專利名稱：一種植物wrky轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種WRKY轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻是單子葉植物研究的模式植物。與其它禾本科植物，如小麥、玉米、高梁、甘蔗基因組間存在共線性(colineariy)。水稻是基因組最小、進(jìn)化程度最低的禾本科植物。因此，水稻基因組結(jié)構(gòu)與功能的研究對其它禾本科植物的相關(guān)研究具有很大的借鑒意義。隨著水稻基因組全序列測定的完成，發(fā)現(xiàn)新基因和鑒定基因的功能是功能基因組研究的迫切任務(wù)。水稻又是重要的經(jīng)濟(jì)作物，是世界半數(shù)以上人口的主要食物來源。從水稻基因組中挖掘有用的基因，用于提高產(chǎn)量、改善品種、提高抗逆性，是目前植物功能基因組學(xué)和農(nóng)業(yè)高技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
轉(zhuǎn)錄因子也稱為反式作用因子，是能夠與真核基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性相互作用的DNA結(jié)合蛋白，對所控制的基因起轉(zhuǎn)錄激活或抑制作用。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，轉(zhuǎn)錄因子一般由DNA結(jié)合區(qū)(DNA-binding domain，BD)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)(transcription regulation domain)(包括激活區(qū)或抑制區(qū))、寡聚化位點(diǎn)(oligomerization site)以及核定位信號(nuclear localization signal，NLS)這4個功能區(qū)域組成。轉(zhuǎn)錄因子通過這些功能區(qū)域與基因的啟動子順式元件結(jié)合、或者與其它轉(zhuǎn)錄因子或蛋白互作以調(diào)控基因的表達(dá)。但并不是每個轉(zhuǎn)錄因子都含有這些區(qū)域，少數(shù)不含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子可以與含上述功能域的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，從而實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能。轉(zhuǎn)錄因子處于信號途徑的中游，起承上啟下的作用，上可接受被感知、加工放大的信號，下則通過與其它轉(zhuǎn)錄因子或輔助蛋白的相互作用結(jié)合特定基因的啟動子元件，調(diào)控基因的表達(dá)；同時，可作為共同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組分位于幾條信號的交匯點(diǎn)，參與信號途徑的整合與對話。因此，要從分子水平了解植物生長發(fā)育和適應(yīng)外界環(huán)境的生理柔性的機(jī)制，必須詳細(xì)研究各類轉(zhuǎn)錄因子在生物體內(nèi)的功能。
SPF1是從甜馬鈴薯中分離的一個具有C2H2鋅指紋的調(diào)節(jié)蛋白(Ishiguro S，Nakamura K.(1994).Characterization of a cDNA encoding a novel DNA-bindingprotein，SPF1，that recognizes SP8 sequences in the 5’upstream regions ofgenes coding for sporamin and beta-amylase from sweet potato.Mol Gen Genet，244563-571)，隨后，在幾種植物中發(fā)現(xiàn)了相似的蛋白，如野燕麥的ABF1和ABF2(Rushton PJ，Macdonald H，Huttly AK，Lazarus CM，Hooley R.(1995).Membersof a new family of DNA-binding proteins bind to a conserved cis-element inthe promoters of alpha-Amy2 genes.Plant Mol Biol，29691-702)、擬南芥的ZAP1(Chern M-S，Eiben HG，BustosMM.(1996).The developmentally regulatedbZIP factor ROM1 modulates transcription from lectin and storage proteingenes in bean embryos.Plant J，10135-148)和歐芹的PcWRKY1，2，3(RushtonPJ，Torres JT，Parniske M，Wernert P，Hahlbrock K，Somssich IE.(1996).Interaction of elicitor-induced DNA-binding proteins with elicitor responseelements in the promoters of parsley PR1 genes.EMBO J，155690-5700)。這些蛋白的共同結(jié)構(gòu)特征是，都含一個高度保守的DNA結(jié)合域，其中的WRKYGQK是非常保守的序列，稱WRKY結(jié)構(gòu)域。含有該結(jié)構(gòu)域的蛋白因而被統(tǒng)稱為WRKY蛋白(Eulgem T，Rushton P J，Robatzek S，Somssich IE.(2000).The WRKYsuperfamily of plant transcription factors.Trends Plant Sci，5199-206)。據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，到目前為止，大約有20余種植物發(fā)現(xiàn)有WRKY蛋白(Wu KL，Guo ZJ，Wang HH，Li J.