專利名稱：基因修飾的間充質干細胞眼內移植修復視網膜損傷的方法
技術領域：
本發明涉及一種通過pcDNA基因載體體外轉導神經營養因子基 因，促使眼內移植的骨髓間充質干細胞向視網膜神經細胞分化，同時 特異性分泌神經營養因子和大量相關生長因子，營養、支持周圍視網 膜神經細胞的方法。
技術背景在細胞的分化過程中，細胞往往由于高度分化而完全失去了再分 裂的能力，最終衰老死亡。機體在發展適應過程中為了彌補這一不足， 保留了一部分未分化的原始細胞，稱之為干細胞(stemcell)。 一旦 生理需要，這些干細胞可按照發育途徑通過分裂而產生分化細胞。即 干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞。骨髓間充質干細胞 (mesenchymal stem cells, MSCs)就是其中之一。在體內、夕卜不同' 條件下，MSCs可以定向地被誘導分化為中胚層來源的細胞如成骨細 胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞、肌腱細胞，還可跨胚層向內 胚層和神經外胚層的神經元及神經膠質細胞分化。有研究表明MSCs 能分泌某些神經營養因子如腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)禾口神經生長因子(neurotrophin, nerve growth factor, NGF)，此外MSCs分化的神經元樣和星形膠質樣細胞可 能也分泌生長因子。星形膠質細胞也產生許多生長因子，包括神經營 養素家族所有成員如NGF、 BDNF、睫狀神經營養因子(CiliaryNeurotrophic Factor, CNTF)和成纖維細胞生長因子(Basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)等，這些細胞因子能夠促進中樞 神經元細胞的增殖和分化。NGF是神經元存活、生長、分化所必需的一類分泌性蛋白質，其中 最具代表性的是BDNF。BDNF能促進若干種離體培養的神經元存活和突 起生長；在體內能阻止某些神經元的程序性死亡。視覺系統中視網膜 節細胞層(GCL)的無長突細胞和節細胞都能表達BDNF的mRNA，并具有 BDNF受體，但BDNF的合成主要是在大腦皮質和海馬區。研究發現視神 經橫斷后，眼內注入BDNF能挽救大量的節細胞免于凋亡。 當代基因工程提供了各種載體，可將核酸片段導入細胞中表達。其中 脂質體基因載體是較為廣泛和安全的一種。該載體可將外源基因整合 到靶細胞中，使目的基因在靶細胞中穩定表達。已經有實驗證明。因此，利用pcDNA將BDNF基因導入MSCs，這種重組了BDNF基因的 MSCs植入眼底后，由于BDNF的作用，較未經基因修飾的MSCs可提高眼 內存活能力及向視網膜神經細胞分化的比例，同時大量旁分泌的BDNF 因子和相關生長因子，可以營養、支持周圍的視網膜神經細胞，特別 是一些病變組織及周圍細胞。因此本方法可以為將來干細胞治療青光 眼、視網膜色素變性、視神經挫傷及老年黃斑變性、糖尿病引起的視 網膜病變等視網膜眼底疾病提供來源充足、可取自自體的種子細胞， 以及使種子細胞能更好地發揮補充受損視網膜神經細胞，維持、保護 殘存視網膜神經細胞作用的新方法。另外，轉導某些缺陷基因或治療 基因，在提外對MSCs進行功能激活和調控，將其作為基因治療的載體;利用MSCs在體內的靶向性，還可將載有目的基因的MSCs用于治療遺傳 性神經病和神經系統其他疾病，同時為與之相關的藥物開發和篩選提 供了一種新的模型。 發明內容本發明的目的是提供一種基因修飾的間充質干細胞眼內移植修復 視網膜損傷的方法。通過自制的重組人類BDNF基因的脂質體，將BDNF 基因導入MSCs，經篩選獲得重組了BDNF基因的MSCs (BDNF-MSCs)， 將BDNF-MSCs植入眼底，在自分泌的BDNF誘導下定向分化為視網膜 神經細胞，并特異性分泌BDNF因子和相關生長因子修復視網膜損傷 的方法。采用以下技術方案 一種基因修飾的間充質干細胞眼內移植 修復視網膜損傷的方法，其特征在于移植前在體外用外源性神經營養 因子對間充質干細胞進行基因修飾。所述的基因修飾的間充質干細胞眼內移植修復視網膜損傷的方 法，其特征在于所述的外源性神經營養因子為人腦源性神經營養因子 基因。所述的基因修飾的間充質干細胞眼內移植修復視網膜損傷的方 法，其特征在于通過脂質體將外源性神經營養因子基因導入間充質干 細胞。