專利名稱：遺傳信息及健康評估管理的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和醫學領域，更具體的，本發明涉及一種檢測個體遺傳信息進行健康評估和管 理的試劑盒。
背景技術：
心血管疾病每年奪走1200萬人的生命，接近世界人口總死亡數的1/4，成為人類健康的頭號大敵。盡 管近30年來，心血管病死亡率除東歐各國外的大多數國家都有不同程度的下降，但是在多數國家45歲以 上男性死亡原因中仍高居首位，在女性中則是僅次于腫瘤的第二位死因，嚴重影響著人類的期望壽命和生 存質量。隨著我國步入老齡化社會，心腦血管疾病是整個社會面臨的嚴重問題。
醫學專家公認控制心血管疾病重在預防，如早日知道健康狀況，并采取措施，則50%以上的死亡是 可以避免的。目前對心血管疾病的臨床診斷措施是根據臨床表現、心臟超聲、心電圖、X線檢査。以上診 斷措施可以診斷出己患上心血管疾病的人群，但存在滯后性，患病人群往往是在出現相應的臨床癥狀后入 院檢查。另外通過這些診斷手段無法確定心血管疾病的真正原因，心血管疾病的機理比較復雜，需要一個 科學的全面的解釋。
WHO的專家指出盡管心血管病是頭號殺手，但如果積極開展預防，每年可挽救600萬人的生命。不 論是發展中國家還是發達國家，預防是最實際最少花費的辦法，是不用藥物而保持健康生活的方法。而已 有的研究成果顯示，高血壓、冠心病等心血管疾病的相關因素都是受到遺傳因素調控的。不同遺傳體質的 人發生心血管疾病的風險不同，所需的預防方式也存在差異。因此，了解自身的遺傳狀況及其對心血管健 康的影響十分必要，也只有如此才能真正做到以積極的、有目的且有效的干預手段維持心血管系統健康， 提高生命質量。通過利用先進的基因檢測手段，破解心血管疾病代謝相關的易感基因，能夠實現比較準確 地預測心血管疾病的發病遺傳風險，具有重要的應用價值和廣泛的應用前景。
心血管疾病是遺傳易感性和環境因素相互作用的結果。 一般認為在比例上，遺傳因素約占40%，環境 因素約占60%。心血管疾病的遺傳易感基因主要為血管緊張素轉換酶基因(ACE)、血管緊張素n-i型受體 基因(AGTR1)、 G蛋白3亞單位基因(GNB3)、內皮型一氧化氮合成酶基因(N0S3)。經過國家生物基因檢測 技術應用評估認證中心的認定，確定這四種基因上四個多態性位點與心血管疾病的關聯性得到了在中國人 群中實驗性數據支持，且從基因功能和通路上能解釋基因變異導致心血管疾病的作用機理。通過檢測這些 基因位點，可以正確提示心血管疾病的風險。
在西藏人群中的研究表明ACE的I/D多態與西藏女性的原發性高血壓發病、DBP、 MAP的數值都有顯著 相關，而與男性的發病未發現明顯相關。在中國漢族人群中對ACE的I/D多態進行了 Meta分析，共對18 項研究中的1612個病例對1710個對照進行分析，結果發現帶有DD基因型的個體對其他個體的相對危險 度為1.37(95% CI=1. 15-1.63， P < 0.01)，因此認為ACE的I/D多態在中國漢族人群中是原發性高血壓 的發病危險因子。在中國武漢的116例原發性高血壓對91例正常對照的研究中發現，ACE的I/D多態中 DD基因型對男性的原發性高血壓的發病和血壓升高有顯著的影響(P〈0.05)。另外的研究也表明了 ACE的 I/D多態在中國的各地區的多個人群中與原發性高血壓的發病相關，其中DD基因型可以作為原發性高血壓 的獨立危險因子。
血管緊張素II-l型受體作為腎素一血管緊張素系統級聯反應最后作用于靶細胞的共同通路倍受關注。 血管緊張素II-l型受體基因A1166C多態性位于3'端非翻譯區的5'末端，由堿基A被C替換而形成。 該基因的這一位點一直是高血壓及冠心病領域前沿的研究熱點，目前主要集中在AGTR1基因多態A1166C 與高血壓、冠心病及其手術后再狹窄等副作用、心肌肥厚、心力衰竭等方面。通過大量研究表明，AGTR1 基因AC基因型與原發性高血壓有關，在中國漢族人群中C等位基因是高血壓的危險因子。
對大慶地區187個高血壓家系和189個非高血壓家系的第一代子女進行空腹血糖、空腹胰島素、血脂 和纖維蛋白原等指標的測定，以多因素分析探討GNB3C825T多態性與血壓、胰島素抵抗的關系。結果顯示 GNB3C825T基因型與胰島素敏感性、血壓水平及體重指數均相關。GNB3C825T等位基因增加胰島素抵抗的 升壓作用，在相似的胰島素抵抗條件下，CT/ TT基因型者血壓水平更高。
