專利名稱：：一種分離的大腸桿菌噬菌體及其作為生物殺菌劑在食品和抗感染中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及到能夠特異性裂解大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株的噬菌體分離物和其作為生物殺菌劑在食品及在抗感染中的應用。屬于生物工程領域。
背景技術：
：噬菌體(ibacte〃'op/age,p/agre)是一種細菌病毒，可以特異性感染并裂解一種或少數幾種細菌。噬菌體有嚴格的宿主特異性，只寄居在易感宿主菌體內，對動植物細胞和其他細菌沒有感染性。噬菌體的安全性有保證。噬菌體分為兩類，一類噬菌體感染細菌后將其遺傳物質整合到細菌的DNA里，隨著細菌的繁殖而繁殖，一旦外界條件合適就裂解細菌細胞，而引起細菌死亡，這種噬菌體叫做溫和噬菌體。另一類噬菌體一旦感染細菌，就利用細菌合成子代噬菌體，然后裂解細菌細胞而釋放，這種噬菌體成為烈性噬菌體。在殺菌效果上，烈性噬菌體有著廣泛的應用，尤其是利用其治療由"超級細菌"引起的感染取得了良好的效果。細菌污染一直是食品工業中嚴重的問題，每年由于食用被細菌污染的食品導致食物中毒死亡的人數高達數百萬。以前抗生素一直是食品殺菌的首選。通過在動物飼料中添加抗生素以達到防止細菌污染的目的，但是隨著抗生素殘留對人體造成的不良影響，以及由于抗生素大量使用而催生的對抗生素具有多重抵抗作用的"超級細菌"的大量出現，抗生素作為防止食品中細菌污染的缺點日益突出。本發明中的噬菌體分離物是從自然界中分離的烈性噬菌體，經毒理實驗證明該噬菌體安全、無任何毒副作用，并對大腸桿菌有強烈的裂解作用。該噬菌體經高度純化有望開發成為生物殺菌劑避免食品中大腸桿菌的污染。
發明內容本發明的一個目的是開發對大腸桿菌具有強烈裂解作用的噬菌體分離物，該分離物可以單獨或混合使用可以特異性的部分或完全滅活大腸桿菌，為工業化生產噬菌體殺菌劑提供噬菌體株來源。本發明目的是開發一種新型的安全的生物殺菌劑作為食品添加劑防止由大腸桿菌引起的食品污染，避免由于食用該菌污染的食品引起的細菌感染。本發明的又一目的是提供一種用于食品特別是方便即食產品生產環境的安全的生物凈化殺菌劑用以防止食品加工過程中造成的大腸桿菌污染。本發明的再一目的是為治療由大腸桿菌引起的感染提供潛在治療藥物。本發明從自然界中分離得到一種噬菌體分離物，該噬菌體分離物包括一種或多種對大腸桿菌具有裂解作用的噬菌體，經純化可得噬菌體單體。證明該噬菌體分離物中的噬菌體單獨或混合使用對大腸桿菌具有實質裂解作用。上述分離出的噬菌體單體(大腸桿菌噬菌體，拉丁名EscherichiacoliBacteriophage)命名為BPH-EC-5，對大腸桿菌均有廣譜的殺菌能力。噬菌體BPH-EC-5保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(地址北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所)，保藏日期2007年11月13日，保藏編號2253。本發明中噬菌體BPH-EC-5經小鼠毒理實驗，給予1011pfu/kg的噬菌體樣品對實驗小鼠未見異樣，連續給予15天后，將小鼠斷頸處死，尸檢，未發現其內臟有異樣變化。與其他實驗結果相同。該噬菌體是安全的。本發明中噬菌體BPH-EC-5可以單獨或混合使用，在液體中的殺菌極限為終濃度7X105pfu/ml，即，在對數生長期內的大腸桿菌中加入該噬菌體單體或混合物，可以在4-6h內完全滅活該菌。本發明中噬菌體可應用于液體食品，包括但不限于乳制品、飲料等防止大腸桿菌的污染。本發明中噬菌體BPH-EC-5可以單獨或混合使用，對被大腸桿菌污染的固體食品表面噴灑106pfu/ral-107pfu/ml數量級的噬菌體，108pfu/ml-10"pfu/ml的效果尤佳，可以在24小時內完全滅活大腸桿菌。且在一個月內大腸桿菌檢驗呈陰性。提示本發明中噬菌體可應用于防止固體食品，包括但不限于方便即食產品的大腸桿菌污染。本發明中的噬菌體BPH-EC-5可以單獨或混合使用，可以作為殺菌劑噴灑于食品生產車間，可特異性、持續防止該環境中大腸桿菌的生存和繁殖，防止食品加工過程中的污染。本發明中的噬菌體BPH-EC-5可以單獨或混合使用，可作為一種潛在藥物治療由大腸桿菌引起的細菌感染。本發明中噬菌體可以和其他噬菌體聯合使用，以或得較寬的噬菌范圍。本發明中噬菌體可以和其他抗菌劑混合使用，在獲得抗菌廣譜性的同時，對大腸桿菌特異性殺滅。能與該發明中噬菌體聯合使用的抗菌劑包括但不限于抗生素和化學抗菌劑。