專利名稱：人源肝星狀細(xì)胞激活相關(guān)蛋白治療肝臟疾病的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種人源肝星狀細(xì)胞激活相關(guān)蛋白的醫(yī)藥用途，即其可以用于治療肝臟疾病的用途。
背景技術(shù)：
肝星狀細(xì)胞激活相關(guān)蛋白(Stellate cell activation-associated protein STAP)是在大鼠肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的，與肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)激活密切相關(guān)的蛋白。在HSC激活過(guò)程中它有明顯的上調(diào)表達(dá)(見Biol Chem.2001，276(27)25318-25323)。通過(guò)同源比對(duì)，在人的肝臟基因組中又發(fā)現(xiàn)了人源肝星狀細(xì)胞激活相關(guān)蛋白(human Stellate cell activation-associated protein hSTAP)，其核苷酸序列參見GENEBANK中的AB057769。免疫組化研究顯示，hSTAP的mRNA在人的腦、心臟、肝臟、腎臟等組織細(xì)胞中都有不同程度的表達(dá)(見Biochim Biophys Acta.2002，1577471-475)。但hSTAP的治療功能未見文獻(xiàn)報(bào)道。
目前認(rèn)為，HSC在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起主導(dǎo)作用。正常肝臟中HSC處于靜息狀態(tài)，增殖活性很低，肝損傷及各種慢性肝病時(shí)HSC被激活，表型發(fā)生改變由靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橐菩屑?xì)胞，然后轉(zhuǎn)分化肌成纖維樣母細(xì)胞，合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)上調(diào)，同時(shí)合成和釋放大量基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子(TIMPs)，使間質(zhì)膠原酶等蛋白酶活性降低，ECM降解減少，最終導(dǎo)致ECM積聚而發(fā)生肝纖維化乃至肝硬化。肝星狀細(xì)胞活化是肝纖維化形成的關(guān)鍵。
國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)肝纖維化的可逆性已無(wú)異議。鑒于HSC在肝纖維化發(fā)病機(jī)制中的主導(dǎo)作用，大多數(shù)抗肝纖維化研究都以HSC為靶標(biāo)。通過(guò)對(duì)抗氧化應(yīng)激，抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子的活性，干擾細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑抑制HSC增殖、活化，誘導(dǎo)HSC凋亡，均可呈現(xiàn)良好的抗肝纖維化效應(yīng)。
大量基礎(chǔ)和臨床研究都顯示反應(yīng)性氧(ROS)和細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化與肝纖維化發(fā)生有關(guān)，這表明氧應(yīng)激是不同病因慢性肝病共同的發(fā)病因素。有研究從基因水平證實(shí)脂質(zhì)過(guò)氧化可刺激HSC合成I型膠原，而且細(xì)胞色素P450 2E1來(lái)源的氧化物可促進(jìn)HSC的增殖和膠原的合成。最近有研究表明，黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生的ROS能促進(jìn)HSC的增殖，此促進(jìn)作用與基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的激活和表達(dá)有關(guān)，而且在大鼠肺和皮膚成纖維細(xì)胞以及心肌成纖維細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)氧應(yīng)激可調(diào)節(jié)MMP-2的表達(dá)。由此認(rèn)為，氧應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化可通過(guò)不同的機(jī)制促進(jìn)HSC的增殖。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人對(duì)hSTAP進(jìn)行了重組表達(dá)，建立了rhSTAP的制備方法，鑒定了rhSTA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，研究了rhSTAP的抗氧化活性以及對(duì)氧化損傷的肝星狀細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果顯示rhSTAP具有抗氧化的生物活性，并且對(duì)Fe-NTA造成的肝星狀細(xì)胞的氧化損傷具有保護(hù)作用，并通過(guò)緩解Fe-NTA對(duì)肝星狀細(xì)胞造成的氧化損傷，抑制了肝星狀細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制了HSC的活化。因此，它具有防治肝臟疾病的功能，特別可用于防治肝硬化和肝纖維化。
