專利名稱：一種雞白細(xì)胞介素1β基因及其真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及免疫效應(yīng)的制作方法
一種雞白細(xì)胞介素i e基因及其真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及免疫效應(yīng)[技術(shù)領(lǐng)域]本發(fā)明涉及動物醫(yī)藥生物工程領(lǐng)域，是一種雞白細(xì)胞介素ie基因及其真 核表達(dá)質(zhì)粒與應(yīng)用。[背景技術(shù)]細(xì)胞因子作為機(jī)體內(nèi)細(xì)胞之間相互作用的主要介質(zhì)，在機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、造血功能、胚胎發(fā)育及機(jī)體的生長發(fā)育等各個方面都起重要作用。20世紀(jì)80年 代以來，隨著細(xì)胞因子的研究進(jìn)展，人們逐漸認(rèn)識到細(xì)胞因子的免疫增強(qiáng)作用。細(xì)胞因子對 免疫細(xì)胞的分化和增殖、抗原的識別和提呈、抗體的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)、免疫細(xì)胞之間的聯(lián)絡(luò)等一 系列從識別到效應(yīng)的免疫應(yīng)答過程都有極其重要的作用。可以說細(xì)胞因子對于免疫系統(tǒng)就如 激素對于內(nèi)分泌系統(tǒng)，神經(jīng)遞質(zhì)對神經(jīng)系統(tǒng)一樣重要。細(xì)胞因子控制著疫苗免疫和病原微生 物感染機(jī)體后免疫應(yīng)答的類型和方向，其對免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)方式最為接近機(jī)體正常的調(diào)節(jié)機(jī) 理，細(xì)胞因子作為疫苗增強(qiáng)劑具有其他佐劑無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。白細(xì)胞介素l (IL-1)是一種主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞合成分泌的蛋白多肽，是細(xì)胞因 子的一種。IL-l有兩個分子亞型(IL-la、 IL-ip)，這兩個亞型之間氨基酸序列有很大差別，但 他們識別同一個受體功能基本相同。哺乳動物IL-l由p和l3兩條鏈組成，具有廣譜的免疫和非 免疫活性。1982年HayariY第一次證實(shí)了雞IL-l(CML-l)的存在，用脂多糖刺激雞的脾細(xì)胞， 在其細(xì)胞上清中檢測到IL-1樣生物活性物質(zhì)，雞IL-1樣活性最初發(fā)現(xiàn)于受刺激的脾細(xì)胞條件 培養(yǎng)基中。Klasking等將其部分純化后發(fā)現(xiàn)，雞IL-1對鼠胸腺細(xì)胞具有微弱的刺激活。也能微 弱地誘導(dǎo)對鼠L-M細(xì)胞的殺傷活性。1998年，Weining等利用LPS刺激HD-11細(xì)胞，構(gòu)建cDNA文庫，對所得到的克隆進(jìn)行功 能表達(dá)，成功地克隆了雞的編碼ChIL-lp (Chicken IL-lp)cDNA。 ChIL-lpcDNA最初的翻譯產(chǎn) 物含267個氨基酸，與人IL-ip的氨基酸同源性為250/。。類似哺乳動物的IL-1(3，也缺少信號肽， 可能是先合成無活性的前體分子，然后剪切成有活性的分子。其在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物接 種雞，可明顯誘導(dǎo)血清皮質(zhì)醇(corticosterone.) —過性的增加。另夕卜，Byme等報道，雞IL-1(3 在抗球蟲感染的免疫反應(yīng)中具有重要作用。Brezinschek等報道雞IL-l分子量在16-21.5kDa不等，但也有人報道其分子量為5kDa,目前 國內(nèi)關(guān)于IL-ip基因的研究比較少，關(guān)于其免疫佐劑效應(yīng)的研究更少。2003年張永霞等[52]克隆 IL-l(3與pUC19載體連接，用地高辛隨機(jī)引物法標(biāo)記IL-lpcDNA制備探針，原位雜交檢測禽腦 脊髓炎病雞與正常雞腦組織中IL-lpmRNA表達(dá)情況，結(jié)果表明腦炎病雞腦中IL-ipmRNA 表達(dá)水平高于正常雞。2004年邵衛(wèi)星等，盧建紅等克隆了IL-1I3基因，以雞痘病毒(FPV)為活 載體，構(gòu)建了表達(dá)ChlL-l(3的重組雞痘病毒rFPV-IL-ip。