(2005).The WRKY Family of Transcription Factors in Rice andArabidopsis and Their Origins.DNA Res，129-26)。WRKY蛋白在高等植物中構(gòu)成一個基因超家族(superfamily)。擬南芥中有74個成員(Kalde M，Barth M，Somssich IE，Lippok B.(2003).Members of the Arabidopsis WRKY group IIItranscription factors are part of different plant defense signaling pathways.Mol Plant Microbe Interact，16295-305)。水稻中有100余個成員(Zhang YJ，Wang LJ.(2005).The WRKY transcription factor superfamilyits origin ineukaryotes and expansion in plants.BMC Evol Biol，51)。近年來，許多實(shí)驗(yàn)表明，WRKY蛋白參與植物對生物和非生物脅迫反應(yīng)和一些生理發(fā)育過程而倍受關(guān)注。
WRKY基因的表達(dá)受生物或非生物脅迫誘導(dǎo)。真菌、細(xì)菌、病毒侵染、激發(fā)子、植物防衛(wèi)反應(yīng)的信號分子如水楊酸(SA)及其類似物、H2O2處理導(dǎo)致一些WRKY基因的表達(dá)上升(Eulgem T，Rushton PJ，Schmelzer E，Hahlbrock K，Somssich IE.(1999).Early nuclear events in plant defence signalingrapid geneactivation by WRKY transcription factors.EMBO J，184689-4699；Guo ZJ，Chen XJ，Wu XL，Ling JQ，Xu P.(2004a).Overexpression of the AP2/EREBPtranscription factor OPBP1 enhances disease resistance and salt tolerancein tobacco.Plant Mol Biol，55607-618)。擬南芥中，大部分WRKY成員的表達(dá)被SA和/或病原誘導(dǎo)(Kalde M，Barth M，Somssich IE，Lippok B.(2003).Members of the Arabidopsis WRKY group III transcription factors are partof different plant defense signaling pathways.Mol Plant Microbe Interact，16295-305；Dong J，Chen C，Chen Z.(2003).Expression profiles of theArabidopsisWRKY gene superfamily during plant defense response.Plant MolBiol，5121-37)。馬鈴薯WRKY基因與馬鈴薯抗病性數(shù)量性狀的形成有關(guān)，并受晚疫病菌誘導(dǎo)表達(dá)(Dellagi A，Helibronn J，Avrova AO，Montesano M，Palva ET，Stewart HE，Toth IK，Cooke DE，Lyon GD，Birch PR.(2000).A potato geneencoding a WRKY-like transcription factor is induced in interactions withErwinia carotovora subsp.atroseptica and Phytophthora infestans and iscoregulated with class I endochitinase expression.Mol Plant MicrobeInteract，131092-1101；Trognitz F，Manosalva P，Gysin R，Ninio-Liu D，SimonR，del Herrera MR，Trognitz B，Ghislain M，Nelson R.(2002).Plant defensegenes associated with quantitative resistance to potato late blight inSolanum phureja×dihaploid S.tuberosum hybrids.Mol Plant MicrobeInteract，15587-597)。非生物脅迫誘導(dǎo)的范圍很廣，包括傷害(Hara K，YagiM，Kusano T，Sano H.(2000).Rapid systemic accumulation of transcriptsencoding a tobacco WRKY transcription factor upon wounding.Mol Gen Genet，26330-37；Cheong YH，Chang HS，Gupta R，Wang X，Zhu T，Luan S.(2002).Transcriptional profiling reveals novel interactions between wounding，pathogen，abiotic stress，hormone responses in Arabidopsis.Plant Physiol，129661-677)、冷(凍)適應(yīng)(Huang T，Duman JG.(2002).Cloning andcharacterization of a thermal hysteresis(antifreeze)protein withDNA-binding activity from winter bittersweet nightshade，Solanum dulcamara.Plant Mol Biol，48339-350；Sanchez-Ballesta MT，Lluch Y，Gosalbes MJ，Zacarias L，Granell A，Lafuente MT.