陣列上與參照樣品共雜交。表2:患者組數據<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*p<0.05實驗描述獲取全血后，使用PAXGeneBloodRNA試劑盒根據其操作手冊(Qiagen)分離樣品的總RNA。細胞培養19個低溫細胞培養物(SIGM5)(冷凍于液氮)用于細胞培養。每一個細胞培養物用2ml添加20%肽牛血清(FCS)的Iscove，s培養液(BiocheromAG)培養。其后，細胞培養物在12孔板內在37°C、5%C02條件下培養24小時。其后，18個孔的內容物以相同的體積分為2份，這樣最終得到3個相同形式的板(總共36個孔)。然后，繼續在相同條件下繼續培養24小時。然后，每個板的11個孔的所得培養物混合并且離心(1000xg，5分鐘，環境溫度)。去除上清，細胞沉淀用40ml上述培養液溶解。該40ml的溶解細胞平均分到2個250ml的燒杯內，再添加5ml上述培養液后培養。所剩2個板上各自所剩的2ml培養液中取80ul，置于同一個板的空白孔中，該孔在之前己經添加lml上述培養液。培養48小時后，只取12孔板中的一個進行如下步驟每空中取出500ul并混合。所得的6ml培養液添加到一個含有大約10ml新鮮培養液的250ml燒杯中。混合物在環境溫度以1000xg離心5分鐘，再溶解到10ml上述培養液中。通過隨后的細胞計數得到下述結果1.5xl(^個細胞/ml，共10ml，細胞總數是1.5xl0S個。由于細胞數量還不夠，將2.5ml上述細胞懸液添加到含30ml的上述培養液的250ml(75cm2)燒杯(共4個燒杯)中。培養72小時后，每一個燒杯中添加20ml的新鮮培養液。再培養24小時后，如上所述對細胞計數。細胞總數為3.8xl0S個。為得到希望的2xl(f個細胞數量，在4個燒杯中用47.5ml上述培養液重懸細胞。再培養24小時后，細胞離心并用無Ca2，nMg2+的磷酸緩沖液(BiochromAG)洗滌2次。按照操作手冊使用NucleoSpinRNAL試劑盒(Machery&Nagel)分離總RNA。重復上述的步驟直到獲得需要量的細胞。這對于獲得所需要的6mg總RNA是必須的，該量等效于600ugRNA/108個細胞。反轉錄/標記/雜交獲取全血后，使用PAXGeneBloodRNA試劑盒(PreAnalytX)根據其操作手冊分離樣品的總RNA并測試以定性。每一個樣品中取lOug總RNA并與SIGM5細胞來源的10ug總RNA作為參照RNA—起，使用反轉錄酶SuperscriptII(Invitrogen)轉錄成互補DNA(cDNA)。其后，通過堿性水解從混合物中去除RNA。在反應混合物中，一部分dTTP用氨基化dUTP(AA-dUTP)替換以促成熒光染料在稍后時連接到cDNA上。對反應混合物純化后，樣品和對照的cDNA使用熒光燃料Alexa647和Alexa555共價標記，并在SIRS-Lab公司的微陣列上雜交。所使用的微陣列上，固化了5308個具有55到70個堿基對長度的不同多核苷酸。每一個核苷酸代表了一個人類基因。另外，其上還有對照點用于質量驗證。一個微陣列被分為28個亞陣列，每一個亞陣列上安置了15xl5個點的格柵。雜交和隨后的洗滌和染色分別使用雜交工作站HS400(Tecan)按照操作手冊在42。C進行10.5小時。所使用的雜交溶液的組成是標記的cDNA樣品、3.5xSSC(lxSSC包括150mM氯化鈉和15mM檸檬酸鈉)、0.3%十二烷基硫酸鈉(v/v)、25%甲酰胺和0.8嗎/plcot-lDNA、酵母t-RNA和poly-ARNA。隨后對微陣列的洗滌在環境溫度下根據以下方案進行使用洗滌緩沖液1(2xSSC,0.03%十二垸基硫酸鈉)、洗滌緩沖液2(lxSSC)和最終洗滌緩沖液3(0.2xSSC)沖洗90秒。其后，微陣列在氮氣流大于2.5bar壓力、30。C下干燥150秒以上。處理過的微陣列的雜交信號再使用GenePix4000B(Axon)掃描儀讀取，不同表達基因的表達率通過GenePixPro4.0(Axon)軟件測定。評估對于分析，一個點的平均強度作為相應點像素的中值。系統偏差的矯正根據Huber等[34]的方法對系統偏差進行矯正。根據此方法，一個微陣列上的加法和乘法偏倚根據70%基因樣品來估算。為進一歩的計算，通過正弦雙曲線(arcussinushyperbolicus)轉換信號。為了分析，患者樣品信號的標注化、轉化了的信號相對比率相對于對照樣品進行計算。這即是患者n的基因j的計算得到數據為Gj，n=arcsinh(Scy5(j，n》-arcsinh(Scy3(j，n))，其中[SCy3(j,n),SCy5(j,n)]是相聯系的信號對。當代表一個患者的一個點不能被分析時(例如，掃描圖片污染)，相關的數值被標記為"丟失數據"。統計比較對每一個基因使用成對的隨機學生檢驗(randomstudenttest)作為比較。兩個隨機樣品都分別含有非感染性MOF和感染性MOF患者組的數值。為選擇出差異表達的基因，計算相關P值和丟失數據的數量。適用于所選基因的相關P值小于0.05的組。表3:與非感染性MOF的患者基因活性相比，感染性MOF患者樣品中基<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表4:與患非感染性MOF的患者基因活性相比，患感染性MOF患者樣品中基因活性明顯下降。