專利名稱：：一種生產有效生物反應器的方法
技術領域：
：本發明涉及一種生產有效生物反應器的方法，該方法包括在本發明描述的生物反應器中培養動物細胞，通過反應器的器壁和細胞之間的摩擦增加動物細胞懸浮培養液中溶氧的方法。
背景技術：
：動物細胞的高密度懸浮培養是蛋白類藥物或疫苗產品開發的有用工具。常常需要小體積的細胞培養罐用于動物實驗研究的樣品生產，較大體積的細胞培養罐用于臨床研究藥品的生產。許多細胞生物學家喜歡應用簡化的小型懸浮培養裝置，但放大專家則喜歡"易于優化"的大體積細胞反應器系統。目前的生物反應器培養罐和搖瓶的形狀都是很典型的柱體形。這樣的罐體或瓶工作體積的高徑比大于l:1。罐體中的培養基表面積不足于氧氣被有效吸收。常用空氣或氧氣噴射來解決這一問題。然而，過量的空氣噴射常產生泡沫和使氣泡破裂，同樣過量的氧氣噴射也毒害細胞。因此，用較復雜的控制塔和相關的溶氧探頭來監控空氣或純氧的噴射。不過，優化控制塔或探頭比較昂貴。因此，需要開發無控制塔和無相關溶氧探頭的小體積培養罐，特別是一次性罐體，和"易于優化"的大體積培養罐。本專利的這種設計允許不使用復雜的控制塔和相關的探頭來大體積培養細胞，也開發了一次性或可滅菌的小體積搖瓶型的懸浮培養系統。還研究了一個"易于優化"的攪拌器驅動的大體積工業化倒置的平錐底生物反應器系統。本發明描述了一種生物反應器，即一種懸浮細胞培養罐，該培養罐是一種寬體平錐底可在搖床上用于懸浮培養動物細胞的細胞反應器，與傳統的生物反應器和平底搖瓶相比。該培養罐可以使細胞液很容易地波及罐壁，產生很小的機械張力，形成了較寬的薄培養液層，有利于擴大表面積，增大氣體交換量，改善混合效果。本發明進一步的利用該培養罐對培養液進行培養，發現了一種在培養液中增加溶解氧的方法。
發明內容本發明提供一種利用細胞培養罐對培養液進行培養的方法，特別是在本發明描述的培養罐中對培養液增加溶解氧的方法。對于細胞培養，本發明發現只要培養基表面積與培養基體積比高于O.14cm2/cm3,不利用復雜的控制塔和相關的溶氧和PH探頭,也可以使懸浮的動物細胞生長良好,這種培養是在寬體平錐底培養罐(圖l)中，通過底部的空氣噴射或表面的純氧供給,在37。C用帶有20-25mMHEPS的無血清培養基進行培養的，與傳統的柱體攪拌罐相比寬體平錐底搖瓶具有表面通氣好的優勢。本發明是首次利用搖瓶培養罐來培養動物細胞,驚奇的是，它們工作的效果比傳統的A卯likon平底反應器好，在細胞密度、重組蛋白產量、細胞活力和細胞皮實性方面優勢明顯.顯然結合了搖床、平錐底、寬體和pH穩定的培養基,工作起來對動物細胞培養和重組蛋白的產量具有優勢。本發明的寬體平錐底培養罐的特點是有效的錐體角度.用塑料的不同錐角的錐底離心管研究了錐角對固定轉角搖動、培養基混合、接種體積的影響,發現如果錐角太小(比如小于30度,或者太寬，大于70度)，搖床不能使培養基很容易地波及管壁。本發明的寬體平錐底培養罐特點是3升懸浮培養罐不用復雜的控制塔和相關的溶氧、pH探頭，通氣是通過位于錐底最低點的空氣噴射來進行，可延長氣泡的行程，或者在培養基表面通純氧。應用此種寬體平錐底培養罐研究了表達的TNFR1-Fc-IL-lra,IL-18bp-Fc-IL-lra，VEGFRl-Fc-IL-lra,andTie2-Fc-IL-lra的CHO細胞的培養，令人吃驚的是，寬體平錐底培養罐工作明顯地好于平底的Applikon攪拌型反應器和平底的搖瓶,顯然搖床搖動能夠推動培養基波及罐體壁,且不產生剪切力和機械張力，形成較大范圍的薄培養基層流,有利于擴大通氣量.本發明是在上述寬體平錐底培養罐基礎上，采用了溶氧探頭、pH探頭和相應的探測系統(www.flurometrix.com)(圖2a,b).同時也利用數碼相機拍照并研究寬體平錐底培養罐中培養基的運動規律。首先，測定了寬體平錐底培養罐中工作體積為150ml培養液的溶氧值(圖3)。