專利名稱：一種檢測圍產期疾病遺傳易感風險的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和醫學領域，更具體的，本發明涉及一種檢測圍產期疾病遺傳易感風險的試劑 盒，通過同時檢測血管緊張素轉換酶基因(ACE)、 5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)、 G蛋白3 亞單位基因基因(GNB3)、腫瘤壞死因子基因(TNF-a )上的多態性位點基因型來評估個體圍產期疾病遺傳
易感風險。
背景技術：
圍產期保健對降低孕產婦死亡、圍產兒死亡以及病殘兒的發生、保障母嬰安全健康具有重要意義。在 圍產期期間，孕婦容易發生妊娠高血壓綜合征、妊娠糖尿病和產后肥胖。妊娠高血壓綜合征(簡稱妊高征)， 是孕產婦特有的一種全身性疾病，在我國的發病率為10.32%，多發生在妊娠20周以后至產后2周，臨床 上主要表現為水腫、高血壓、蛋白尿三大癥候群，重度患者伴有頭痛、眼花、甚至抽搐、昏迷。本病嚴重 威脅母胎健康，是引起孕產婦和圍產兒死亡的主要原因。眾多研究發現，該疾病具有較高的遺傳傾向。妊 娠糖尿病是指懷孕前未患糖尿病，而在懷孕時才出現髙血糖的現象，其發生率約百分之一到三。臨床數據 顯示大約有2~3%的女性在懷孕期間會發生糖尿病，患者在妊娠之后糖尿病自動消失。妊娠糖尿病更容易發 生在肥胖和髙齡產婦。有近30%的妊娠糖尿病婦女以后可能發展為2型糖尿病。糖尿病的病因和發病機理 非常復雜，不同類型和不同人群可有顯著的差異，總的來說為遺傳因素和環境因素共同作用所引起。產后 肥胖是大多數婦女產后所面臨的困擾。產后六周，如果體重超過妊娠前體重的10%即定義為產后肥胖。臨 床研究表明，妊娠過程中體內激素的變化，是造成產后肥胖的主要原因。
圍產期疾病是遺傳易感性和環境因素相互作用的結果。圍產期疾病的遺傳易感基閔主要為血管緊張素 轉換酶基因(ACE)、 5， 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)、 G蛋A P 3亞單位基因(GNB3)和腫瘤壞 死因子基因(TNF-a)。
血管緊張素轉換酶(ACE)基因與圍產期妊高征密切相關。ACE基因編碼血管緊張素轉化酶，在人體內具 有多種功能。ACE基因多態性是冠心病、心肌病、高血壓等多種圍產期疾病發病的獨立危險因素。BedirA 在土耳其人群中的研究發現ACE的I/D基因型影響著ACE的活性，其中DD基因型的活性較高而II基因型 的活性較低。而在髙血壓中ACE的血清水平明顯比非高血壓個體的水平為高，因此認為ACE的DD基因型 與高血壓相關，并可能是嚴重高血壓的重要標記和髙血壓的獨立危險因子。2006年，陳柏坤等人對92例 妊娠高血壓綜合征患者及85名正常妊娠者的ACE基因多態性進行研究。結果顯示，妊娠高血壓綜合征組 ACE基因3種基因型頻率分別為DD型44. 6%、 ID型33. 7%、 II型21. 7%;對照組ACE基因3種基因型頻率 分別為DD型18.戰、ID型40. 0%、 II型41. 2%。兩組的DD基因型及D等位基因頻率比較差異有顯著性 (P<0.05)。結果顯示ACE基因的缺失多態性(DD)可能為妊高征發病的重要遺傳因素之一。
5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因與妊娠期高血壓綜合征密切相關。MTHFR為亞甲基四氫葉酸 還原酶蛋白編碼基因，主要作用是在葉酸代謝通路中將5, 10-亞甲基四氫葉酸轉化為具有生物學功能的5-甲基四氫葉酸鹽。MTHFR基因的缺陷可以導致機體多個必需生化途徑的紊亂，包括細胞周期調控、DNA合 成和甲基化修飾等，并進而引發各類心腦血管疾病、癌癥和神經管缺陷等多種疾病。2006年，王素敏等人 對同型半胱氨酸代謝酶一甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因多態性在妊高征發病中的作用地位進行研究。 結果顯示，病例組MTHFR C677T C/T基因型頻率顯著高于正常對照組，T等位基因頻率顯著高下'對照組(P < 0.05)。 MTHFR C677T基因突變是妊高征發生的遺傳風險因素，可作為妊髙征預后的檢測指標。
腫瘤壞死因子(TNF-a )基因與圍產期妊糖密切相關。TNF-a基因編碼的蛋白是一種多功能的細胞因 子，它能顯著誘導巨噬細胞以抑制細菌生長，誘導多種細胞因子產生間接調節免疫細胞的活性，增強特異 性免疫保護功能，在調節機體組織的糖、脂肪代謝中也起重要作用。國內外的眾多研究表明TNF-a基因上 的多態現象與胰島素、過氧化脂質、血脂、血糖、瘦素等因素相關。TNF-a基因的缺陷可以直接導致炎癥, 并大大提髙骨疾病、腫瘤、冠心病、糖尿病等的患病機率。2005年，楊柳等人研究東北漢族妊娠糖尿病(GDM) 孕婦腫瘤壞死因子-a (TNF-a)基因多態性的分布頻率及其在GDM發病中的作用。以120例GDM的孕婦作 為病例組，120例糖耐量正常的孕婦作為對照組，檢測TNF -a基因-308和-238位點等位基因和基因型的分布頻率。結果GDM組和正常妊娠對照組-308多態性位點A等位基因頻率(0.1375和0. 0583)及GA + M