(2003).A survey of genes differentiallyexpressed during long-term heat-induced chilling tolerance in citrus fruit.Planta，21865-70)、干旱、高鹽、熱、氧化脅迫(Mare C，Mazzucotelli E，CrosattiC，F(xiàn)rancia E，Stanca AM，Cattivelli L.(2004).Hv-WRKY 38a newtranscription factor involved in cold-and drought-response in barley.PlantMol Biol，255399-416；Seki M，Narusaka M，Ishida J，Nan jo T，F(xiàn)ujita M，Oono Y，Kamiya A，Nakajima M，Enju A，Sakurai T，et al.(2002).Monitoringthe expression profiles of 7,000 Arabidopsis genes under drought，cold andhigh-salinity stresses using a full-length cDNA microarray.Plant J，31279-292)等。植物衰老過程中，一些WRKY基因的表達(dá)明顯上調(diào)(Hinderhofer K，Zentgraf U.(2001).Identification of a transcription factor specificallyexpressed at the onset of leaf senescence.Planta，213469-473；RobatzekS，Somssich IE.(2002).Targets of AtWRKY6 regulation during plantsenescence and pathogen defense.Gene Dev，161139-1149)。一些WRKY基因?qū)Χ喾N環(huán)境條件有反應(yīng)。如，病原、傷害都能誘導(dǎo)AtWRKY6、Tizz和OsiWRKY的表達(dá)(Robatzek S，Somssich IE.(2001).A new member of the Arabidopsis WRKYtranscription factor family，AtWRKY6，is associated with both senescence-and defence-related processes.Plant J，28123-133；Yoda H，Ogawa M，Yamaguchi Y，Koizumi N，Kusano T，Sano H.(2002).Identification ofearly-responsive genes associated with the hypersensitive response totobacco mosaic virus and characterization of a WRKY-type transcriptionfactor in tobacco plants.Mol Genet Genom，267154-161)，其中AtWRKY6還受衰老調(diào)節(jié)；大麥Hv-WRKY38受干旱、冷誘導(dǎo)。這些發(fā)現(xiàn)提示，WRKY參與了植物對脅迫的反應(yīng)和發(fā)育等生理過程，并且可能作為這些信號途徑的共同組分參與相互對話(cross talk)。最近，cDNA微陣列實(shí)驗(yàn)證明WRKY參與植物藍(lán)光應(yīng)答(Jiao Y，YangH，Ma L，Sun N，Yu H，Liu T，Gao Y，Gu H，Chen Z，Wada M，Gerstein M，ZhaoH，Qu LJ，Deng XW.(2003).A genome-wide analysis of blue-light regulationof Arabidopsis transcription factor gene expression during seedlingdevelopment.Plant Physiol，1331480-1493)。植物中，防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因的啟動子含有W盒元件。病原侵染或模擬病原接種處理下，WRKY基因被誘導(dǎo)表達(dá)。
從以上研究報(bào)道可以看出，WRKY家族基因參與許多生物或非生物脅迫反應(yīng)過程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子，名稱為OsWRKY89，其來源于水稻，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子功能的蛋白質(zhì)。
所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
其中，序列表中的序列2由263個氨基酸殘基組成。自序列2的氨基端第106至168位氨基酸殘基序列為WRKY結(jié)構(gòu)域。在該結(jié)構(gòu)域有一個典型的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域(自序列2的氨基端第130至168位氨基酸殘基序列)，屬于第IIIb亞組。在自序列2的氨基端第55至65位氨基酸殘基和自序列2的氨基端第87至92位氨基酸殘基區(qū)域有兩個核定位信號區(qū)。
上述植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因(OsWRKY89)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
上述植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的DNA；3)與序列表中SEQ ID №1的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。