發現溶氧水平很容易達到100%(表1)。然后用空氣泵在相同的罐中靜態向培養液中5泵入空氣，驚奇的是，在一定的時間內不能達到100%的溶氧(表2),對這種現象非常驚奇，因為日常用的3升Applikon的反應器都是用泵入空氣法來較正溶氧探頭并設定溶氧為100%的，在這種現象的背后必然存在著一種作用機制。表l在150ml工作體積的寬體平錐底培養罐中加入新配制的培養基后，120rik搖動(圖3)每隔30分，測定一次溶氧。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>為了尋找答案,利用數碼相機拍下了倒置寬體平錐底培養罐中培養液的瞬時運動時相(圖5a,b,c,d)(圖3)。所有的圖片清晰地表明在瞬時運動中，培養液大部分波及培養罐的一側，而另一側則暴露在空氣中。由于是倒置的錐底，搖動容易使培養液爬至罐壁上。這便產生了一種培養液流的圓形運動，重復擺動或沖刷著暴露于空氣中的罐壁。我們設想，這種圓形運動與它重復的擺動增加了培養基中的溶氧。在微小的氧氣泡中發現有溶解氧，氧與水或培養液混合存在，并能在水分子間形成小泡。根據上述，可能是在光滑的玻璃或塑料表面吸附著這些微小的氧氣泡，并在瞬時的暴露于空氣的過程中形成了微層的氧氣泡。那么設想在光滑表面形成的這種瞬時的空氣泡層是如此的小，以致于類似于水中的溶解氧的小泡大小。這種小泡層然后被吞噬或被循環的培養液流沖走，這樣使得氧氣更容易溶解于水中。這種循環運動不斷地重復，因為是平錐底和搖動，使得溶氧水平的增加比直接向培養基中通氣更有效。為了驗證此假設，利用12ml的塑料管(NUNC公司產品)，裝入4ml培養液并在轉鼓上以每分60轉的速度轉動(圖6a，b)。轉動10分鐘后，管中的所有培養液樣品的溶氧水平都達到了100%。這個研究表明在一定的轉速或力量下，培養液流重復擺動或接觸暴露于空氣的光滑表面有效地增加了培養液的溶氧水平。在轉瓶中懸浮培養CHOK細胞，轉速為60-100轉/每分，培養4天。恰好培養4天的培養液，其溶氧都達到了100%。但細胞根本沒有生長。因此認為對適宜的懸浮細胞培養除了充足的溶氧外，還需要有效的的混合。然而，在50ml離心管中(NUNC公司產品)培養細胞，這種離心管呈倒置的平錐底，并置于搖床上搖動4天(圖7)，所有的細胞生長良好，并很容易達到2.2%細胞壓積。這一結果表明，對于優化的懸浮細胞培養，除了充足的溶氧外，混合運動是必要的。根據上面的發現，設計了幾種反應器的樣機，對于每一種型號的樣機，采取了用外力重復使培養液流擺動或接觸暴露于空氣的光滑表面和足夠的培養液混合運動來增加培養液中的溶氧(圖8a，b,c)，細節將在例4中進一步討論。同時也研究了在無血清培養液中培養表達TNFR2-Fc-IL-lra融合蛋白的CHO細胞的批式懸浮培養過程，明顯地看到，倒置的寬體平錐底培養罐對優化溶氧水平、細胞密度和外源蛋白產量是非常理想的(表3)，細節在例l中討論。根據以上研究，本發明提出一種利用本發明的細胞培養罐對培養液進行培養的方法，該方法包括的步驟是-步驟l:將細胞培養液置于具有光滑表面的寬體平錐底培養罐中；步驟2:使培養液在寬體平錐底培養罐運動。以上步驟中，不包括利用對細胞培養有明顯的剪切力的方法。所述運動包括穿過暴露于空氣的光滑培養罐表面的重復沖刷運動；或者培養罐的自轉運動，使細胞培養基不斷穿過暴露空氣或氧氣的光滑培養罐的上壁；或者，暴露于空氣或氧氣的自轉多層圓盤不斷地在培養基中轉動。所述運動包括下述的任何運動搖動、滾動、轉動、擺動、前后來回運動和流動、噴射和流動。所述的寬體平錐底培養罐，其結構為其中所述寬體平錐底培養罐如圖l所示，其由三部分連接而成，上部有三個圓柱狀出口，出口為圓柱狀凸出于罐體并以左中右排列，中間出口大于兩邊出口；中部為圓柱狀罐體和上下部相連；下部為平底圓錐狀，圓錐底部為平面狀。