本發(fā)明通過(guò)RT-RCP的方法獲得hSTAP的cDNA；選擇合適的載體，高效表達(dá)重組人源肝星狀細(xì)胞激活相關(guān)蛋白(recombinant human Stellate cell activation-associated proteinrhSTAP)；建立rhSTAP分離、純化、復(fù)性的方法；研究rhSTAP的生物活性及對(duì)氧化應(yīng)激的肝星狀細(xì)胞的保護(hù)作用。
hSTAP cDNA的獲取方法，其步驟是1、設(shè)計(jì)PCR引物primer 1(5’-GTCCATGGAGAAAGTGCCAGGCGAGA，NcoI site is underlined)and primer 2(5’-CTAAGCTTCTACGGCCCCGAAAGGG，HindIII site is underlined)；2、提取Hep G2細(xì)胞的總RNA，利用RT-PCR的方法，獲得rhSTAP的cDNA，見圖1；3、PCR條件(94℃1分鐘；60℃；1分鐘；72℃1分鐘；30個(gè)循環(huán))。
rhSTAP高效表達(dá)方法的建立，其步驟是1、將hSTAP cDNA經(jīng)過(guò)NcoI、HindIII酶切，克隆到載體pET-28a的表達(dá)區(qū)，構(gòu)建載體pET-28a-hSTAP；2、轉(zhuǎn)化到宿主菌Escherichia coli BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。
3、搖瓶篩選表達(dá)水平最高的菌株保存菌種。
4、利用5L自動(dòng)發(fā)酵罐進(jìn)行表達(dá)，LB培養(yǎng)基，接種量1％，溶氧量30％，()D達(dá)到0.6添加IPTG(作用濃度1mM/L)，培養(yǎng)6h，離心收集菌體，SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)水平，見圖2。
結(jié)果顯示rhSTAP獲得了高效的表達(dá)，占菌體總蛋白的30％以上。
rhSTAP的制備方法，其步驟是1、rhSTAP以包含體的方式存在。在4℃，5000rpm離心15min收集菌體，然后重懸于緩沖液I中(20mM Tris-HCl pH8.0，500mM NaCl and 0.1％ Triton X-100)；2、菌體利用超聲波進(jìn)行破碎，4℃，15000rpm離心15min收集包含體沉淀；
3、包含體用緩沖液I重懸、洗滌3次；4、然后用溶解液(20mM Tris-HCl pH8.0，150mM NaCl，20mM DTT，8M urea)溶解6小時(shí)以上；4℃，15000rpm離心15min收集上清液；5、將上清液在Sephadex G-25層析柱中復(fù)性與純化，上柱量小于10％柱床體積，用緩沖液II(20mM Tris-HCl，pH8.0)進(jìn)行洗脫，流速8cm/h；6、UV280nm紫外檢測(cè)，收集第一個(gè)洗脫峰；7、洗脫液經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，保存于4℃(一周以內(nèi))或凍干保存。
8、檢測(cè)復(fù)性后的rhSTAP的生物穩(wěn)定性見表1表1.復(fù)性后rhSTAP穩(wěn)定性的檢驗(yàn)

結(jié)果顯示，采用該制備方法，rhSTAP的收率可以達(dá)到100mg/L培養(yǎng)基，純度大于90％，復(fù)性后具有生物活性且性質(zhì)穩(wěn)定。
rhSTAP一級(jí)結(jié)構(gòu)的鑒定方法，其步驟是1、復(fù)性后的rhSTAP利用Resource RPC柱(Global)進(jìn)行反向質(zhì)譜純化，流動(dòng)相為A液(2％乙腈，0.05％三氟乙酸)、B液(98％乙腈，0.05％三氟乙酸)，利用質(zhì)譜儀AKTA explorer(Pharmacia Biotech)進(jìn)行洗脫、收集和結(jié)果分析，見圖3。
2、rhSTAP的分子量利用MALDI-TOF-MS(matrix-assisted laser desorption ionizationtime of flight mass spectrometry)檢測(cè)，見圖4。
3、rhSTAP的N-terminal氨基酸序列利用儀器Protein N-terminal Sequencer(ABI491LCPE).用HPLC的方法檢測(cè)，見圖5。
4、rhSTAP的C-terminal氨基酸序列利用儀器Protein C-terminal Sequencer(LTQFinnigan)用tandem mass spectrometry的方法檢測(cè)，見圖6。