本發明中噬菌體可應用于工業生產，可由宿主菌大腸桿菌特異性擴增，可應用標準病毒純化方法高度純化，作為食品抗菌添加劑防止食品中大腸桿菌污染。本發明采用的噬菌體BPH-EC-5為大腸桿菌噬菌體，拉丁名EscherichiacoliBacteriophage,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(地址北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所)，保藏日期2007年11月13日，保藏編號2253。圖l為本發明所述的噬菌體在液體中的殺菌效果2為本發明所述的噬菌體在固體實物中的殺菌效果圖.具體實施方式實施例1噬菌體的篩選和純化(一)樣品的采集及處理本發明中樣品采自珠海本地，包括中山大學第五附屬醫院未處理污水、珠海市市內下水道污水、排污入?？谔幒Ｋ?、珠海市家禽養殖場、珠海市養豬場、珠海市屠宰場。采集的樣品用NaOH調節，使pH約為7.0，經過4000g/rain離心15min，用0.45um濾膜過濾得上清液。.取過濾除菌后的樣品75ml，加入25ml4倍LB培養基。(二)樣品中針對大腸桿菌的噬菌體特異性擴增在處理好的樣品中加入預先擴增好的大腸桿菌(OD約為1.0，加入比例為1:100，)，將其置于恒溫搖床37'C，250g/min培養6-8h。(三)斑點實驗測定特異性噬菌體的有無大腸桿菌雙層檢測平板的制備高溫滅菌0.75%LB固體培養基，室溫放置至約40-60'C，取10-15ml傾倒至培養皿內，均勻鋪于皿底，室溫放置30min，使其凝固。將經過高溫滅菌的0.2%-0.9%LB瓊脂糖培養基融化，40°C-48°C水浴保溫。取大腸桿菌0.2ml-0.8ml，加入步驟2中0.5%LB瓊脂糖3.6-5ml，混勻，倒入步驟1制得的培養皿內，室溫放置凝固。將大腸桿菌雙層檢測平板37'C保溫培養lh。取上述經大腸桿菌擴增后的樣品1ml，8000g離心15min，上清液經0.22um過濾膜過濾除菌。取5ul點于大腸桿菌雙層檢測平板上，37°C過夜培養，觀察有無噬斑，如果有進行步驟4。(以上操作均為無菌條件)(四)噬菌體樣品的分離及噬菌體樣品的擴增將步驟(三)中在大腸桿菌雙層檢測平板中呈現噬斑的樣品，經過適當比例稀釋，按如下步驟純化。將制備好的LB平板，37。C平衡0.5h，使其表面溫度達到室溫(如果在室溫條件下放置可省去這一步)取0.4ml對數生長期(OD0.4-0.8之間)、0.1ml擴增后的樣品和4ml0.5%agaroseLB混勻，倒于平板上，輕輕振蕩，使其鋪平，室溫放置約0.5小時，使表面徹底凝固。將雙層平板37。C培養4-6h觀察。挑選單個噬菌斑。將挑選出來的噬菌體單克隆，加入2ml對數生長期的相應菌種中，37°C培育2h-6h，觀察待菌液變澄清，代表殺菌完全。重復3-5次，得到噬菌體單克隆樣品。并將其命名為BPH-EC-5。(五)噬菌體的純化應用宿主菌大腸桿菌將噬菌體BPH-EC-5高度擴增，待培養基澄清后，8000g，離心10min，取出雜質，加入固體聚乙二醇(PEG8000)至終濃度為10%w/v，攪拌溶解，4。C過夜，4。C，8000g離心20min，棄沉淀，重懸于緩沖液(100mMNaCl，5mMMgS04，10mMTris-HC1pH7.2)中，于。C，保溫30min，期間振蕩數次。加入氯仿，漩渦混合30min，3000g離心5min，小心收集水相，將噬菌體懸液置氯化銫(P=1.4,1.6)密度梯度內10000g，4°C離心2h，置強光下，收集乳狀條帶。4'C過夜透析除去鹽份，重復一次。將得到的噬菌體透析液4°C保存待用。實施例2噬菌體計數方法(效價)將所得噬菌體樣品按10倍比例稀釋，取其中一定稀釋比例的樣品100ul，用實施例l所述的步驟(四)中的方法鋪雙層平皿，取合適比例的平皿計算噬斑個數，一個噬斑代表一個噬菌體單體。細菌計數方法(效價)采用標準平皿法計數噬菌體穩定性檢測<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>在4°C放置噬菌體在一月內效價為保持原來的13.2%;室溫和37°C結果相同，效價下降較慢，5d時效價下降約為30%，在一月內效價是原來效價分別為6.8%和0.9%(如表4)。表4在不同溫度下噬菌體BPH-EC-5的保存效果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2.PH對噬菌體殺菌能力的影響將噬菌體樣品分別于pH1-14，室溫保存2h，然后檢測其效價。