其中，序列表中的SEQ ID №1由792個脫氧核苷酸組成，自5′端第1位至792位脫氧核苷酸為編碼序列。
所述植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的基因組基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的DNA；3)與序列表中SEQ ID №3的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID №3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
序列表中序列3，由990個脫氧核苷酸組成，含有兩個內(nèi)含子(自序列3的5′端第267位至359位脫氧核苷酸，自序列3的5′端第469至573位脫氧核苷酸)和三個外顯子(自序列3的5′端第1位至266位脫氧核苷酸，自序列3的5′端第360至468位脫氧核苷酸，自序列3的5′端第574至990位脫氧核苷酸)。
含有本發(fā)明基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及工程菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子含1個WRKY結(jié)構(gòu)域，在該結(jié)構(gòu)域有一個典型的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，屬WRKY第IIIb成員。它與水稻或其它物種的WRKY蛋白的同源性低，說明它是新的WRKY成員。該植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子能與W盒元件特異的結(jié)合，N端的亮氨酸拉鏈樣結(jié)構(gòu)參與蛋白質(zhì)同源互作和DNA與蛋白質(zhì)互作。該植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子是核蛋白。本發(fā)明的植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄激活活性，C端的酸性區(qū)(自氨基端第197位至263位氨基酸殘基)是負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄激活的區(qū)域；亮氨酸拉鏈樣結(jié)構(gòu)增強(qiáng)該蛋白的轉(zhuǎn)錄激活能力。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄受多種非生物脅迫和激素誘導(dǎo)。UV-B、茉莉酸甲酯能快速、強(qiáng)烈地誘導(dǎo)其表達(dá)；機(jī)械傷害、高鹽、冷(4℃)、熱(37℃)和乙烯利、脫落酸也能誘導(dǎo)其表達(dá)；而UV-A、水楊酸、赤霉素處理下，其表達(dá)無明顯變化。本發(fā)明的植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的T2代植株矮化，不定根少，超表達(dá)T2代植株對UV-B抗性增強(qiáng)，而干涉轉(zhuǎn)基因植株卻使UV-B抗性減弱，表明該基因介導(dǎo)了植物對紫外的防衛(wèi)反應(yīng)。


圖1為OsWRKY89及缺失突變體的原核表達(dá)。
圖2為OsWRKY89與W盒特異結(jié)合。
圖3為OsWRKY89的同源二聚化。
圖4為OsWRKY89的亞細(xì)胞定位。
圖5為OsWRKY89的轉(zhuǎn)錄激活活性分析和轉(zhuǎn)錄激活域的確定。
圖6為OsWRKY89在激素處理和脅迫下的表達(dá)。
圖7為OsWRKY89超表達(dá)載體(A)和OsWRKY89 RNAi載體(B)示意圖。
圖8為OsWRKY89超表達(dá)苗的表型觀察。
圖9為OsWRKY89超表達(dá)和干涉植株對UV-B的抗性。
具體實(shí)施例方式
為了更好地理解本發(fā)明，以下通過實(shí)施例予以進(jìn)一步的說明，但并非對本發(fā)明的限制。
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實(shí)驗(yàn)過程中涉及到的限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶由寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)，參照使用說明書使用。
實(shí)施例1、OsWRKY89 cDNA的分離1、OsWRKY89 cDNA的分離用WRKY結(jié)構(gòu)域?qū)λ净蚪M數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST搜索，通過基因注釋(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/)和與公布的EST或cDNA比較，發(fā)現(xiàn)了100個完整的WRKY基因。在此基礎(chǔ)上，從水稻中花17(購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院杭州水稻研究所)中分離了1個WRKY基因的cDNA，命名為OsWRKY89。對這個基因的生化功能、表達(dá)模式及在體內(nèi)的功能進(jìn)行分析。
根據(jù)BAC克隆號OSJNBb0004B05的序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增OsWRKY89基因的引物w89F和w89R等(各引物序列如表1所示)。以w89F和w89R為引物，用LaTaq DNA聚合酶通過RT-PCR從水稻中擴(kuò)增出OsWRKY89 cDNA。水稻用UV-B照射15分鐘，暗修復(fù)6小時后取樣，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增在DNA thermal cyclerPTC-220(MJ Research，USA)中進(jìn)行。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性3分；再94℃30秒，58℃30秒，72℃50秒，30個循環(huán)，最后在72℃下延伸10分。擴(kuò)增得到792bp的cDNA片段。PCR產(chǎn)物純化后，連接到pUCmT載體上，測序驗(yàn)證，測序表明獲得的片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，將其命名為OsWRKY89。自序列1的第1-792位核苷酸為編碼序列，編碼序列表中序列2的氨基酸殘基序列。將OsWRKY89與pUCmT的正確連接產(chǎn)物命名為pUCmT-OsWRKY89。