結(jié)果顯示，rhSTAP經(jīng)過(guò)RPC純化后，純度大于95％，分子量為21429，N-terminal 10個(gè)氨基酸序列為NH2-M-E-K-V-P-G-E-M-E-I，C-terminal 23個(gè)氨基酸序列為E-V-G-W-V-Q-Q-V-P-N-A-T-T-P-P-A-T-L-P-S-S-G-P，均與理論值吻合。
本發(fā)明公開了rhSTAP具有抗氧化的生物活性及活性檢測(cè)方法，其步驟為將復(fù)性后的rhSTAP用總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所NJBI)檢測(cè)。結(jié)果見圖7，圖7顯示，rhSTAP具有明顯的抗氧化活性，根據(jù)試劑盒的計(jì)算方法，抗氧化活性為80.0±3.0U/mg。
本發(fā)明研究了rhSTAP的生物活性及對(duì)氧化應(yīng)激的肝星狀細(xì)胞的保護(hù)作用，見實(shí)施例部分。試驗(yàn)結(jié)果表明rhSTAP通過(guò)緩解Fe-NTA對(duì)HSC造成的氧化損傷，抑制了HSC的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制了HSC的活化。具體表現(xiàn)為改善了機(jī)體抗氧化損傷防御體系，脂質(zhì)過(guò)氧化程度減輕，膠原蛋白的合成減少。表明rhSTAP具有防治肝硬化及肝纖維化的應(yīng)用前景。


圖1是hSTAP cDNA的PCR結(jié)果(ADNA marker；Lane BhSTAP cDNA)圖2是rhSTAP在Escherichia coli BL21(DE3)中的表達(dá)(A蛋白質(zhì)分子量Marker；B菌體總蛋白；C菌體超聲波破碎后，離心分離得到的可溶性蛋白；D經(jīng)過(guò)Sephadex G-25層析柱復(fù)性、純化后的rhSTAP)圖3是rhSTAP利用質(zhì)譜純化后的結(jié)果圖4是rhSTAP分子量的測(cè)定圖5是rhSTAP N-terminal氨基酸序列的測(cè)定結(jié)果圖6是rhSTAP C-terminal氨基酸序列的測(cè)定結(jié)果圖7是rhSTAP抗氧化活性的檢測(cè)具體實(shí)施方式
實(shí)施例1MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的重要終產(chǎn)物之一，反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，可促進(jìn)I型膠原mRNA的表達(dá)，與HSC增殖和膠原合成密切相關(guān)；SOD是機(jī)體抗氧化損傷防御體系中最重要的抗氧化酶之一，反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。羥脯氨酸(Hyp)是構(gòu)成膠原纖維特異的氨基酸成分，膠原纖維主要由膠原蛋白構(gòu)成，而羥脯氨酸在膠原蛋白的含量較為穩(wěn)定，約為2.5％，在非膠原蛋白中的含量很低，甚至缺乏，所以羥脯氨酸常被認(rèn)為是膠原蛋白特有成份，肝組織細(xì)胞中Hyp的含量可較準(zhǔn)確地反映肝組織膠原纖維含量，因此，測(cè)定肝組織細(xì)胞中羥脯氨酸含量可間接反映肝細(xì)胞纖維化的程度。
具體試驗(yàn)過(guò)程
1、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠的肝星狀細(xì)胞，2.5g/L胰酶消化后，用含100mL/L胎牛血清的DMEM配成細(xì)胞懸液；2、以105接種于10塊6孔培養(yǎng)板，每孔加入DMEM培養(yǎng)液2ml，置于37℃，50mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；3、24h后細(xì)胞貼壁良好，換用含2mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，使其生長(zhǎng)同步化。
4、再培養(yǎng)24h后，設(shè)立5個(gè)組別，第一組為陰性對(duì)照，另外4組加入次氮基三乙酸鐵(Fe-NTA，終濃度200μmol/L)，并加入rhSTAP，終濃度分別為0μg/ml(模型組)、5μg/ml(低劑量組)、10μg/ml(中劑量組)、20μg/ml(高劑量組)；5、繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，采用丙二醛(MDA)試劑盒(NJBI)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(NJBI)、羥脯氨酸(Hyp)試劑盒(NJBI)分別檢測(cè)細(xì)胞與培養(yǎng)液中的MDA、SOD、Hyp。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2、3。
表2.rhSTAP對(duì)培養(yǎng)基中MDA、SOD、Hyp含量的影響

n＝12，x±s.ap＜0.01，bp＜0.05，與正常組相比；cp＜0.01，dp＜0.05，與模型組相比。