內皮型一氧化氮合成酶(eN0S)主要分布于冠狀血管及心腔面的內膜，主要功能是參與精氨酸和脯氨 酸代謝，并催化生成一氧化氮(NO)。 NO是一種內皮松弛因子，具有舒張血管、調節血流、抑制血管平滑肌 細胞增殖、抑制血小板和白細胞粘附等重要功能，參與了多種疾病的病理生理過程。對192個高血壓病人 和122個健康人進行研究，發現高血壓患者中G894G基因型的頻率顯著低于正常人群，說明G894G基因型 降低了高血壓的易感性。

發明內容
根據國家生物基因檢測技術應用評估認證中心頒布的《中國人口健康服務基因位點認證規程》，對與 心血管疾病發病遺傳風險相關基因位點的支持文獻、分子生物學機理研究、中國人群適用性等進行綜合分 析評估后，血管緊張素轉換酶基因(ACE)上rs4646994號SNP位點、血管緊張素II-1型受體基因(AGTR1) 上rs5186號SNP位點、G蛋白3亞單位基因(GNB3)上rs5443號SNP位點、內皮型一氧化氮合成酶(N0S3) 上rsl799983號SNP位點通過國家生物基因檢測技術應用評估認證中心認定，可用于檢測評估心血管疾病 發病遺傳風險。
通過評估被檢者心血管疾病的發病遺傳風險對被檢者進行心血管健康的評估，并根據被檢者心血管疾 病發病遺傳風險相關的這4個SNP位點的基因型，制定符合被檢者遺傳體質的健康管理計劃。
基于ACE、 AGTR1、 GNB3、 N0S3基因上這4個SNP位點的多態性可用來評估個體心血管疾病發病遺傳 風險的基礎上，本發明提供一種檢測個體心血管疾病發病遺傳風險的試劑盒。
該試劑盒包括
檢測ACE基因上rs4646994號SNP多態性基因型的電泳檢測引物對。所述的電泳檢測引物對具有SEQ ID NO: l和2所示序列。電泳檢測引物對可用常規的合成技術進行合成。
檢測AGTR1基因上rs5186號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對。所述的特異性 引物對具有SEQ ID NO: 3和4所示序列，所述的特異性熒光探針對指具有SEQ ID NO: 9和10所示序列 的Taqman探針對。特異性引物對可用常規的合成技術進行合成，特異性熒光探針對可用常規的探針合成 技術進行合成。
檢測GNB3基因上rs5443號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對。所述的特異性引 物對具有SEQ ID NO: 5和6所示序列，所述的特異性熒光探針對指具有SEQ ID NO: 11和12所示序列的 Taqman探針對。特異性引物對可用常規的合成技術進行合成，特異性熒光探針對可用常規的探針合成技術 進行合成。
檢測N0S3基因上rsl799983號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對。所述的特異 性引物對具有SEQ ID NO: 7和8所示序列，所述的特異性熒光探針對指具有SEQ ID NO: 13和14所示序 列的Taq腿n探針對。特異性引物對可用常規的合成技術進行合成，特異性熒光探針對可用常規的探針合 成技術進行合成。
PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反應緩沖液、去離子水等)； 熒光定量PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCh溶液、熒光定量PCR反應緩沖液、去離子 水等)。
本發明試劑盒的組分和含量包括 1.熒光定量PCR反應套裝
10 X熒光定量PCR反應緩沖液3^1,
25mM dNTP混合液0.3pl，
25mM MgC12溶液1. 8^1，
5units/nl Taq DNA聚合酶0. 075pl,
20MM特異性引物對每條引物各0.225^1，
l(MI特異性熒光探針對每條探針各0.25nl，
去離子水15.975^1。
2.電泳檢測套裝
10X PCR反應緩沖液2.5nl,
25mM dNTP混合液0.2^1，