基因型頻率(0.2417和O. H67)顯著高于正常妊娠對照組，差異有統計學意義(P < 0. 05)。結果顯示， 我國東北漢族孕婦人群中TNF-a基因-308G—A變異可增加孕婦患妊娠期糖尿病的危險性。
G蛋白亞單位基因(GNB3)與產后肥胖密切相關。GNB3為G蛋白e 3亞單位編碼基因。國內外多項 研究表明，該基因上的多態現象與高血壓及其用藥、肥胖、胰島素抗性等都有相關性。Siffert等發現825T 等位基因頻率在超重者和肥胖者中顯著增加。正常、超重和肥胖三個BMI組中825T等位基因頻率分別為 德國人29.5%， 39.3 % ， 47. 7 %;中國人46. 8 % ， 53. 9 % , 58. 6 %;南非人83. 1 % ， 87. 7 % ， 90. 9%。三個種族中825T等位基肉與肥胖均顯著相關。樓曉明等人的實驗結果顯示GNB3 825位基因型 可能與肥胖的發生相關，825TT組在體重、體重指數、脂肪含量方面都顯著高于825TC和825CC組。

發明內容
根據國家生物基因檢測技術應用評估認證中心頒布的《中國人口健康服務基因位點認證規程》，對與 圍產期疾病遺傳易感風險相關基因位點的支持文獻、分子生物學機理研究、中國人群適用性等進行綜合分 析評估后，血管緊張素轉換酶基因(ACE)上rs4646994號SNP位點、5， 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因 (MTHFR)上rsl801133號SNP位點、G蛋白3亞單位基因基因(GNB3)上rs5443號SNP位點、腫瘤壞死因 子基因(TNF-a )上rs 1800629號SNP位點通過國家生物基因檢測技術應用評估認證中心認定，可用于檢測 評估圍產期疾病遺傳易感風險。
基于ACE、 MTHFR、 GNB3、 TNF-a基因上這4個位點的多態性可用來評估個體圍產期疾病遺傳易感風 險的基礎上，本發明提供一種檢測個體圍產期疾病遺傳易感風險的試劑盒。
該試劑盒包括
檢測ACE基因上rs4646994號I/D多態性基因型的電泳檢測引物對； 檢測MTHFR基因上rsl801133號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對； 檢測GNB3基因上rs5443號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對； 檢測TNF-a基因上rsl800629號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對； PCR反應組件(包括Taq酵、dNTP混合液、MgCh溶液、PCR反應緩沖液、去離子水等)； 熒光定量PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCh溶液、熒光定量PCR反應緩沖液、去離子 水等)。
本試劑盒中所述的電泳檢測引物對是指針對ACE基因上rs4646994號I/D而設計，能通過電泳技術特 異性擴增檢測出這個位點基因型的電泳檢測引物對。設計這類引物對是本領域技術人員能夠輕易完成的。 優選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 1和2所示序列的電泳檢測引物對。電泳檢測引物對可用常規的 合成技術進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發明的電泳檢測引物對不限于這對引物，所有可用于 電泳技術檢測這個位點的電泳檢測引物對均在本發明范圍內。
本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對MTHFR基因上rsl801133號SNP位點、GNB3基因上rs5443 號SNP位點、TNF- a基因上rsl800629號SNP位點這3個SNP位點，能特異性擴增出包含這3個SNP位點 的DNA片段的引物對。設計這類引物對是本領域技術人員能夠輕易完成的。優選地，試劑盒中包含具有SEQ IDNO: 3和4、 5和6、 7和8所示序列的引物對。特異性引物對可用常規的合成技術進行合成。本領域 的技術人員能夠理解，本發明的引物不限于這三對引物。