結(jié)果顯示1、對(duì)比正常HSC組，模型組培養(yǎng)基中MDA、SOD、Hyp的含量有明顯的差異，其中MDA、Hyp的含量升高，SOD的活力單位降低；2、對(duì)比模型組，rhSTAP低劑量組培養(yǎng)基中MDA、Hyp的含量變化不明顯，SOD的活力單位有明顯提高；3、對(duì)比模型組，rhSTAP中劑量組培養(yǎng)基中MDA、SOD、Hyp的含量有明顯的差異，其中MDA、Hyp的含量降低，SOD的活力單位升高；4、對(duì)比模型組，rhSTAP高劑量組培養(yǎng)基中MDA、SOD、Hyp的含量有明顯的差異，其中MDA、Hyp的含量降低，SOD的活力單位升高。
表3.rhSTAP對(duì)細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD、Hyp含量的影響


n＝12，x±s.ap＜0.01，bp＜0.05，與正常組相比；cp＜0.01，dp＜0.05，與模型組相比。
結(jié)果顯示1、對(duì)比正常HSC組，模型組細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD、Hyp的含量有明顯的差異，其中MDA、Hyp的含量升高，SOD的活力單位降低；2、對(duì)比模型組，rhSTAP低劑量組細(xì)胞內(nèi)Hyp、SOD的含量變化不明顯，MDA的含量有明顯降低；3、對(duì)比模型組，rhSTAP中劑量組細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD、Hyp的含量有明顯的差異，其中MDA、Hyp的含量降低，SOD的活力單位升高；4、對(duì)比模型組，rhSTAP高劑量組細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD、Hyp的含量有明顯的差異，其中MDA、Hyp的含量降低，SOD的活力單位升高。
結(jié)果顯示1、對(duì)比正常HSC組，模型組細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)基中MDA、SOD、Hyp的含量均有明顯的差異，其中MDA、Hyp的含量升高，SOD的活力單位降低；2、對(duì)比模型組，rhSTAP低劑量組細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)基中MDA、SOD、Hyp的含量變化不夠明顯；3、對(duì)比模型組，rhSTAP中、高劑量組細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)基中MDA、SOD、Hyp的含量均有明顯的差異，其中MDA、Hyp的含量降低，SOD的活力單位升高。
結(jié)果說(shuō)明了1、Fe-NTA對(duì)HSC造成了明顯的氧化損傷，具體表現(xiàn)為其中MDA、Hyp的含量升高，SOD的活力單位降低。
2、Fe-NTA對(duì)HSC造成的氧化損傷，通過(guò)氧化應(yīng)激的機(jī)制，引起了HSC的活化，促使HSC從靜息態(tài)向活化態(tài)的轉(zhuǎn)化，具體表現(xiàn)為破壞了機(jī)體抗氧化損傷防御體系，脂質(zhì)過(guò)氧化程度加重，膠原蛋白的合成增加。
3、rhSTAP可以明顯緩解Fe-NTA對(duì)HSC造成的氧化損傷，具體表現(xiàn)為其中MDA、Hyp的含量降低，SOD的活力單位升高。
4、rhSTAP通過(guò)緩解Fe-NTA對(duì)HSC造成的氧化損傷，抑制了HSC的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制了HSC的活化。具體表現(xiàn)為改善了機(jī)體抗氧化損傷防御體系，脂質(zhì)過(guò)氧化程度減輕，膠原蛋白的合成減少。
5、rhSTAP對(duì)HSC氧化損傷的保護(hù)作用有劑量依賴關(guān)系。濃度大于或等于10μg/mg，即有明顯的作用。
權(quán)利要求
1.人源肝星狀細(xì)胞激活相關(guān)蛋白或重組人源肝星狀細(xì)胞激活相關(guān)蛋白用于制備治療肝臟疾病藥物的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其中肝臟疾病是肝硬化。
3.權(quán)利要求1的用途，其中肝臟疾病是肝纖維化。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種人源肝星狀細(xì)胞激活相關(guān)蛋白的醫(yī)藥用途，即其可以用于制備治療肝臟疾病的藥物的用途。本發(fā)明還公開了其重組制備方法。
文檔編號(hào)C12N15/70GK101036781SQ20071002056
公開日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2007年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月12日
發(fā)明者吳梧桐, 魏威 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)