25mM MgCl2溶液1. 5pl，
5units/^1 Taq DNA聚合酶0.125^1,
20nM ACE基因電泳檢測引物對每條引物各0.25nl，
去離子水19. 175nl， 本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規 條件，或按照廠商所建議的條件。
實施例l.檢測試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取
用硅膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組DNA。 步驟2:電泳檢測分型
使用檢測試劑盒中的電泳檢測套裝，其中，含有下列引物對 有義引物5， - CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT -3' (SEQ ID NO: 1) 反義引物5' - GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT _3， (SEQ ID NO: 2) 反應的體系為總體積25pl，包含濃度為12. 5ng/pl的DNA模板lpl、10XPCR反應緩沖液2.5nl，25mM dNTP混合液0.2nl， 25mMMgC12溶液1.5^1， 5units/nl Taq DNA聚合酶0.125|_il， 20nMACE基因電泳檢 測引物對每條引物各0.25nl，去離子水19.175^1。
在PCR擴增儀上進行反應，反應條件為94°C、 12分鐘，進行30個循環的94°C、 30秒，60。C、 30秒， 72'C、 30秒，然后進行72'C、 IO分鐘。
然后利用電泳技術，進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶數量。
步驟3:熒光定量PCR反應
使用檢測試劑盒中的熒光定量PCR套裝，其中，含有下列引物對和熒光探針對 有義引物l: 5， - TGCAGCACTTCAC _3， (SEQ ID NO: 3) -TCCTTCAATTCTGA -3' (SEQ ID NO: 4) -AGAGCATCATCTGCGGCAT -3' (SEQ ID NO: 5) -GGCGGCCACTGAGGG -3， (SEQ ID NO: 6) -CCCTGCTGCTGC -3' (SEQ ID NO: 7) -GGGGCAGAAGGAA -3' (SEQ ID NO: 8)
5' - TGAGCaTTAGCTACT -3, (SEQ ID NO: 9)
反義引物l: 5' 有義引物2: 5' 反義引物2: 5' 有義引物3: 5' 反義引物3: 5' 帶VIC熒光基團探針1: 帶FAM熒光基團探針1: 5， 帶VIC熒光基團探針2: 5' 帶FAM熒光基團探針2: 5' 帶VIC熒光基團探針3: 5'
- TGAGCcTTAGCTAC -3, (SEQ ID NO: 10)
- ACGTCcGTGGCC -3' (SEQ ID NO: 11)
- ACGTCtGTGGCCT -3' (SEQ ID NO: 12)
- AgCCCCCAGAAC -3' (SEQ ID NO: 13)
- GAtCCCCCAGAAC -3' (SEQ ID NO: 14) 帶FAM熒光基團探針1特異地針對檢測AGTR1基因
帶FAM熒光基團探針3: 5'
有義引物l，反義引物l、帶VIC熒光基團探針 上rs5186號SNP位點多態性；
有義引物2，反義引物2、帶VIC熒光基團探針2、帶FAM熒光基團探針2特異地針對檢測GNB3基因 上rs5443號SNP位點多態性；
有義引物3，反義引物3、帶VIC熒光基團探針3、帶FAM熒光基團探針3特異地針對檢測N0S3基因 上rsl799983號SNP位點多態性；
3個SNP位點分別進行3次獨立的熒光定量PCR反應，每個反應的體系為總體積lOpl，包含濃度為 20ng/nl的DNA模板2pl、 1^1 10 X熒光定量PCR反應緩沖液、0. 1^1 25mM dNTP混合液、0. 6^1 25mM MgCl2 溶液、0.025^1 (5units/pl) Taq DNA聚合酶、20pM的有義引物和反義引物各0. 225pl、 10pM的帶VIC 熒光探針和帶FAM熒光探針各0. 25^1 ，去離子水5. 325nl 。