本試劑盒中所述的特異性熒光探針對是指針對MTHFR基因上rsl801133號SNP位點、GNB3基因上 rs5443號SNP位點、TNF- a基因上rsl800629號SNP位點這3個SNP位點而設計，能通過熒光定量PCR技 術特異性檢測出這3個SNP位點基因型的T叫腿n探針對。設計這類探針是本領域技術人員能夠輕易完成 的。優選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 9和10、 11和12、 13和14所示序列的Taqman探針對。特 異性熒光探針對可用常規的探針合成技術進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發明的特異性熒光 Taqman探針對不限于這三對探針，所有可用于熒光定量PCR法檢測這3個SNP位點的探針均在本發明范圍 內。
本發明試劑盒的組分和含量包括1. 熒光定量PCR反應套裝
10 X熒光定量PCR反應緩沖液3nl， 25raM dNTP混合液0.3pl. 25mM MgC12溶液1. 8|il， 5units/nl Taq DNA聚合酶0.75^1， 20MM特異性引物對每條引物各0.225^1， IOPM特異性熒光探針對每條探針各0.25nl， 去離子水15.975nl。
2. 電泳檢測套裝
10X PCR反應緩沖液2.5nl， 25mM dNTP混合液0.2^1, 25mM MgCl2溶液1. 5^1， 5units/nl Taq DNA聚合酶0. 125pl， 20nM ACE基因電泳檢測引物對每條引物各0.25nl， 去離子水19. 175nl, 本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規 條件，或按照廠商所建議的條件。
實施例l.檢測試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取 用硅膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組DNA。
步驟2:電泳檢測分型
使用檢測試劑盒中的電泳檢測套裝，其中，含有下列引物對
有義引物5' - CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT -3' (SEQ ID NO: 1) 反義引物5' - GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT -3' (SEQ ID NO: 2) 反應的體系為總體積25nl，包含濃度為12.5ng/nl的DNA模板lpl、10X PCR反應緩沖液2.5nl，25mM dNTP混合液0.2nl, 25mMMgC12溶液1.5^1, 5units/nl Taq DNA聚合酶0.125^1， 20nMACE基因電泳檢 測引物對每條引物各0.25nl，去離子水19.175^1。
在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為94'C、 12分鐘，進行30個循環的94'C、 30秒，60 'C、 30秒，72°C、 30秒，然后進行72'C、 IO分鐘。
然后利用電泳技術，進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶數量。
步驟3:熒光定量PCR反應
使用檢測試劑盒中的熒光定量PCR套裝，其中，含有下列引物對和熒光探針對 有義引物l: 5' - AAAGCTGCGTGA -3' (SEQ ID NO: 3)
反義引物l: 5' - TGAAGGAGAAGGTG -3' 有義引物2: 5' - AGAGCATCATCTGCGGCAT -3' 反義引物2: 5' - GGCGGCCACTGAGGG -3' 有義引物3: 5' - GAGGCAATAGGTTTTGAGGG -3， 反義引物3: 5' - GGACCCTGGAGGCTGAA -3' 帶VIC熒光基團探針1: 5' - ATCGgCTCCC -3' 帶FAM熒光基團探針1: 5' - TCGaCTCCCGC -3'
(SEQ ID NO: 4) (SEQ ID NO: 5)
(SEQ ID NO: 6) (SEQ ID NO: 7)
(SEQ ID NO: 8)
(SEQ ID NO: 9) (SEQ ID NO: 10)帶VIC熒光基團探針2: 5， - ACGTCcGTGGCC -3' (SEQ ID NO: 11) 帶FAM熒光基團探針2: 5' - ACGTCtGTGGCCT -3' (SEQ ID NO: 12) 帶VIC熒光基團探針3: 5' - CATGaGGACGG -3' (SEQ ID NO: 13) 帶FAM熒光基團探針3: 5' - CATGgGGACG -3' (SEQ ID NO: 14)有義引物l，反義引物l、帶VIC熒光基團探針1、帶FAM熒光基團探針l特異地針對檢測MTHFR基因 上rsl801133號SNP位點多態性；有義引物2，反義引物2、帶VIC熒光基團探針2、帶FAM熒光基團探針2特異地針對檢測GNB3基因 上rs5443號SNP位點多態性；有義引物3，反義引物3、帶VIC熒光基團探針3、帶FAM熒光基團探針3特異地針對檢測TNF- a基 因上rsl800629號SNP位點多態性；3個SNP位點分別進行3次獨立的熒光定量PCR反應，每個反應的體系為總體積10nl，包含濃度為 20ng/nl的DNA模板2jil、 1^1 10 X熒光定量PCR反應緩沖液、0. l^il 25mM dNTP混合液、0. 