表1 擴(kuò)增OsWRKY89 cDNA的引物


數(shù)據(jù)庫的搜索用NCBI上的BLAST工具。蛋白質(zhì)序列的比對采用ClustalW和BOXSHADE程序(http://bioweb.pasteur.fr/)(Thompson等，1994)。蛋白質(zhì)螺旋-螺旋結(jié)構(gòu)采用COILS程序(http://www.isrec.isb-sib.ch)。蛋白質(zhì)的疏水性輪廓分析和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用DNAMAN軟件(http://lynnon.com/download/index/html/)。一級結(jié)構(gòu)分析表明，OsWRKY89與水稻或其它物種的WRKY蛋白的同源性不高，說明它是一個新的WRKY成員。自序列2的氨基端第106至168位氨基酸殘基序列為WRKY結(jié)構(gòu)域。在該結(jié)構(gòu)域有一個典型的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域(自序列2的氨基端第130至168位氨基酸殘基序列)，屬于第IIIb亞組。在自序列2的氨基端第55至65位氨基酸殘基和自序列2的氨基端第87至92位氨基酸殘基區(qū)域有兩個核定位信號區(qū)。水稻基因組序列分析結(jié)果表明OsWRKY89的基因組序列如序列表中序列3所示，由990個脫氧核苷酸組成，含有兩個內(nèi)含子(自序列3的5′端第267位至359位脫氧核苷酸，自序列3的5′端第469至573位脫氧核苷酸，)和三個外顯子(自序列3的5′端第1位至266位脫氧核苷酸，自序列3的5′端第360至468位脫氧核苷酸，自序列3的5′端第574至990位脫氧核苷酸)。通過COILS程序預(yù)測發(fā)現(xiàn)，在OsWRKY89中，該區(qū)域形成一個螺旋-螺旋結(jié)構(gòu)，其中的L-X6-A-X6-L-X6-S-X6-L可能形成亮氨酸拉鏈樣(leucine zipper-like)結(jié)構(gòu)(自序列2的氨基端第20位至48位氨基酸殘基)。DNAMAN軟件分析也表明，該結(jié)構(gòu)位于α-螺旋(α-helix)中。OsWRKY89的N端和C端的少部分區(qū)域的疏水性較強(qiáng)，其它區(qū)域的親水性較強(qiáng)。
實(shí)施例2、OsWRKY89的原核表達(dá)為了在E.coli中表達(dá)OsWRKY89，首先，以pUCmT-OsWRKY89為模板，用引物w89F(在起始密碼子前引入BamH I位點(diǎn))和w89Rxho(終止密碼子后引入Xho I位點(diǎn))擴(kuò)增其完整的編碼序列。PCR產(chǎn)物用BamH I和Xho I(Novagen，USA)雙酶切，然后插入到pET-29b(+)(購于TAKARA公司)表達(dá)載體BamH I和Xho I間，構(gòu)建成含有OsWRKY89的重組載體，將測序驗(yàn)證閱讀框一致和序列正確的載體命名為pET-OsWRKY89。
將上述構(gòu)建的表達(dá)載體pET-OsWRKY89或pET-29b(+)空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E.coliBl21(DE3)菌株，分別將經(jīng)鑒定表明轉(zhuǎn)入pET-OsWRKY89的E.coli Bl21(DE3)工程菌株命名為BlpET-OsWRKY89；將經(jīng)鑒定表明轉(zhuǎn)入pET-29b(+)的E.coli Bl21(DE3)工程菌株命名為BlpET-29b。
分別將BlpET-OsWRKY89或BlpET-29b接種到5mL含100mg L-1卡那霉素(Kan)的LB培養(yǎng)基中，37℃，180rpm振蕩培養(yǎng)12小時。取1mL菌液接種到100mL新鮮LB培養(yǎng)基(含100mg L-1Kan)中進(jìn)一步培養(yǎng)，待培養(yǎng)物的OD600達(dá)到0.5至0.7，加入0.4mmol L-1或0mmol L-1IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。分別經(jīng)37℃4h培養(yǎng)或25℃培養(yǎng)12-16小時，然后按照如下步驟進(jìn)行蛋白的提取和純化BlpET-OsWRKY89或BlpET-29b表達(dá)的蛋白的提取和純化步驟為4℃離心收集菌體，用STE(100mmol L-1NaCl，10mmol L-1Tris·HCl，1mmol L-1EDTA，pH 8.0)洗滌一次然后懸浮于100mmol L-1磷酸緩沖液(PBS)(含1mmol L-1DTT，1mmol L-1PMSF，1％Triton X-100)中。細(xì)胞反復(fù)凍融3次，再用超聲波破碎(3×45s，150W，1min間隔)。裂解液在12,000g，4℃下離心15分鐘，得到上清和沉淀。用Ni-NTA柱對蛋白進(jìn)行純化。純化方法按供應(yīng)商(Qiagen，Germany)說明書。往上清液加入1mL Ni-NTA樹脂，混勻后上柱。純化的蛋白經(jīng)冷凍干燥，加入10％甘油，1mmol L-1PMSF和1mmol L-1DTT，收集包含目標(biāo)蛋白的組分以用于蛋白復(fù)性。純化蛋白依次在含有6、4、3、2、1mol L-1脲的PBS(pH 7.4)中4℃透析，每次4h，最后用50mmolL-1的PBS平衡過夜。離心去除沉淀后冷凍濃縮，-80℃保存?zhèn)溆谩⑸鲜龅玫降纳锨搴统恋砗图兓牡鞍走M(jìn)行SDS-PAGE，以檢測蛋白的表達(dá)和表達(dá)在上清和沉淀中的分布。