_<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表3和4中顯示的每一個序列的GenBnak序列號(互聯網鏈接http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)與所附序列表相關聯，每個序列都被逐一列出或者提供了詳細信息(序列ID:l至系列ID:1297)。而且，序列在所述處分別公開。此序列表是本發明說明書的部分。另外，這些序列在德國專利申請102004049897.0中公開，其通過引用納入至本文內。基因活性分類器概述(訓練集)基于所有測量的基因活性，基因活性分類器和選擇規則通過MediPred軟件(BiocontrolJenaGmbH)建立，其可以將基因表達模式分為感染性MOF和非感染性MOF類別(圖2)。確定每個基因高表達和低表達的閾值(在圖3中表示為Cmin和Cmax)，并選出每個患者具有典型和增強基因表達行為的基因。對未分類的基因表達譜的基因活性分類器的測試(檢驗集)使用定義的選擇規則檢驗確定的基因活性分類器，該規則基于ITS對照(56)、非感染性MOF的患者(75)和感染性MOF的患者的共190個未分類基因表達模式檢驗組，并通過臨床數據驗證。為實現此目的，基因表達譜選自臨床診斷為ITS對照或非感染性MOF或感染性MOF的患者。在隨后與訓練集的比較中，如果發現待分類的表達模式是訓練集且在由選擇規則(以及同時應有選擇的標準)定義的相應基因活性分類器的表達范圍內，則待分類的表達模式被定為相應的類別。表5顯示了哪一個測試集屬于哪一個類別。可看到，86%的ITS對照、80%非感染性多器官功能衰竭的患者以及63%感染性多器官功能衰竭的患者可以正確地分類到相應的類別中。表5:190個基因表達譜分類到ITS對照、非感染性MOF和感染性MOF的百分比。患者組ITS-對照非感染性多器官功能衰竭感染性多器官功能衰竭l待分類的基丙表達譜數量5675(與幾天相對應的16個患者的多個表達譜)59(與幾天相對應的35個患者的多個表達譜)相應分類〖％]ITS-對照86414非感染性多器官功能衰竭138016感染性多器官功能衰竭21663這說明與選擇標準相關聯的基因表達分類器對本發明是有用的。參考文獻1.NatansonC(1997)Anti-inflammatorytherapiestotreatsepsisandsepticshock:Areassessment.CritCareMed25:1095-10992.GeigerK(1995)FrtihparameterfiirMultiorgandysfunktionssyndrom.inHartenauerU(ed.)SepsisinderFriihphaseMiinchenMMVMedizinVerlag19-253.KnausWA,DraperEA,WagnerDP，ZimmermannJE(1985)Prognosisinacuteorgan-systemfailure.AnnSurg202:658-6934.GorisRI，BockhorstTP,NuytinckJKS(1995)Mulitipleorganfailure.ArchSurg120:1109-11155.VincentJL，MorenoR，TakalaJ，etal.(1996)TheSOFA(Sepsis-relatedOrganFailureAssessment)scoretodescribeorgandysfunction/failure.OnbehalfoftheWorkingGrouponSepsis-RelatedProblemsoftheEuropeanSocietyofIntensiveCareMedicine,IntensiveCareMed.Jul22(7):707-10.6.PfeifferL，EhrhardtN，KretschniarR，etal.(1996)EndotoxinamieundMultiorganversagennachPolytrauma,AnaesthesiolReanimat21:91-967.SchlagG，RedlH(1993)Organinshock,earlyorganfailure,lateorganfailure.,inSchlagGandRedlH(eds.)Pathophysiologyofshock,sepsis，andorganfailureBerlinHeidelbergSpringer-Verlag,1-48.BoneRG，BalkRA,CerraFB,etal.(1992)TheACCP/SCCMConsensusConferenceCommittee(1992)DefinitionsforSepsisandorganfailureandguidelinesfortheuseofinnovativetherapiesinSepsis.Chest101:1656—1662;undCritCareMed1992;20:864-874.9.LevyMM，FinkM，MarshallJC,etal,(2003)FortheInternationalSepsisDefinitionsConference:2001SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SISInternationalSepsisDefinitionsConference.CritCareMed.Apr;31(4):1250-610.http:〃chirinn.klinikum.uni-muenchen.de/forschung/for—01—14—04.html,StandOtober2004，modifiziert11.MarikPE.