應(yīng)用XTT / PMS方法檢測rFPV-IL-l卩感染的成纖維細(xì)胞72h后表達(dá)ChlL-ip的生物活性，效價為l. 0xl05U/mI ，證明FPV能有效 地表達(dá)CML-lj3。 2006年邵衛(wèi)星等在新城疫LaSota疫苗免疫不全的情況下，重組雞痘病毒(rFPV)表達(dá)的IL-lp、 IL-2和髓細(xì)胞生長因子(MGF)是否具有免疫增強(qiáng)作用。IO日齡SPF 雞隨機(jī)分成8組(1 Vin)，每組18只，每只接種l個半數(shù)保護(hù)劑量(PD50)的LaSota疫苗， 同時免疫不同劑量的表達(dá)雞IL-ip、 IL-2或cMGF的rFPV (rFPV-IL-lp、 IL-2、 cMGF)。結(jié)果 表明，rFPV表達(dá)的IL-l(3、 IL-2或cMGF可以消除雞痘病毒在免疫早期對雛雞體重增長的影響； 一定劑量的IL-1(3和IL-2可使雞脾臟中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的總體水平提高；免疫21d后 用新城疫的F48E8強(qiáng)毒經(jīng)肌肉攻毒。 一定劑量的IL-ip和IL-2能提高La Sota疫苗的免疫保護(hù)率。 本研究表明rFPV表達(dá)的IL-ip和IL-2在一定的劑量下可以增強(qiáng)LaSota疫苗的免疫效果，具有免 疫增強(qiáng)作用。與其他細(xì)胞因子相比較，IL-ie在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中屬于參與免疫應(yīng)答早期階段 的細(xì)胞因子，且有研究表明，IL-ie可能是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)功能形成的中心，促進(jìn)胸腺細(xì)胞、T 細(xì)胞的活化、增殖和分化，促進(jìn)多種細(xì)胞因子(如IL-2、 IFN-Y等)的分泌，在抗細(xì)胞內(nèi)病 原體的感染中起著關(guān)鍵的作用，因此IL-1 e是具有較好應(yīng)用前景的免疫佐劑。 [發(fā)明內(nèi)容l本發(fā)明根據(jù)Genbank中注冊的雞白細(xì)胞介素ie基因序列設(shè)計引物，以IL-1 P 基因的重組質(zhì)粒PCIL-為模板，用PCR方法擴(kuò)增雞白細(xì)胞介素ie基因，并將PCR產(chǎn)物經(jīng) BamH I和EcoR I雙酶切定向插入以BamH I和EcoR I雙酶切處理的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+)中，經(jīng)雙酶切和PCR鑒定，構(gòu)建了雞白細(xì)胞介素ie成熟基因真核表達(dá)質(zhì)粒，研制了分子佐劑pDNAIL-ip。該分子佐劑pDNAIL-ip可用于作為預(yù)防雞傳染病DNA疫苗的佐劑。 [具體實(shí)施方式
l1. 本發(fā)明使用的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 ( + )為Invitrogen公司的產(chǎn)品。雞白細(xì)胞介素lp 基因的重組質(zhì)粒PCIL-1 e為四川大學(xué)動物疾病防控生物工程研究中心克隆并保存。使用的限 制性內(nèi)切酶EcoRI 、 BamHI ， T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶等均購自成都天泰生命科技有限公司。2. 引物是根據(jù)Genbank上已發(fā)表的IL-1(3序列(Y15006)和真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)上的 酶切位點(diǎn)設(shè)計并合成的，并在基因上下游分別引入酶切位點(diǎn)BamH I和EcoR I 。引物序列為上游引物5'. CAAGa47UCATGGCGTTCGTTCCCGACCT -3 ' 下游引物5'- GAAOWrCTCAGCGCCCACTTAGCTTG -3，3. 雞白細(xì)胞介素lp基因的PCR獲取，以PCIL-1 e質(zhì)粒為模板，加入TaqDNA聚合酶、上下 游引物、dNTP進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR的反應(yīng)體系為10Xbuffer 5uL， 4XdNTPmix (2. 