，可以是玻璃材料、塑料材料、金屬材料制成的。所述寬體平錐底培養罐，罐中可有一滾動的多層轉盤可轉動，能增加培養基中的溶解氧。所述寬體平錐底培養罐用于生產克隆細胞的皮實性篩選。本發明的方法，也可以在一種可調速自轉型的圓形的罐體中進行，能夠前后運動，能夠做擺動運動。在罐體內部設計有轉軸能使培養基隨罐體轉動而運動,使得培養基在轉動時上移至罐體的上端并不時地降落于罐體的最下端，確保培養基的附加運動。圖la為寬體倒置平錐底懸浮動物細胞培養罐實體圖圖lb為寬體倒置平錐底懸浮動物細胞培養罐設計圖(這是技術部定的10升罐體另件圖2005.7.19)圖2a為光度計D0/pH片狀傳感器探測技術圖解圖2b為光度計D0/pH片狀傳感器探測系統圖3:為搖床上工作的倒置平錐底150ral工作體積培養罐圖4:為用空氣泵給培養基在靜態狀態下通氣以增加溶氧水平圖5a,圖5b，圖5c,圖5d，為不同時相培養液沖刷罐壁的圖相圖6a,圖6b，為轉鼓培養和斜置的培養平面圖7:為用倒置的平錐底的塑料管(直徑3cm)來懸浮培養CHOK細胞，用恒定100%的溶氧，在可調的搖床上培養4天細胞密度很容易達到2Mpcv.這就形成了一種有效的微型生物反應器系統，可用于細胞克隆高耐性篩選。圖8a為圓形的自轉型生物反應器，前后運動使培養液混合圖8b為圓形自轉型生物反應器，置于搖床上使培養液混合圖8c為錐形自轉生物反應器，內部設計了軌道圖9a為倒置的平錐底10升罐底架，用于塑料培養袋的托架。(10升改進外罐體-鐵板主視圖)圖9b為倒置的平錐底10升罐底架圖10a為常用的光度計細胞克隆高耐力篩選和過程優化高通量微型生物反應器系統8圖10b為倒置平錐底多管搖瓶型的反應器，用于細胞株高耐力的篩選具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發明，但不作為對本發明的限制。實施例l:研究150ml工作體積的倒置寬體平錐底培養罐的批式培養利用小規模150ml搖瓶批式培養表達TNFR2-Fc-IL-lra的CHO細胞，在無血清培養液B001中培養8天，用光度計溶氧探頭傳感檢測系統(圖2a,b)每天對溶氧進行測定，除了利用光度計溶氧探頭傳感檢測系統外，用手提式pH計進行檢測pH(圖2b),葡萄糖采用葡萄糖計來測量(圖2b)。表3清晰地表明平錐底培養罐對優化溶氧、細胞密度和外源蛋白產量是非常理想的。表3:在150ml工作體積的平錐底罐中批式培養的D0、pH、葡萄糖、混合速度和溫度數值<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例2:制作一次性塑料細胞培養袋，置于平錐底罐架上設計并制作了倒置的平錐底細胞反應器架和軟的塑料袋(圖9a，b)，設計的這些托架和袋置于可調運動幅度的搖床上。這種設計的平錐底罐在可調運動幅度的搖床上搖動以使培養液盡可能高地爬壁運動，盡可能容易地增加溶氧水平，以滿足高密度細胞培養對氧氣的需求。制作了3升、IO升、20升、40升、IOO升、500升和1000升大小的托架和塑料袋模型來做測試。目的是制造更有效的低剪切力的一次性使用的動物細胞反應器，用于研究開發和工業化生產使用。實施例3:設計搖動式的可裝有多個平錐底瓶的多孔板，用于高通量篩選高滴度的高皮實的細胞克隆生產細胞株的高皮實性對特定蛋白藥物的最終表達量和產業化放大過程中的穩定性至關重要，從成千上萬的細胞克隆中篩選到的高表達細胞株，只有一些細胞株比較皮實，能滿足工業化生產對細胞的要求，這些篩選到的較皮實的細胞株能高密度生長較長時間，并比最初篩選到的細胞克隆的表達滴度高10倍多。常用的用于細胞株皮實性篩選的小型生物反應器系統(www.flurometrix.com)對于高密度細胞培養不是最優化的，并且不能優化溶氧水平支持高密度細胞的生長。