(1993)GastricintramucosalpH.Abetterpredictorofmultiorgandysfuctionsyndromanddeaththanoxygenderivedvariablesinpatientswithsepsis.CHEST104:,225-22912.BernardinG,PradierC,TigerF,etal.(1996)Bloodpressureandarteriallactatelevelareearlyindicatorsofshort-termsurvivalinhumansepticshock.IntensivCareMed22:17-25;3.MarecauxG，PinskyMR,DupontE,etal.(1996)BloodlactatelevelsarebetterprognosticindicatorsthanTNFandIL-6levelsinpatientswithsepticshock.IntensivCareMed22:404-40814.DuswaldKH,JochumM,SchrammW，FritzH(1985)Releasedgranulocyticdastase:anindicatorofpathobiochemicalalterationsinsepticemiaafterabdominalsurgery.Surgery98:892-89915.NuytinckJKS，GorisRJ,RedlH，etal.(1986)Posttraumaticcomplicationsandinflammatorymediators.ArchSurg121:886-89016.Nast-KolbD,JochumM,WaydlasC，etal.(1991)DieWertigkeitbiochemischerFaktorenbeimPolytrauma.HefteUnfallheilkunde215:21517.HackCE，deGrootER，Felt陽BersmaRJ,etal.(1989》Increasedplasmalevelsofinterleukin-6insepsis"Blood74:1704-171018.PatelRT，DeenKI，YoungsD,etal.(1994)Interleukin6isaprognosticindicatorofoutcomeinsevereintra-abdominalsepsis.BrJSurg81:1306-130819.SouthernEM(1974)Animprovedmethodfortransferringnucleotidesfromelectrophoresisstripstothinlayersofion-exchangecellulose.AnalBiochem62:317-31820.GillespieD，SpiegelmanS(1965)AquantitativeassayforDNA-RNAhybridswithDNAimmobilizedonamembrane.JMolBiol12:829-84221.LennonGG，LehrachH(1991)HybridizationanalysesofarrayedcDNAlibraries.TrendsGenet7:314-31722.KafatosFC,JonesCW，EfstratiadisA(1979)Determinationofnucleicacidsequencehomologiesandrelativeconcentrationsbyadothybridizationprocedure.NuclAcidRes7:1541-155223.FodorSP，ReadJL，PirrungMC，StryerL，LuAT,SolasD(1991)Light-directed,spatiallyaddressableparallelchemicalsynthesis.Science251:767-77324.PeaseAC，SolasD，SullivanEJ,CroninMT,HolmesCP，FodorSP(1994)Light-generatedoligonucleotidearraysforrapidDNAsequenceanalysis.ProcNatlAcadSciUSA91:5022-502625.SchenaM，ShalonD,DavisRW,BrownPO(1995)Quantitativemonitoringofgeneexpressionpatternswithacompleme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