專利名稱：海州香薷金屬硫蛋白基因EhMT1的基因工程應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及海州香薷金屬硫蛋白基因^ M77的基因工程應用，屬于基因工程領域， 具體地講涉及植物重金屬脅迫應答的金屬結合蛋白。
背景技術：
金屬硫蛋白是生物界普遍存在的低分子量，富含半胱氨酸，具有金屬結合能力的蛋 白質(Cobbetteta1.，2003)。目前，已先后從至少38種植物中克隆了超過50個金屬硫蛋 白基因。研究結果表明細胞質內存在一些有機化合物，可以與重金屬離子螯合，降低細 胞質中重金屬的自由離子活度，從而對細胞原生質起保護作用(Clemens, 2001; HaII， 2002)，金屬硫蛋白就是其中一類可降低自由離子活度的多肽。金屬硫蛋白還參與氧化 脅迫、高鹽、低溫、熱激等非生物脅迫反應。對酵母及蠶豆此類MT基因的研究表明， 在花椰菜和擬南芥中過量表達MT顯著提高了植株的耐重金屬能力及對重金屬的積累 (Evans etal., 1992; Hasegawa et al.， 1997)。因此植物金屬硫蛋白對于改良植物重金屬耐 性及富集能力具有重要的應用價值。
海州香薷(￡/Wote& /^dz誇e"^)是唇形花科香薷屬植物，生長在中國長江流域 的銅礦區，為銅礦指示植物，其體內含銅量為102mg/kgDW (Tang, 1999)，具有重金屬 污染土壤植物修復的潛力。迄今為止尚無關于海州香薷金屬硫蛋白基因的功能描述。本 發明從海州香薷中鑒定了第1個與重金屬脅迫有關的金屬硫蛋白EhMTl，并研究了其與 重金屬脅迫的關系，提出了利用￡/zM77基因進行植物重金屬耐性及富集能力改良的方 法。
發明內容
技術問題本發明的目的在于公開一種耐銅植物——海州香薷金屬硫蛋白基因￡AM77 的基因工程應用，將該基因作為目的基因導入植物，提高植物耐重金屬及積累能力，以 進行植物重金屬耐性及富集能力的改良。
技術方案海州香薷金屬硫蛋白基因￡^Mn的基因工程應用，包括-1、海州香薷金屬硫蛋白基因五/jMT/的基因工程應用，包括 1)總RNA的提取
以海州香薷為實驗材料，待海州香薷幼苗長至7-8葉期后，用50pM CuS04進行處 理，48小時后立即取葉片置于液氮中冷凍保存，取部分葉片，用研缽研碎，加入盛有裂
解液的1.5ml離心管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內，勻槳后移至1.5ml離心管， 抽提總RNA;用甲整變性膠電泳鑒定總RNA—更量，然后在分光光度計上測定RNA含 量。
2) 海州香薷金屬硫蛋白基因五/i3/77的克隆
利用RT-PCR獲得海州香薷金屬硫蛋白基因片段，再利用RACE技術獲得海州香薷 金屬硫蛋白基因的5'末端和3'末端，將上述三條片段進行拼接全長序列，根據拼接的全 長序列設計兩端引物
引物P1: 5'-ACGTCGATCACTAAGAAAAG-3'
引物P2: 5 '-CTTAGACGCATAAACACGAA-3'
以步驟l)獲得的總RNA為模板，經反轉錄合成cDNA第一鏈后，進行PCR擴增， PCR程序如下94。C預變性4分鐘，94。C變性30s， 55°C復性lmin， 72°C延伸45min， 28個循環后，72。C7min，將PCR產物進行克隆、測序后獲得具有完整編碼區的海州香 薷金屬硫蛋白基因五/zM7V的cDNA序列。
3) 植物表達載體的構建
根據海州香薷金屬硫蛋白基因￡AMn的cDNA序列，見GenBank登錄號為 DQ059081的全長編碼序列，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物 弓I物P3: 5'- GTCTAGAAAGAAAATGTCGAGTGGA誦3' 引物P4: 5'- CCCGGGAGGCAGTATATCTGACAG -3'