結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明，WRKY89蛋白在沉淀中表達(dá)比較多，在37℃和25℃下都可以誘導(dǎo)WRKY89蛋白表達(dá)。圖1中A為OsWRKY89在37℃的誘導(dǎo)表達(dá)，其中泳道1為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)BlpET-OsWRKY89表達(dá)的蛋白，泳道2為BlpET-29b經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白，泳道3為BlpET-OsWRKY89在37℃經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)的蛋白，泳道M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖1中B為表達(dá)的OsWRKY89在上清和沉淀中的分布情況，其中泳道M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，泳道1為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BlpET-OsWRKY89表達(dá)的蛋白，泳道2為37℃經(jīng)IPTG誘導(dǎo)BlpET-OsWRKY89的表達(dá)的總蛋白電泳，泳道3為37℃下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BlpET-OsWRKY89的表達(dá)，取培養(yǎng)液上清液電泳，泳道4為25℃誘導(dǎo)，37℃下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)BlpET-OsWRKY89表達(dá)的總蛋白電泳，泳道5為25℃下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)BlpET-OsWRKY89表達(dá)，取培養(yǎng)液上清液電泳；圖1中C為BlpET-OsWRKY89表達(dá)的OsWRKY89蛋白的純化，其中泳道M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為溶菌液，泳道3為洗脫液B，泳道4為洗脫液C，泳道5為洗脫液D，泳道6為洗脫液E；WRKY89蛋白在洗脫液E中洗下來。圖1中A、B、C中箭頭表示的為OsWRKY89蛋白。
實(shí)施例3、OsWRKY89與W盒元件的結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子與特定的順式元件結(jié)合是轉(zhuǎn)錄因子的典型特征。WRKY類轉(zhuǎn)錄因子可與含有TGAC核心序列的W盒特異性結(jié)合。利用這個特征鑒定OsWRKY89是否可以和W盒結(jié)合，從而確定OsWRKY89是否為WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子。
合成含有4個W盒的序列(TGAC和它的互補(bǔ)序列GTCA)的探針P225′GATCTGTGACTGGTCTGACGCCAGTCACGTCATG 3′(W盒)作為探針，將P22中W盒TGAC中的GA突變?yōu)镃T，其互補(bǔ)序列GTCA中的TC突變?yōu)锳G，即突變探針mP225′GATCTGTCTCTGGTCTCTCGCCAGAGACGAGATG 3′。標(biāo)記的P22探針與OsWRKY89結(jié)合后，在電泳中移動的速度減慢，會呈現(xiàn)一條滯后的條帶；突變的探針mP22不能與OsWRKY89蛋白結(jié)合。具體實(shí)驗(yàn)方法如下先將BlpET-OsWRKY89表達(dá)的蛋白進(jìn)行蛋白競爭實(shí)驗(yàn)，蛋白競爭實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)體系為總共20μl，包括800ng純化的BlpET-OsWRKY89表達(dá)的蛋白(或者不添加蛋白)、0.2pmol[α-32P]末端標(biāo)記的寡核苷酸探針(P22或mP22)、DNA結(jié)合緩沖液(甘油5％，EDTA 1mmol L-1，DTT 1mmol L-1，NaCl 50mmol L-1，poly(dI-dC)50ng mL-1，Tris·HCl 10mmol L-1，pH 7.5)，其中，添加標(biāo)記P22的體系配制五份，其中一份不添加蛋白，添加標(biāo)記mP22探針的體系配制一份，配制時，先加入探針，然后加入蛋白。在添加標(biāo)記P22而未添加蛋白的體系中不加未標(biāo)記的探針，其余四份添加標(biāo)記P22的體系分別進(jìn)行如下處理(1)不添加未標(biāo)記探針；(2)添加是標(biāo)記探針十倍摩爾比的未標(biāo)記P22；(3)添加是標(biāo)記探針200倍摩爾比的未標(biāo)記P22；(4)添加是標(biāo)記探針200倍摩爾比的未標(biāo)記mP22。在添加標(biāo)記mP22探針的體系中不添加任何未標(biāo)記的探針。上述體系混勻后，先在25℃下保溫1分鐘，然后在0.5×TBE緩沖液(45mmol L-1Tris，45mmol L-1硼酸，1mmol L-1EDTA)中進(jìn)行電泳，膠濃度6％。壓X片，放射自顯影。結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明重組OsWRKY89能與標(biāo)記的P22探針強(qiáng)烈結(jié)合(左起第二泳道)。加入10倍未標(biāo)記的P22由于未標(biāo)記P22與OsWRKY89的結(jié)合，顯降低了OsWRKY89與標(biāo)記的P22探針的結(jié)合活性(左起第三泳道)，加入200倍未標(biāo)記的P22幾乎完全阻止OsWRKY89與標(biāo)記的P22探針之間的相互作用(左起第四泳道)。與此相反，相同濃度的突變探針mP22不能有效地競爭OsWRKY89與標(biāo)記的P22探針之間的結(jié)合(左起第五泳道)。突變的探針mP22也不能與OsWRKY89發(fā)生相互作用(左起第六泳道)，從而證明OsWRKY89可與W盒元件特異結(jié)合。圖2中10×，200×分別表明加在反應(yīng)體系中的未標(biāo)記探針是標(biāo)記探針摩爾數(shù)的10倍，200倍；“+”和“-”分別表示在反應(yīng)體系中加入和沒加入反應(yīng)物；“S”表示蛋白和探針特異結(jié)合后的條帶，“F”表示沒有結(jié)合蛋白的探針條帶。