因此，它不具有篩選高皮實性細胞克隆的能力，如果沒有充足的培養液溶氧，無法優化高密度細胞的批式培養。這種設計的多瓶孔板，置于搖床上，能提供充足的溶氧，主要是由于搖動和平錐底的搖瓶，能支持高密度細胞的生長，因此，能夠在高密度細胞培養條件下篩選特定細胞株的最高表達能力，并能從低皮實性細胞克隆中分離出較皮實的細胞克隆，這種系統易于操作，而且成本低。實施例4:增加培養液中的溶氧并結合有效的混合運動來設計更有效的生物反應器根據前面做的轉鼓實驗(圖6a，b)，發現了一種增加動物細胞培養液中溶氧的方法。并據此設計了轉動式的生物反應器(圖8a，b，c)，圖8a顯示的是一個球型的自轉生物反應器，通過反復地沖冼暴露于罐內壁表面的空氣。這種轉動有利于增加培養液中的溶氧以支持高密度細胞的生長。自轉中前后運動使得培養液能更好的混合(圖8a)，所有這些都有利于支持優化懸浮細胞的培養。圖8b顯示的是一個球型的自轉生物反應器，這種自轉運動可以通過反復的沖冼暴露于罐內壁表面的空氣來增加溶氧水平以支持高密度細胞的生長。自轉中水平面的搖動使得培養液能很好的混合，這些都支持優化懸浮細胞的培養。圖8c顯示的是一種錐型的自轉生物反應器，這種自轉運動可通過反復的沖冼暴露于罐內壁表面的空氣來增加培養液中的溶氧水平，而罐內設計的軸在自轉過程中可使培養液運動至最上端，并回到最下端，這種附加的運動有助于自轉過程中培養液的混合，這些都有利于懸浮細胞的培養。10權利要求1.一種利用運動使罐體中細胞培養液反復沖刷光滑的罐體內表面能增加動物細胞懸浮培養液中溶解氧的方法，以此方法用于動物細胞培養，該方法包括以下步驟步驟1將細胞培養液置于具有光滑表面的寬體平錐底培養罐中；步驟2使培養液在寬體平錐底培養罐運動；其中所述寬體平錐底培養罐如圖1所示，其由三部分連接而成，上部有三個圓柱狀出口，出口為圓柱狀凸出于罐體并以左中右排列，中間出口大于兩邊出口；中部為圓柱狀罐體和上下部相連；下部為平底圓錐狀，圓錐底部為平面狀。也可如圖9示，做成一個一次性的塑料袋用作細胞培養的反應器，置于用金屬或塑料材料做的寬體錐底托架中用于細胞培養。2.權利要求l的方法，所述運動包括培養液穿過暴露于空氣的光滑培養罐表面的重復沖刷運動；或者培養罐的自轉運動，使細胞培養基不斷穿過暴露空氣或氧氣的光滑培養罐的上壁；或者，暴露于空氣或氧氣的自轉多層圓盤不斷地在培養基中轉動。3.權利要求2的方法，所述運動包括下述運動搖動、滾動、轉動、擺動、前后來回運動和流動、噴射和流動。4.權利要求2的方法，其中所述細胞培養罐，也可以是一種可調速自轉型的圓形的罐體，能夠前后運動。5.權利要求2的方法，其中所述細胞培養罐，也可以是一種自轉型圓形的罐體，能夠做擺動運動。6.權利要求2的方法，其中所述細胞培養罐，也可以是一種自轉型圓形的罐體，在罐體內部設計有轉軸能使培養基隨罐體轉動而運動，使得培養基在轉動時上移至罐體的上端并不時地降落于罐體的最下端，確保培養基的附加運動。7.權利要求2的方法，其中所述細胞培養罐，罐中有一滾動的多層轉盤可轉動，能增加培養基中的溶解氧。8.多孔架板上的平錐底形小體積的瓶形細胞培養瓶用于生產克隆細胞的皮實性篩選。9.權利要求l的方法，所述的光滑表面的寬體平錐底培養罐的表面材質包括玻璃材料、塑料材料、金屬材料。10.權利要求l的方法，一次性使用塑料袋，呈寬體平錐底狀，適用于平錐底型的生物反應器托，罐托呈平錐形底，適用于一次性使用的寬體平錐底塑料培養袋。全文摘要本發明涉及一種生產有效生物反應器的方法，該方法包括在本發明描述的生物反應器中培養動物細胞，通過反應器的器壁和細胞之間的摩擦增加動物細胞懸浮培養液中溶氧的方法。文檔編號C12N5/06GK101469319SQ200710002830公開日2009年7月1日申請日期2007年2月1日優先權日2007年2月1日發明者冷國慶,惠覓宙,李會成申請人:杭州安普生物工程有限公司