6^1 25mMMgCl2 溶液、0.025nl (5units/nl) Taq DM聚合酶、20一的有義引物和反義引物各0. 225pl、 lOpM的帶VIC 熒光探針和帶FAM熒光探針各0. 25nl，去離子水5. 325^1。在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為50'C、 2分鐘，95°C、 IO分鐘，進行60個循環的 95'C、 30秒，60'C、 l分鐘。反應結束后在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。步驟4:基因型分析熟悉電泳檢測技術的本領域技術人員能夠通過辨識電泳圖上DNA條帶的數量來確定所檢測的SNP位點 的基因型。熟悉熒光定量PCR技術的本領域技術人員能夠通過辨識熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量，根 據不同序列探針VIC和FAM熒光信號的強弱即可確定所檢測的SNP位點的基因型。實施例2.對人們進行個體圍產期疾病遺傳易感風險檢測的服務 步驟l: DNA提取由醫院檢驗科醫師指導被檢者使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用硅膠吸附法進行口腔上皮 細胞的DM抽提。步驟2:基因分型檢測使用本發明提供的試劑盒.對被檢測者基因組DNA的ACE基因上rs4646994號I/D位點進行電泳檢測， 對MTHFR基因上rsl801133號SNP位點、GNB3基因上rs5443號SNP位點、TNF- a基因上rsl800629號SNP 位點進行熒光定量PCR檢測，確定這4個位點的基因型。步驟3:個體圍產期疾病遺傳易感風險的分析通過對被檢測者SNP基因型的分析，出具個體圍產期疾病遺傳易感風險的分析報告單。報告中詳細說 明了被檢測者圍產期疾病遺傳易感風險的高低，并由醫師向被檢者詳細說明和解讀個體圍產期疾病遺傳易 感風險分析報告單。序歹lj表<110〉上海主健生物工程有限公司〈120〉 一種檢測圍產期疾病遺傳易感風險的試劑盒<歸14<210〉 1 <211〉 24 <212> DM <213〉人工序列<220><223>引物 <400> 1CTGGAGACCA CTCCCATCCT TTCT 24<210> 2 <211〉 25 <212> DNA <213>人工序列<220><223>引物 〈400> 2GATGTGGCCA TCACATTCGT CAGAT 25<210> 3 <211> 12 <212> DNA <213〉人工序列<220><223〉引物 <400〉 3AAAGCTGCGT GA 12<210> 4 <211> 14 <212> DNA <213〉人工序列<220〉<223〉引物 <柳〉4TGAAGGAGAA GGTG 14<210> <211> <212> <213>519 麗人工序列<220><223>引物 〈400> 5AGAGCATCAT CTGCGGCAT 19<210> <211> 〈212〉 <213>615DNA人工序列<220><223〉引物 <400> 6GGCGGCCACT GAGGG 15<210> 〈211> <212> 〈213>720 腿人工序列<220><223>引物 〈400〉 7GAGGCAATAG GTTTTGAGGG 20<210> 8 <211〉 17 〈212>腿 <213>人工序列<220><223〉引物<formula>formula see original document page 9</formula><210> 9 <211> 10 <212>麗 <213〉人工序列<220><223>探針<formula>formula see original document page 9</formula>人工序列<220><223>探針<400〉 10 TCGaCTCCCG C<210〉 <211> <212> 〈213〉1112 隠人工序列<220><223>探針備> 11 ACGTCcGTGG CC<210〉 <211> <212> <213〉1213 DNA人工序列<220><223〉探針 <400> 12<formula>formula see original document page 9</formula>〈210〉 13 〈211> 11 <212>腿 <213>人工序列<220><223>探針<400〉 13 CATGaGGACG G<210> 14 〈211〉 10 <212> DNA <213>人工序列〈220〉<223>探針<400> 14 CATGgGGACG