并分別引入限制性內切酶位點，以歩驟2)中獲得的PCR擴增產物為模板，經PCR 擴增后，將五AM7V的cDNA克隆至中間載體pGEM-T，進一歩克隆到雙元表達載體
PBim。
4) 轉基因植株的獲得
將步驟3)獲得的表達載體轉入農桿菌，進一步轉入煙草，對獲得的轉基因植株進 行PCR、 RT-PCR驗證后進行植物的耐銅性評價，轉基因植株的To代和野生型煙草進行 50nMCuSO4的持續處理，觀察他們的生長表現，銅處理12天后的表現明顯優于野生型 的轉基因煙草植株即為獲得的耐銅轉基因植株。
有益效果
1、 本發明將來自海州香薷(五Mote/a/^c/zowe肌;y)的金屬硫蛋白基因￡M^77，作為目 的基因導入植物，提高植物對重金屬的耐性，以進行重金屬耐性及富集植物的改良， 所編碼的蛋白質具有重金屬結合功能。
2、 本發明人提供的^ M77基因功能是參予植物重金屬脅迫應答反應，mRNA表達分析 表明￡/7M77基因在50|liM CuS04誘導條件下表達增強。
3、 本發明涉及的E/ Mn基因來自海州香薷，具有適合于煙草、擬南芥等雙子葉植物表 達的優化密碼子，其基因工程受體植物除雙子葉植物，如花椰菜、煙草、蠶豆等之
夕卜，還適合于水稻、玉米等單子葉植物。 4、利用K&M77基因作為—目的基因構建植物表達—載體T其中可用'fr(5J—種啟動子例如花 椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子、Ubiquitin啟動子或其它啟動子，該表達載體中 必要時可包括增強子，不論是轉錄增強子或翻譯增強子。為了簡化轉化細胞的鑒定 可使用選擇性標記包括對抗生素抗性的酶，也可利用顏色變化(例如卩-葡糖醛酸糖 苷酶GUS)或發光(例如熒光素酶)來識別的化合物的酶類，也可用無標記選擇。 所用的表達載體可使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體等。轉化方法可用農桿菌介 導、基因槍或電擊等方法轉化植物。
圖l銅脅迫下野生型(WT)及轉五/z似77基因煙草(#20)植株生長情況
具體實施方式
實施例1
采自銅礦區的海州香薷種子，待海州香薷幼苗長至7-8葉期，用5(HiMCuS04進行 處理48小時后，立即取葉片置于液氮中冷凍保存。取部分葉片，用研缽研碎，加入盛 有裂解液(購自北京天根公司)的1.5ml離心管中，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內。 勻槳后移至1.5ml離心管中，抽提總RNA。用甲酸變性膠電泳鑒定總RNA質量，然后 在分光光度計上測定RNA含量。以RT-PCR及RACE擴增的三條片段進行序列拼接得 到全長序列，根據此序列設計兩端引物
引物P1: 5 '-ACGTCGATCACTAAGAAAAG-3'
引物P2: 5'-CTTAGACGCATAAACACGAA-3'
采用RT-PCR方法進行全長cDNA擴增，PCR程序如下94。C預變性4分鐘，94°C 變性30s， 55。C復性lmin， 72°C延伸45min， 28個循環后，72°C 7min，將PCR產物進 行克隆、測序后獲得具有完整編碼區的海州香薷金屬硫蛋白基因^ MT7的cDNA序列； WM77的cDNA序列GenBank登錄號為DQ059081及編碼的氨基酸序列GenBank登錄 號為AAY57923。
BLAST的結果證明從海州香薷中新得到的基因確為一個編碼MT基因。本發明涉及 的功能基因E/iM77為海州香薷中的首次報道，與重金屬結合有關的MT基因，有望應用 于植物重金屬耐性及富集能力的抗逆遺傳改良。
5M^77全長581bp，其開放閱讀框位于61-286處。DNAssist軟件分析表明￡AM77 共編碼74個氨基酸，其中N-端和C-端含有2個典型的富含Cys區域，分別按照 CXCXXXCXCXXXCXC和CXCXXXCXCXXCXC的基序排列。經Blast程序比較發現， 五/ MT7編碼蛋白與M/ww/^gw加^f (溝酸漿屬植物)MT1的氨基酸相似性最高為75%。