實(shí)施例4、OsWRKY89的同源相互作用
OsWRKY89的同源相互作用研究采用酵母雙雜交的方法。將OsWRKY89的完整編碼區(qū)連到GAL4AD載體上構(gòu)成被誘載體；OsWRKY89的不同缺失體的編碼序列連到GAL4 BD載體上構(gòu)成誘捕載體，分別共轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109。具體方法如下以表1中w89ΔCR和w89SmaI，w89ΔCR和ΔCN1F，w89ΔCR和ΔCN2F組成三對引物，以pET-OsWRKY89為模板分別擴(kuò)增的得到OsWRKY89的羧基端缺失體ΔC(自序列2的氨基端第1位至196位氨基酸殘基)的編碼區(qū)(自序列1的5′端第1-588核苷酸)、OsWRKY89的氨基端和羧基端缺失體ΔCN1(自序列2的氨基端第15位至196位氨基酸殘基)的編碼區(qū)N1C(自序列1的5′端第43-588核苷酸)，OsWRKY89的氨基端和羧基端缺失體ΔCN2(自序列2的氨基端第62位至196位氨基酸殘基)的編碼區(qū)N2C(自序列1的5′端第184-588核苷酸)。將擴(kuò)增產(chǎn)物分別用XhoI和SmaI雙酶切后插入GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)載體pGBKT7(購自Clontech公司)的XhoI和SmaI酶識別位點(diǎn)之間，酶切和測序驗(yàn)證，將鑒定正確的含有ΔC、N1C或N2C的重組載體分別命名為pBD-OsWRKYΔC、pBD-OsWRKYΔN1或pBD-OsWRKYΔN2。按同樣的方法以pET-OsWRKY89為模板，以表1中所述w89EI和w89Rxho為引物，擴(kuò)增OsWRKY89的完整編碼區(qū)(自序列1的5′端第1-792位核苷酸)，然后用EcoRI和XhoI雙酶切、連接到GAL4激活結(jié)構(gòu)域(activating domain，AD)載體pGADT7(購自Clontech公司)的EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)之間，經(jīng)鑒定正確的重組載體命名為pAD-OsWRKY89。將上述構(gòu)建的pBD-OsWRKYΔC、pBD-OsWRKYΔN1或pBD-OsWRKYΔN2分別與pAD-OsWRKY89共轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，分別得到含有pBD-OsWRKYΔC和pAD-OsWRKY89、pBD-OsWRKYΔN1和pAD-OsWRKY89或pBD-OsWRKYΔN2和pAD-OsWRKY89的酵母菌株。另外，將pBD-OsWRKYΔC與pGADT7共轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109得到含有pBD-OsWRKYΔC和pGADT7的酵母菌株，將pGBKT7-p53(購自Clontech公司)和pGADT7-T(購自Clontech公司)共轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109得到含有pGBKT7-p53和pGADT7-T的酵母菌株，用pGBKT7(購自Clontech公司)轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109得到含有pGBKT7的酵母菌株，將這些菌株分別在YPDA培養(yǎng)基和SD-Leu-Trp-Ade-His培養(yǎng)基(SD培養(yǎng)基加0.06g L-1的Leu-Trp-Ade-His(購自Clontech公司))上30℃培養(yǎng)3天，觀察結(jié)果。結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明3個截?cái)嗟摹Я涟彼崂溁虿粠Я涟彼崂湹腛sWRKY89蛋白與GAL4 BD區(qū)融合的酵母載體作為誘捕物，以O(shè)sWRKY89全長蛋白與GAL4 AD區(qū)融合的酵母載體作為被誘捕物(圖3中A，B)，分別共轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109。所有帶有誘捕質(zhì)粒和被誘捕質(zhì)粒的酵母細(xì)胞都能正常生長在YPDA培養(yǎng)基上(圖3中C，a)。攜帶pGBKT7和pAD-OsWRKY的酵母，以及攜帶pBD-OsWRKYΔC和pGADT7的酵母不能在SD-Leu-Trp-Ade-His選擇培養(yǎng)基上生長(圖3中C，c)。另一方面，攜帶pBD-OsWRKYΔC和pAD-OsWRKY的酵母細(xì)胞能較好地生長在選擇培養(yǎng)基上，說明OsWRKY89間存在蛋白相互作用。盡管它的α-半乳糖苷酶活性比帶有pGBKT7-p53和pGAKT7-T陽性對照低一些。去掉N端的14位aa，沒有明顯降低OsWRKY89間的相互作用。但是，當(dāng)進(jìn)一步缺失到第61位aa，轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞則失去在選擇培養(yǎng)基上生長的能力。而缺失的這個區(qū)域包括整個亮氨酸拉鏈樣結(jié)構(gòu)，這暗示著亮氨酸拉鏈樣結(jié)構(gòu)在OsWRKY89間的同源相互作用中起重要作用。