5mmol/L) 4uL，上、下游引物(20umol/L)各1 u L， Mgcl2 4uL， PUCIL18質(zhì)粒1 u L， ddH20 33.5 PL， Taq酶(5u/uL) 0.5nL。反應(yīng)參數(shù)為95。C處理5min，然后94。Clmin、 55。Clmin、72'C2min，共31個循環(huán)，72。C延伸10min。 PCR產(chǎn)物在2. 0%瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見約為 0.8kb的擴(kuò)增條帶，大小與預(yù)期的結(jié)果一致。雞白細(xì)胞介素lp的基因序列:CCGACCAGGTCAACATCGCCACCTACAAGCTAAGTGGGCGCTGA4. 雞白細(xì)胞介素ie基因真核表達(dá)質(zhì)粒pDNAIL-ip的構(gòu)建，將雞白細(xì)胞介素1P基因的PCR 產(chǎn)物用酚氯仿抽提純化，乙醇沉淀，干燥后用TE溶解。雞白細(xì)胞介素1P基因的PCR純化產(chǎn) 物用EcoRI、 BamH I進(jìn)行雙酶切處理，膠回收0.8kb的條帶。以同樣的方法對pcDNA3. 1 (+) 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理，膠回收5.4kb左右DNA片段。分別取5nL雙酶切后膠回收的雞白細(xì)胞介素ie基因片段，加入10xT4 DNA Ligase buffer luL， T4DNA連接酶1 ii L，酶切處理載體pcDNA3. 1 (+) 1 y L， ddH20 2uL， 16。C連 接18小時。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的LB平板上37'C培養(yǎng)。5. 雞白細(xì)胞介素1 P基因真核表達(dá)質(zhì)粒pDNAIL-l p的雙酶切鑒定，在含有氨芐青霉素的LB 平板上挑取單個菌落，抽提質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切鑒定。將雞白細(xì)胞介素lp基因真核表達(dá)質(zhì) 粒pDNAIL-l p分別用EcoR I 、 BamH I進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物在0. 8%瓊脂糖凝膠電泳觀察， PCIL18雙酶切后產(chǎn)生約為5. 4kb和0. 8kb左右的兩條帶，證明己經(jīng)成功構(gòu)建了雞白細(xì)胞介素 18基因真核表達(dá)質(zhì)粒pDNAIL-l 0 。6. 雞白細(xì)胞介素lp基因真核表達(dá)質(zhì)粒pDNAIL-iP的PCR鑒定，在含有氨芐青霉素的LB平 板上挑取單個菌落，抽提質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定。以pDNAIL-iP質(zhì)粒為模板，加入Taq DNA 聚合酶、上下游引物、dNTP進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR的反應(yīng)體系為10Xbuffer 5u L, 4XdNTPmix(2.5關(guān)ol/L) 4u丄，上、下游引物(20yniol/L)各1 u L， Mgcl2 4yL， PCIL18質(zhì)粒1 u L， ddH20 33.5uL， Taq酶(5u/iiL) 0.5uL。反應(yīng)參數(shù)為95。C處理5min，然后94。Clmin、 55。Clmin、 72。C2min，共31個循環(huán)，72。C延伸10min。 PCR產(chǎn)物在2. 0%瓊脂糖凝膠電泳觀察， 可見約為0.8kb的擴(kuò)增條帶，證明己經(jīng)成功構(gòu)建了雞白細(xì)胞介素1P基因真核表達(dá)質(zhì)粒 pDNAIL-1 & 。7. 雞白細(xì)胞介素W基因真核質(zhì)粒pDNAIL-iP的研制。從LB固體培養(yǎng)基中挑取單菌落，接種于盛有10ml液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37。C震蕩過夜培養(yǎng)。在1000ml的三角瓶中加入100ml 的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入5ml的菌種，37°C， 200rpm/min，培養(yǎng)20h.。用常規(guī)提取質(zhì)粒的堿裂 解方法進(jìn)行質(zhì)粒的大量抽提，用硅藻土吸附方法進(jìn)行純化。電泳鑒定質(zhì)粒的純度和含量。質(zhì) 粒用PBS緩沖液稀釋到lmg/ml，即為雞白細(xì)胞介素1 P基因分子佐劑pDNAIL-l P 。