結果，對于噬菌體BPH-EC-5最適pH為4-10，噬菌體的效價幾乎沒有變化。當pH為10的時候仍保持90%的活性。當時當pH〈4或pH〉ll效價下降很快(表2)。表2pH對噬菌體BPH-EC-5的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3.高濃度鹽分對噬菌體活性的影響加入氯化鈉調整噬菌體樣品溶液的鹽濃度，使鹽終濃度分別達到0.1M、0.3M、0.5M、1M、3M保存2h，將其稀釋，和對照組相比，檢測效價的變化。結果顯示小劑量(0.1-0.3M)的NaCl有助于噬菌體的保存，而高濃度鹽對噬菌體沒有明顯的影響(表3)。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例3毒理實驗昆明小鼠，清潔級，體重22士3g，2月齡(合格證號SCXK(京)2004-0001)，由協和醫科大學試驗動物研究中心提供。試驗動物飼養于清潔級飼養室，室溫18-22。C，相對濕度40%-70%，12h日照和昏暗循環。實驗小鼠20只，雌雄各半，適應性飼養3天后，隨機分為兩組(噬菌體組、對照組)，每組10只(雌雄各5只)，給予噬菌體組計量為1011pfu/kg的噬菌體BPH-EC-5，對照組給予等量生理鹽水，連續給藥15d，將實驗鼠斷頸處死，檢査內臟情況。觀察結果顯示，此計量的噬菌體BPH-EC-5對小鼠日常行為沒有影響。解剖檢査內臟未見異常。實施例4檢測噬菌體樣品在液體中的殺菌效果，具體見附圖l所示的噬菌體在牛奶中的殺菌效果。1.噬菌體計數方法(效價)將所得噬菌體樣品按10倍比例稀釋，取其中一定稀釋比例的樣品100ul，用實施例l步驟(四)中的方法鋪雙層平皿，取合適比例的平皿計算噬斑個數，一個噬斑代表--個噬菌體單體。2.細菌計數方法(效價)采用標準平皿法計數3.液體中殺菌效果實驗將噬菌體樣品按10倍比例稀釋，其中一部分按實施例2中方法測定效價，另一部分按如下方法檢測殺菌效果，取上述經稀釋的噬菌體樣品100ul，加入到2ml對數生長期的大腸桿菌(3.4X107pfu/ml)中，37°C，250RPM/min培養。按照MOI(噬菌體/細菌)=0.1，接種噬菌體。37'C保溫，然后分別于20min、40min、60min、90min、120min、240min測定噬菌體效價。結果顯示，BPH-EC-5的殺菌極限為104數量級，當液體中噬菌體的含量達到104pfu/ml時，噬菌體可以完全殺滅大腸桿菌。噬菌體潛伏期在30min內，在20min時，液體中大腸桿菌的個數小于1pfu/ml.而在4h內無細菌增殖(如圖l)。實施例5檢測噬菌體樣品在固體食品中的殺菌效果，具體見附圖2所示的噬菌體在火腿中的殺菌效果。此部分選取火腿腸作為試驗樣品，將火腿腸切為1cm左右方體，用于試驗。制備1X103pfu/ml、lX104pfu/ml的大腸桿菌溶液。制備1X108pfu/ml的噬菌體樣品。火腿腸樣品分別置于上述菌液中，浸泡lh，取出置于無菌廣口瓶內，無菌環境下晾千。上述火腿樣品取出一部分置于噬菌體樣品中，置于無菌廣口瓶中晾干。將上述制備樣品置于室溫(約20-25°C)培養。檢測樣品總大腸桿菌含量。結果證明，1X108pfu/ml的噬菌體樣品可以在1天內完全殺滅大腸桿菌，且能夠對食品提供長久的保護(結果如圖2)。權利要求1.一種噬菌體BPH-EC-5，保藏號為2253。2.權利要求l所述的噬菌體在防止大腸桿菌污染方面的應用。3.權利要求1所述的噬菌體作為一種食物添加劑用于防止大腸桿菌污染方面的應用。4.權利要求1所述的噬菌體在作為殺菌劑噴灑于食品生產車間，用于防止該環境中大腸桿菌的生存和繁殖，防止食品加工過程中的污染方面的應用。5.權利要求1所述的噬菌體作為一種治療大腸桿菌感染的藥物的應用。全文摘要本發明公開了一種分離的大腸桿菌噬菌體及其作為生物殺菌劑在食品和抗感染中的應用。上述分離出的噬菌體單體(大腸桿菌噬菌體，拉丁名EscherichiacoliBacteriophage)命名為BPH-EC-5，對大腸桿菌均有廣譜的殺菌能力。噬菌體BPH-EC-5保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(地址北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所)，保藏日期2007年11月13日，保藏編號2253。文檔編號C12N7/00GK101220349SQ20071003141公開日2008年7月16日申請日期2007年11月16日優先權日2007年11月16日發明者磊劉,張智英申請人:珠海市晉平科技有限公司