在PCR擴增儀上進行反應，反應條件為5(TC、 2分鐘，95°C、 IO分鐘，進行60個循環的95°C、 30秒， 60'C、 l分鐘。反應結束后在熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。
步驟4:基因型分析
根據試劑盒使用說明書標示的基因分型圖示對4個SNP位點進行基因型分析。
熟悉電泳檢測技術的本領域技術人員能夠通過辨識電泳圖上DNA條帶的位置和數量來確定所檢測的 SNP位點的基因型。
熟悉熒光定量PCR技術的本領域技術人員能夠通過辨識熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量，根 據不同序列探針VIC和FAM熒光信號的強弱即可確定所檢測的SNP位點的基因型。
實施例2.對人們進行個體心血管健康評估和管理的服務 步驟l: DNA提取
由醫院檢驗科醫師指導被檢者使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用硅膠吸附法進行口腔上皮 細胞的DNA抽提。
步驟2:基因分型檢測
使用本發明提供的試劑盒，對被檢測者基因組DNA的ACE基因上rs4646994號SNP位點進行PCR擴增 和電泳檢測，對AGTR1基因上rs5186號SNP位點、GNB3基因上rs5443號SNP位點、N0S3基因上rsl799983 號SNP位點進行熒光定量PCR檢測，確定這4個SNP位點的基因型。
步驟3:個體心血管疾病發病遺傳風險的分析
通過對被檢測者SNP基因型的分析，出具個體心血管疾病發病遺傳風險的分析報告單。報告中詳細說 明了被檢測者心血管疾病發病遺傳風險的高低，并由醫師向被檢者詳細說明和解讀個體心血管疾病發病遺 傳風險分析報告單。
步驟4:個體心血管健康評估和管理
由醫師向被檢者詳細說明心血管疾病發病遺傳風險相關的這4個SNP位點的基因型，以及被檢者的心 血管健康遺傳體質，制定符合被檢者遺傳體質的健康管理計劃。
〈110>上海主健生物工程有限公司
〈120>遺傳信息及健康評估管理
<160> 14
<210> 1 〈211> 24 〈212〉 DNA <213>人工序列
<220>
〈223〉引物 〈400〉 1
CTGGAGACCA CTCCCATCCT TTCT
<210> 2 〈211〉 25 <212> DNA 〈213>人工序列
〈220>
<223>引物 〈400〉 2
GATGTGGCCA TCACATTCGT CAGAT
<210> 3 〈211> 13 〈212〉腿 <213>人工序列
〈220>
<223>引物 <400> 3
TGCAGCACTT CAC
<210> 4 <211> 14 〈212>腿 〈213〉人工序列
〈220〉
序列表
24
25 <223〉引物 〈400〉 4
TCCTTCAATT CTGA 14
〈210〉 <211> <212> 〈213>
5
19 DNA
人工序列
<220>
<223>引物 〈400〉 5
AGAGCATCAT CTGCGGCAT 19
〈210> <211〉 <212> <213>
6
15
DNA
人工序列
<220>
〈223〉引物 <400> 6
GGCGGCCACT GAGGG 15
〈210〉 〈211〉 〈212〉 〈213>
7
12 腿
人工序列
〈220〉
〈223>引物 <400> 7
CCCTGCTGCT GC 12
〈210〉 8
〈211> 13 〈212>腿 〈213>人工序列
<220>
<223>引物
<400〉 8
GGGGCAGAAG GAA
<210〉 9 〈211〉 15 〈212〉 DNA <213>人工序列
<220>
<223〉探針 <400> 9
TGAGCaTTAG CTACT
<210> 10 <211> 14 <212〉 DNA <213>人工序列
<220>
<223〉探針 <400> 10
TGAGCcTTAG CTAC