該分子佐 劑與DNA疫苗混合，質(zhì)脂體包裹后用肌肉注射的方法進(jìn)行預(yù)防接種。8.用該分子佐劑與禽傳染性支氣管炎DNA疫苗聯(lián)合應(yīng)用，免疫SPF雞，通過檢測血清IBV 特異性抗體、CD4+、 CD8+、 CD3+T淋巴細(xì)胞百分含量來檢測其對禽傳染性支氣管炎DNA疫苗的 免疫增強(qiáng)作用。將2日齡健康SPF雛雞140只，隨機(jī)分成7個組，每組20只，分別用PBS液(O. 2ml)、 IBV滅活疫苗(0.2ml)、 IBV弱毒疫苗(0. 2ml)、 pcDNA3. 1 (150ug)、 IBVDNA疫苗(150ug)、 pDNAIL-IP (50wg)、 IBV DNA疫苗+pDNAIL-1 e (150u g+50y g)進(jìn)行免疫，于免疫后7、 14、 21、 28、 35天，隨機(jī)取5只頸靜脈采血，分離血清。采用間接ELISA法檢測血清IBV特異性抗體； 同時采取抗凝血分離淋巴細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞類CD4+、 CD8+、 CD3+T淋巴細(xì)胞 百分含量的測定，于免疫后35天用IBV強(qiáng)毒進(jìn)行攻毒保護(hù)實(shí)驗。測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在免疫后 pDNAIL-1 e +0歴組在免疫后血清18￥特異性抗體水平14天就極顯著高于滅活苗和弱毒苗組，在 21天高于所有實(shí)驗組，差異極顯著，在28天與IBVDNA疫苗組比較差異顯著；測定003+T淋巴 細(xì)胞結(jié)果表明，在免疫后14天pDNAIL-le+IBV DNA組高于IBV DNA疫苗組，差異極顯著，21 天與所有實(shí)驗組比較均出現(xiàn)差異極顯著；檢測CD4+T淋巴細(xì)胞結(jié)果表明，7天時pDNAIL-l 0 +IBV DNA組與pcDNA3. l組、滅活苗組、弱毒苗組和PBS苗組比較差異顯著，在免疫后14天、21天與 IBV DNA疫苗組比較，差異極顯著;研究CD8+結(jié)果表明，在免疫后14天，pDNAIL-1 e+IBV DNA 組和IBV DNA疫苗組比較差異極顯著，21天時與除DNA疫苗組外的其它五個實(shí)驗組比較差異顯 著。攻毒實(shí)驗結(jié)果表明，pDNAIL-l e+IBV DNA組死亡保護(hù)率(90%)高于IBVDNA疫苗組(85%) 與弱毒苗組(80%)，但低于滅活苗組的保護(hù)率(100%)。實(shí)驗結(jié)果說明分子佐劑pDNAIL-l e對IBV DNA疫苗具有一定的免疫增強(qiáng)作用。雞白細(xì)胞介素ie的基因序列表:Organization ApplicantStreet: City : State : Country : PostalCode : PhoneNumber : FaxNumber : Email Address : < 110> OrganizationName :四川大學(xué)Application Project<120> Title : —種雞白細(xì)胞介素1 P基因及其真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及免疫效應(yīng) <130>AppFileReference : <140> CurrentAppNumber : <141> CurrentFilingDate : --Sequence<213> OrganismName : Gallus gallus <400> PreSequenceString :atggcgttcg ttcccgacct ggacgtgctg gagagcagca gcctcagcga agagaccttc tacggcccct cctgcctctg cctgcagaag aagcctcgcc tggattctga gcacaccaca gtggacgtgc aggtgacggt gcggaaggga cgtggtgccc ggagctttcg gcgggccgcc gtgctggtgg tggccatgac caaactgctg cggaggccga ggagcaggga ctttgctgac agcgacctga gcgcgctcct ggaggaggtt tttgagcccg tcaccttcca gcggctggag agcagctacg ccggggcgcc cgccttccge tacacccgct cacagtcctt cgacatcttc gacatcaacc agaagtgctt