使用Compute pI/MW軟件估算其pl=5.13 ， MW=7.14kDa。
用實施例1中設計的^2iW7兩端引物進行半定量RT-PCR分析海州香薷幼苗地上部 與地下部的表達，以海州香薷MSWM4基因(Sancen加eta1.,2003)的表達為內參。結 果表明，海州香薷幼苗￡AM77的表達在50nM CuS04處理下48小時達到最高。 實施例3
根據實例1得到的WM77的全長序列，設計擴增完整編碼框的引物P3和P4，序列如下 引物P3: 5'- GTCTAGAAAGAAAATGTCGAGTGGA -3' 引物P4: 5'- CCCGGGAGGCAGTATATCTGACAG -3'
并分別引入限制性內切酶位點，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物 為模板，經PCR擴增后，將五WWI7的cDNA克隆至中間載體pGEM-T，進一步克隆到 雙元表達載體pBI121，在保證閱讀框正確的前提下鑒定表達載體，再將其轉入農桿菌中， 繼而轉入煙草。待獲得的轉基因植株進行PCR以及RT-PCR驗證后進行植物的耐重金屬 評價。即將轉基因植株的To代和對照植株進行50nMCuS04的持續處理，觀察他們的生 長表現，結果表明轉基因煙草50)^MCuSO4處理12天后的表現明顯優于對照組。野生型 植株比未進行銅處理的對照植株干重降低了 37%;而轉基因植株的生長并未受到抑制， Cu處理反而促進植株生長，干重是對照植株的1.7倍(圖l)。
上述實施例1表明本發明克隆的海州香薷金屬硫蛋白基因五hMH，為海州香薷中首 次克隆的￡/ M77基因，此類基因在海州香薷中的功能迄今未經描述。實施例2表明該基 因與植物的重金屬脅迫密切相關。此類基因由于來源于耐銅植物，與其它來源的金屬硫 蛋白基因相比，更加適合于植物耐重金屬及富集能力的遺傳改良。
mRNA表達分析表明￡Wkf77主要在海州香薷根、葉片中表達，在莖中檢測不到表 達；而且50pM CuS04的處理增強了五Mi7V的表達。轉基因研究表明，將五/ M77基因 轉入煙草，轉基因植株在正常條件下的長勢類似對照，該基因可作為目的基因導入植物， 提高植物耐重金屬能力，以進行植物品種改良。在本發明的方法中，可利用五AM77基因 作為目的基因構建植物表達載體，其中可用任何一種啟動子例如花椰菜花葉病毒 (CaMV) 35S啟動子、Ubiquitin啟動子或其它啟動子，該表達載體中必要時可包括增 強子，不論是轉錄增強子或翻譯增強子。為了簡化轉化細胞的鑒定可使用選擇性標記包 括對抗生素抗性的酶，也可利用顏色變化(例如卩-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或發光(例如 熒光素酶)來識別的化合物的酶類，也可用無標記選擇。所用的表達載體可使用Ti質粒、 Ri質粒、植物病毒載體等。轉化方法可用農桿菌介導、基因槍或電擊等方法轉化植物。
本發明的S/zM77基因來自海州香薷，具有適合于煙草、擬南芥等雙子葉植物表達的 優化密碼子，其基因工程受體植物除雙子葉植物，如花椰菜、煙草、蠶豆等之外，還適 合于水稻、玉米等單子葉植物。
序列表
<110>南京農業大學
<120>海州香薷金屬硫蛋白基因EhMTl的基因工程應用
<130>說明書
<140> 00
<141> 2007-06-05
<160> 4
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<2U> 20
<212> DNA
<213>人工合成
<220>
<221> 引物P1
<222> G)"(20) <223>
<400> 1