<210〉 11 〈211> 12 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>探針 〈400> 11
ACGTCcGTGG CC
〈210> 12 〈211〉 13 <212>腿 〈213〉人工序列
〈220>
〈223>探針 〈400〉 12
ACGTCtGTGG CCT
說明書第7/8頁
13
15
14
12
<210> 13 〈211> 12 <212>腿 <213>人工序列
<220〉
<223〉探針 <400> 13
AgCCCCCAGA AC 12
〈210〉 14 〈211〉 13 <212〉廳 〈213〉人工序列
<220>
<223>探針 <400> 14
GAtCCCCCAG AAC 1權利要求
1.一種檢測個體心血管疾病遺傳風險和健康評估和管理的試劑盒，其特征在于包括檢測血管緊張素轉換酶基因(ACE)上rs4646994號SNP多態性基因型的電泳檢測引物對、檢測血管緊張素II-1型受體基因(AGTR1)上rs5186號SNP位點、G蛋白3亞單位基因基因(GNB3)上rs5443號SNP位點、內皮型一氧化氮合成酶(NOS3)上rs1799983號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針對、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液、PCR反應緩沖液、去離子水等。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的電泳檢測引物對具有SEQ ID NO: 1和2所示 序列。
3. 根據權利要求l所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指具有SEQIDNO: 3和4、 5 和6、 7和8所示序列的引物對。
4. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針對是指具有SEQ ID NO: 9和 10、 11和12、 13和14所示序列的Taqman探針對。
5. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括1) 熒光定量PCR反應套裝10 X熒光定量PCR反應緩沖液3pl， 25mM dNTP混合液0.3nl， 25mM MgC12 溶液1.8^1， 5units/Vl Taq DNA聚合酶0.075^1， 20MM特異性引物對每條引物各0.225^1， IOMM特異性熒 光探針對每條探針各0.25jil，去離子水15.975nl。2) 電泳檢測套裝10X PCR反應緩沖液2. 5W， 25mM dNTP混合液0. 2W， 25mM MgC12溶液1. 5W， 5units/W Taq DNA聚合酶0. 125Hl， 20幽特異性引物對每條引物各0.2514，去離子水19. 175W。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
全文摘要
本發明公開了一種檢測個體心血管疾病遺傳風險和健康評估和管理的試劑盒。該試劑盒包括檢測血管緊張素轉換酶基因(ACE)上rs4646994號SNP多態性基因型的電泳檢測引物對、檢測血管緊張素II-1型受體基因(AGTR1)上rs5186號SNP位點、G蛋白3亞單位基因(GNB3)上rs5443號SNP位點、內皮型一氧化氮合成酶基因(NOS3)上rs1799983號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針對、熒光定量PCR常規組件、PCR反應組件等。通過評估被檢者心血管疾病的發病遺傳風險對被檢者進行心血管健康的評估，并根據被檢者心血管疾病發病遺傳風險相關的這4個SNP位點的基因型，制定符合被檢者遺傳體質的健康管理計劃。
文檔編號C12Q1/68GK101354344SQ20071004428
公開日2009年1月28日 申請日期2007年7月27日 優先權日2007年7月27日
發明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司