cgtgctggag tcacccaccc agctggtggc cctgcacctc caggggcccc cctccagcca gaaagtgagg ctcaacattg cactgtgccg gccccgaggc ccacggggca gcgctggaac tgggcagatg ccagtggcac tgggcateaa gggctacaag ctctacatgt cgtgtgtgat gagcggcacc gagcccacac tgcagctgga ggaagccgac gtcatgcggg acatcgacag cgtcgagctg acccgcttca tcttctaccg cctggacagc ccgactgagg gcaccacgcg ctttgagtcg gccgccttcc ccgggtggtt catctgcacc tccctgcagc cccggcagcc cgtgggcatc accaaccaac ccgaccaggt caacatcgcc acctacaagc taagtgggcg ctga <212>Type :DNA <211> Length : 804SequenceName : ChIL-ipSequenceDescription :60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 78080權(quán)利要求
1.一種雞白細(xì)胞介素1β基因及其真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及免疫效應(yīng)，其特征在于用分子生物學(xué)方法將雞白細(xì)胞介素1β基因插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建能表達(dá)雞白細(xì)胞介素1β基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，研制分子佐劑pDNAIL-1β，該佐劑可用于作為雞傳染病DNA疫苗的免疫增強(qiáng)劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的真核表達(dá)質(zhì)粒pDNAIL-ip，其特征在于用雞白細(xì)胞介素 1 e基因經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切后，插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，構(gòu) 建真核表達(dá)質(zhì)粒，研制DNA疫苗分子佐劑pDNAIL-lp。
3. 權(quán)利要求2所述的真核表達(dá)質(zhì)粒pDNAIL-ip用于作為雞傳染病DNA疫苗的免 疫增強(qiáng)劑。
全文摘要
本發(fā)明是一種雞白細(xì)胞介素1β基因及其真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建與免疫效應(yīng)。本發(fā)明根據(jù)Genbank中注冊的雞白細(xì)胞介素1β蛋白基因序列設(shè)計引物，以雞白細(xì)胞介素1β蛋白基因的重組質(zhì)粒PCIL-1β為模板，用PCR方法擴(kuò)增雞白細(xì)胞介素1β，并將PCR產(chǎn)物經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切定向插入以BamH I和EcoR I雙酶切處理的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，成功的構(gòu)建了雞白細(xì)胞介素1β成熟蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒，研制出分子佐劑pDNAIL-1β。該分子佐劑可作為禽類DNA疫苗的免疫增強(qiáng)劑。通過檢測血清IBV特異性抗體、CD4+、CD8+、CD3+百分含量，研究了該分子免疫佐劑對禽傳染性支氣管炎DNA疫苗的免疫增強(qiáng)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)分子佐劑pDNAIL-1β對IBV DNA疫苗具有一定的免疫增強(qiáng)作用。
文檔編號C12N15/79GK101235374SQ20071005044
公開日2008年8月6日 申請日期2007年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月8日
發(fā)明者余協(xié)中, 夏青青, 毅 張, 徐永莉, 王紅寧, 田國寶 申請人:四川大學(xué)