所述的基因修飾的間充質干細胞眼內移植修復視網膜損傷的方 法，其特征在于重組質粒以特定的濃度、時間感染間充質干細胞，從 而使外源基因在間充質干細胞內穩定表達。所述的基因修飾的間充質干細胞眼內移植修復視網膜損傷的方法，其特征在于通過以特定的劑量和頻率注射干細胞動員劑，從外周 血中提取間充質干細胞。機體注入干細胞動員劑，動員骨髓干細胞到達外周血中，提取MSCs，利用梯度離心和反復貼壁的方法進行培養純化。從人血白細胞 中克隆出人BDNF的DNA片段，構建pcDNA-hBDNF。以重組BDNF基因的脂 質體感染MSCs，通過耐要藥基因篩選，使BDNF在MSCs內穩定表達。本 發明能夠在通過高效轉導使外源性基因在MSCs中穩定表達的同時，保 持MSCs在體內、外的多分化潛能和其他干細胞的生物特性。本發明的另一個主要內容是通過特定的細胞密度和注射方式使 BDNF-MSCs在眼內分化為視網膜神經細胞，同時通過特異性分泌BDNF因子和相關生長因子營養、支持周圍視網膜神經細胞。通過多焦視網 膜電生理可以證明BDNF-MSCs移植組與單純MSCs移植組和生理鹽水組 比較修復情況均有顯著提高(P〈0.01)。在一個月的時間點由為突出。 本發明的內容未公開發表，本領域的技術人員如不花費創造性勞 動根本不能根據現有的技術推斷得到本發明的基因轉導及眼底移植 的關鍵技術方法。
具體實施方式
實施例(一)、外周血動員的MSCs提取與純化每只兔皮下注射重組人粒細胞刺激因子(rhG-CSF) 10Pg/kg， 一 天兩次，連續注射5天。心臟取血10ml/只，用肝素化的無菌注射器 抽吸血液與PBS液1: l混勻，輕輕鋪于等量的淋巴細胞分離液上(相對密度1. 077) ， 1000g/min離心25min。吸取骨髓單個核細胞存在層， 加入PBS液洗滌3次。取骨髓單個核細胞1X107ml，接種于75ml 培養瓶中恒溫培養。于第二天換液，以后每3 4天換液。觀察細胞 達80%融合后，加入1 : 1的2. 5g/L胰蛋白酶和0. 2g/L EDTA混合液 消化，終止消化后，將上述篩選出來的MSCs重新接種至兩個75ml 培養瓶中，反復傳代、擴增、純化，傳至第4代流式細胞儀鑒定CD34(-)，CD45 (-)，和CD105(+)。(二)、重組pcDNA—hBDNF表達載體的構建根據NCBI Sequence (BC029795)hBDNF基因序列，設計引物5' gca agc tta tga cca tcc ttt tcc 3，(下戈機為Hind II聰切位點)； 5， get cta gat ctt ccc ctt tta atg 3'(下劃線為Xba I酶切位點)。 PCR技術克隆BDNF基因序列。真核表達載體pcDNA3. 1/myc-His (B) 和PCR特異性擴增產物分別用限制性內切酶Hind III和Xbal進行消 化，消化后的載體與hBDNF基因片段以1 : 3的摩爾數比混合，加5U 的T4連接酶，16"C反應16h。反應產物用CaCl2熱休克法轉化感受態 DH5 a菌。轉化菌涂布于含100 u g/ml氨芐青霉素的LB固體平板培養 基，挑取菌落，用限制性內切酶Hind III和Xba I酶切提取的質粒， 然后進行測序分析如下ATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTTGGTTGCA TGAAGGCTGCCCCCATGAAAGAAGCAAACATCCGAGGACAAG GTGGCTTGGCCTACCCAGGTGTGCGGACCCATGGGACTCTGGA GAGCGTGAATGGGCCCAAGGCAGGTTCAAGAGGCTTGACATCATTGGCTGACACTTTCGAACACATGATAGAAGAGCTGTTGGATGA GGACCAGAAAGTTCGGCCCAATGAAGAAAACAATAAGGACGC AGACTTGTACACGTCCAGGGTGATGCTCAGTAGTCAAGTGCCTT TGGAGCCTCCTCTTCTCTTTCTGCTGGAGGAATACAAAAATTAC CTAGACGCTGCAAACATGTCCATGAGGGTCCGGCGCCACTCTG ACCCTGCCCGCCGAGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAG TGAGTGGGTAACGGCGGCAGACAAAAAGACTGCAGTGGACAT GTCGGGCGGGACGGTCACAGTCCTTGAAAAGGTCCCTGTATCA AAAGGCCAACTGAAGCAATACTTCTACGAGACCAAGTGCAATC CCATGGGTTACACAAAAGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAA GGCATTGGAACTCCCAGTGCCGAACTACCCAGTCGTACGTGCG GGCCCTTACCATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCA TAAGGATAGACACTTCTTGTGTATGTACATTGACCATTAAAAGG GGAAGAT (三)、通過脂質體轉導BDNF基因制備溶液A:取10 u g重組質粒pcDNA—hBDNF溶于100 y 1無血 清、無抗生素的DMEM培養基。同時制備溶液B:將20 ul Lipofectamine稀釋于80 u 1無血清、無抗生素的DMEM培養基。混 合A、 B液體室溫靜置15分鐘后，加0. 8ml無血清、無抗生素的DMEM 培養基中。棄去六孔板中的培養基，并將lmlA、 B混合液加入六孔板 中，37° C、 5%0)2條件下培養8小時。棄轉染液，加入2ml完全培養 基，繼續培養。ELISA測定轉染后24小時、48小時、72小時、96小時間充質干細胞培養上清在450nm處的吸光度，確定hBDNF表達的相 對含量隨時間增加hBDNF表達量增高，72小時達到高峰。間充質 干細胞培養上清經蛋白純化柱HisTrapHP過柱純化后，進行 Western-blot檢測hBDNF蛋白的表達，得到分子量約為12. 3KD的單 一陽性條帶。(四)、兔視網膜移植BDNF-MSCs修復視網膜損傷烏拉坦5ml/kg耳緣靜脈注射青紫藍兔，麻醉后行玻璃體切割手 術，去除玻璃體及后界膜后，于視乳頭下方6-8PD位置，氬激光能量 0.2W，暴光時間O. 15S，光斑直徑50um，每光斑間距100um，造成4 X6排列，共24個激光斑。角膜緣平坦部進針，緩慢推針l誦/rain，射 BDNF-MSCsl07m10. 5ml。結果細胞移植后7、 14、 30天觀察眼壓，B 超結果，證明其安全性(P<0.05)。比較各個時間點的眼底照影和病 理切片和多焦ERG統計學分析，可以證明BDNF-MSCs移植組與單純MSCs 移植組和生理鹽水組比較修復情況均有顯著提高(P<0.01)。在一個 月的時間點由為突出。
權利要求
1、一種基因修飾的間充質干細胞眼內移植修復視網膜損傷的方法，其特征在于移植前在體外用外源性神經營養因子對間充質干細胞進行基因修飾。
2、 按照權利要求1所述的基因修飾的間充質干細胞眼內移植修復 視網膜損傷的方法，其特征在于所述的外源性神經營養因子是人腦源 性神經營養因子基因。
3、 按照權利要求1或2所述的基因修飾的間充質干細胞眼內移植 修復視網膜損傷的方法，其特征在于通過脂質體將外源性神經營養因 子基因導入間充質干細胞。
4、 按照權利要求1或2所述的基因修飾的間充質干細胞眼內移植 修復視網膜損傷的方法，其特征在于重組質粒以特定的濃度、時間感 染間充質干細胞，從而使外源基因在間充質干細胞內穩定表達。
5、 按照權利要求1所述的基因修飾的間充質干細胞眼內移植修復 視網膜損傷的方法，其特征在于通過以特定的劑量和頻率注射干細胞 動員劑，從外周血中提取間充質干細胞。
全文摘要
本發明涉及基因修飾的間充質干細胞眼內移植修復視網膜損傷的方法。技術方案用干細胞動員劑將間充質干細胞動員到外周血中，用自身的生物學特性分離、擴增、純化間充質干細胞；從人血白細胞基因組中克隆人腦源性神經營養因子序列，構建重組人腦源性神經營養因子的pcDNA表達載體，將腦源性神經營養因子基因導入間充質干細胞；制作視網膜激光損傷模型；通過玻璃體及后界膜切除后，將腦源性神經營養因子基因修飾的間充質干細胞植入眼底。在間充質干細胞的分化和腦源性神經營養因子的特異性表達下，視網膜損傷部位的修復程度顯著提高。本發明可以明顯修復視網膜損傷，提高干細胞移植的應用價值，為基因、干細胞治療視網膜疾病提供了新的技術。
文檔編號C12N5/10GK101333542SQ200710011839
公開日2008年12月31日 申請日期2007年6月25日 優先權日2007年6月25日
發明者何星儒 申請人:何星儒