權利要求
1. 一種檢測圍產期疾病遺傳易感風險的試劑盒，其特征在于包括檢測血管緊張素轉換酶基因(ACE)上rs4646994號I/D多態性基因型的電泳檢測引物對、檢測5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)上rs1801133號SNP位點、G蛋白3亞單位基因基因(GNB3)上rs5443號SNP位點、腫瘤壞死因子基因(TNF-α)上rs1800629號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針對、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液、PCR反應緩沖液、去離子水等。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒,其特征在于:所述的電泳檢測引物對是指針對ACE基因上rs4646994 號1/D而設計，能通過電泳技術特異性擴增檢測出這個位點基因型的電泳檢測引物對。
3. 根據權利要求l所述的試劑盒，其特征在于:所述的特異性引物對是指針對MTHFR基因上rs1801133 號SNP位點、GNB3基因上rs5443號SNP位點、TNF- a基因上rsl800629號SNP位點這3個SNP位點，能 特異性擴增出包含這3個SNP位點的DNA片段的引物對。
4. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針對是指針對MTHFR基因上 rsl801133號SNP位點、GNB3基因上rs5443號SNP位點、TNF- a基因上rsl800629號SNP位點這3個SNP 位點而設計，能通過熒光定量PCR技術特異性檢測出這3個SNP位點基肉型的Taqman探針對。
5. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在亍所含的電泳檢測引物對選自具有SEQ ID NO: l和2 所示序列的引物對。
6. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性引物對選自具有SEQIDNO: 3和4、 5 和6、 7和8所示序列的引物對。
7. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性熒光探針選自具有SEQIDNO: 9和10、 11和12、 13和14所示序列的Taqman探針對。
8. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括-1) 熒光定量PCR反應套裝10 X熒光定量PCR反應緩沖液3nl， 25raMdNTP混合液0.3nl， 25mMMgC12 溶液1.8^1， 5units/nlTaqDNA聚合酶0.75^1， 20MM特異性引物對每條引物各0.225pl， IO幽特異性 熒光探針對每條探針各0.25nl，去離子水15.975^1。2) PCR反應套裝IOXPCR反應緩沖液2.5^1， 25mM dNTP混合液0.2pl， 25mM MgC12溶液1.5^1， 5units/nlT叫DNA聚合酶0.125|il, 20fiM特異性引物對每條引物各0.25pl，去離子水19.175pl。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
全文摘要
本發明公開了一種檢測個體圍產期疾病遺傳易感風險的試劑盒。該試劑盒包括血管緊張素轉換酶基因(ACE)上rs4646994號I/D多態性基因型的電泳檢測引物對、檢測5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)上rs1801133號SNP位點、G蛋白3亞單位基因基因(GNB3)上rs5443號SNP位點、腫瘤壞死因子基因(TNF-α)上rs1800629號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針對、熒光定量PCR常規組件、PCR反應組件等。本發明的試劑盒通過同時檢測與圍產期疾病遺傳易感風險密切相關的ACE、MTHFR、GNB3、TNF-α基因上的多態性位點基因型來評估個體圍產期疾病遺傳易感風險。
文檔編號C12N15/11GK101240323SQ20071003717
公開日2008年8月13日 申請日期2007年2月6日 優先權日2007年2月6日
發明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司