acgtcgatca ctaagaaaag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA <213>人工合成 <220>
<221>弓I物P2
<222> (1)..(20) <223>
<400> 2
cttagacgca taaacacgaa 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA <213>人I合成 <220>
<221> 引物P3
<222> (1)"(25) <223>
<400> 3
gtctagaaag aaaatgtcga gtgga 25
<210> 4
<211> 24
<212> DNA <213>人工合成 <220>
<221> 引物P4
<222> (1)"(24) <223>
<400> 4
cccgggaggc agtatatctg acag 2權利要求
1、海州香薷金屬硫蛋白基因EhMT1的基因工程應用，包括1)總RNA的提取以海州香薷為實驗材料，待海州香薷幼苗長至7-8葉期后，用50μM CuSO4進行處理，48小時后立即取葉片置于液氮中冷凍保存；取部分葉片，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5ml離心管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內，勻漿后移至1.5ml離心管中，抽提總RNA，用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質量，然后在分光光度計上測定RNA含量。2)海州香薷金屬硫蛋白基因EhMT1的克隆設計兩端引物引物P15′-ACGTCGATCACTAAGAAAAG-3′引物P25′-CTTAGACGCATAAACACGAA-3′以步驟1)獲得的總RNA為模板，經反轉錄合成cDNA第一鏈后，進行PCR擴增，PCR程序如下94℃預變性4分鐘，94℃變性30s，55℃復性1min，72℃延伸45min，28個循環后，72℃7min，將PCR產物進行克隆、測序后獲得具有完整編碼區的海州香薷金屬硫蛋白基因EhMT1的cDNA序列；3)植物表達載體的構建根據海州香薷金屬硫蛋白基因EhMT1的cDNA序列，見GenBank登錄號為DQ059081的全長編碼序列，設計編碼完整閱讀框的引物引物P35′-GTCTAGAAAGAAAATGTCGAGTGGA-3′引物P45′-CCCGGGAGGCAGTATATCTGACAG-3′并分別引入限制性內切酶位點，以步驟2)中獲得的PCR擴增產物為模板，經PCR擴增后，將EhMT1的cDNA克隆至中間載體pGEM-T，進一步克隆到雙元表達載體PBI121；4)轉基因植株的獲得將步驟3)獲得的表達載體轉入農桿菌，進一步轉化煙草，對獲得的轉基因植株進行PCR、RT-PCR驗證后進行植物的耐逆性評價，轉基因植株的T0代和野生型煙草進行50μM CuSO4的持續處理，觀察他們的生長表現，在銅處理12天后的表現明顯優于野生型的轉基因煙草植株即為獲得的耐銅轉基因植株。
全文摘要
本發明公開了一種海州香薷金屬硫蛋白基因EhMT1的基因工程應用方法。EhMT1的cDNA序列GenBank登錄號為DQ059081及編碼的氨基酸序列GenBank登錄號為AAY57923。本發明為海州香薷中首次報道的金屬硫蛋白基因及其應用。EhMT1參與了銅在海州香薷根系的積累，mRNA表達分析表明該基因在海州香薷受過量銅的誘導。轉基因實驗證明該基因的過量表達提高了煙草的耐銅性及對銅的積累。EhMT1可作為目的基因導入植物，提高植物耐銅性及對銅的積累。
文檔編號C12N15/82GK101096672SQ20071002346
公開日2008年1月2日 申請日期2007年6月5日 優先權日2007年6月5日
發明者妍 夏, 沈振國, 王桂萍, 鮑永美, 驥 黃 申請人:南京農業大學