其中，圖3中A為OsWRKY89的缺失體連到GAL4BD酵母載體上，構(gòu)成誘捕載體；OsWRKY89全長連到GAL4AD酵母載體上，構(gòu)成pAD-OsWRKY載體(被誘載體)。圖3中B為3個截?cái)嗟摹Я涟彼崂溁虿粠Я涟彼崂湹腛sWRKY89的不同缺失體。數(shù)字表示相對于序列表中序列2的第一位甲硫氨酸的氨基酸的位置，黑色實(shí)心框表示W(wǎng)RKY域。圖3中C為使用酵母雙雜交體系檢驗(yàn)OsWRKY89中亮氨酸拉鏈樣結(jié)構(gòu)是否參與蛋白間的相互作用。圖3中C中，a為所有帶有誘捕質(zhì)粒和被誘捕質(zhì)粒的酵母在YPDA培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)3天。b為帶有不同載體的酵母在培養(yǎng)基上的位置。b中1.pBD-OsWRKYΔC和pAD-OsWRKY，2.pBD-OsWRKYΔCN2和pAD-OsWRKY，3.pBD-OsWRKYΔC和pGADT7，4.pGBKT7-p53和pGADT7-T，5.pGBKT7，6.pBD-OsWRKYΔCN1和pAD-OsWRKY。c為所有帶有誘捕質(zhì)粒和被誘捕質(zhì)粒的酵母在SD-Leu-Trp-Ade-His選擇培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)3天。
實(shí)施例5、OsWRKY89的亞細(xì)胞定位構(gòu)建了p35S-WRKY89-GFP載體，運(yùn)用了粒子轟擊法將它瞬時表達(dá)在洋蔥表皮細(xì)胞中，同時用pCam35S-GFP載體作為對照。
pBluescript-SK-GFP(將GFP基因(自GENBANK號為AY596277第67-781位核苷酸)插入到pBluescript SK(購于clontech公司)的多克隆位點(diǎn)HindIII和EcoRI之間得到的重組載體)、pCam35S分別用Pst I和Sal I雙酶切，將得到的GFP片段和pCam35S大片段連接，用PCR和酶切鑒定含有CaMV 35S啟動子和GFP基因的載體命名為pCam35S-GFP。
用表1所示引物W89F/W89Rxho為引物，以pUCmT-OsWRKY89為模板擴(kuò)增OsWRKY89的完整編碼序列，用BamH I和Xho I雙酶切后插入到相同酶切的pCam35S-GFP上的GFP 3’端，將測序驗(yàn)證正確的重組載體命名為p35S-WRKY89-GFP。
其中，pCam35S按照如下方法構(gòu)建用引物5’-ACGAATTCGGTC CCCAGATTAGCC-3’和5’-CCGAGCTCGTCCCCCGTGTTC-3’從pCAMBIA1301載體上擴(kuò)增一個35S啟動子，EcoR I和Sac I分別酶切pCAMBIA1301和擴(kuò)增片段，回收擴(kuò)增片段酶切產(chǎn)物插入到pCAMBIA1301載體EcoR I和Sac I酶切位點(diǎn)之間得到重組載體。將該重組載體用Pst I和HindIII酶切，回收大片段。用引物5’-AACCTGCAGTA ACTAGCATAAC-3’和引物5’-TTAAGCTTGCGCGCAAAAAACCC-3’從pGBKT7載體上擴(kuò)增T7 terminator，用Pst I和HindIII酶切，回收。將兩個回收片段連接，得到載體pCam35S。
p35S-WRKY89-GFP用于洋蔥(Allium cepa)表皮細(xì)胞的基因槍轉(zhuǎn)化，以pCam35S-GFP作對照。具體步驟如下所述1)質(zhì)粒的準(zhǔn)備用試劑盒提取純化p35S-WRKY89-GFP或pCam35S-GFP(對照)質(zhì)粒，定量后取2.5μg備用。
2)洋蔥的準(zhǔn)備撕下白色洋蔥內(nèi)表皮(1cm×1cm)，內(nèi)側(cè)置上，置于含氨芐青霉素(Amp，100μg mL-1)改進(jìn)的MS培養(yǎng)基(1×MS鹽，1×Gamborg’s B5維生素，30g L-1蔗糖，2％瓊脂，pH 5.7)備用。
3)金粉懸浮液制備稱取60mg金粉(直徑1.0μm)于1.5mL離心管；加1000μL無水乙醇，振蕩懸浮1-2分；10,000rpm離心，10秒；棄上清，重復(fù)一次；用1000μL無菌ddH2O懸浮，振蕩1-2分；10,000rpm離心，10秒；棄上清，重復(fù)一次；用1000μL無菌ddH2O懸浮，振蕩1-2分，現(xiàn)用或-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 4)金粉與DNA的包埋取均勻的金粉懸浮液50μL，加入質(zhì)粒2.5μg，并混勻；加20μL 0.1mol L-1亞精胺，混勻；輕輕地一滴一滴地加入50μL 2.5mol L-1CaCl2，并不時輕輕搖晃；震蕩器上溫和震蕩3-5分后，室溫放置10分；10,000rpm離心，10秒，棄上清，無水乙醇漂洗2次；加60μL無水乙醇懸浮，混勻。
5)轟擊受體材料將壓力膜和轟擊膜在70％的酒精中浸泡1-2小時后取出，于超凈工作臺中晾干；金屬擋板用70％酒精浸泡后，于酒精燈上滅菌；取10μL制備好的金粉-DNA復(fù)合體，均勻涂布于轟擊膜的中間位置，涼干，不要涂布于整個膜上，大小應(yīng)與載體固定圈上的孔徑范圍一致；安裝到發(fā)射裝置上；將可裂膜安裝到氣體加速管的下端；靶材料集中到培養(yǎng)皿的中部，放入真空室內(nèi)，取下培養(yǎng)皿蓋；抽真空指針到26；放氦氣于氣體加速管，直到管中壓力達(dá)到可裂圓片所能承受的壓力時，可裂膜破開；氣體沖到轟擊膜上，載體向下運(yùn)動，被金屬擋板擋住，而下面的金屬顆粒卻透過金屬擋板的網(wǎng)孔，射向靶細(xì)胞；可裂膜壓力為1,000p.s.i.。平皿用Parafilm封好，22℃暗培養(yǎng)18小時后，用激光共聚焦掃描顯微鏡(Bio-Rad MRC1024)40倍鏡下觀察、并采集圖象。激光光源為氬-氪激光(Argonm-Krypton)，激發(fā)波長設(shè)定為488nm，另外還有一通道用于可見光下的透射顯微觀察。圖象疊加及其它處理用Confocal Assistant和Adobe Photoshop 6.0軟件進(jìn)行。
結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明OsWRKY89定位于細(xì)胞核內(nèi)。其中，圖4中的照片為在激光共聚焦顯微鏡下，放大40×10倍拍照。圖4中A，B和C為pCam35S-GFP載體瞬時表達(dá)照片，D，E，F(xiàn)為pCam35S-OsWRKY89-GFP載體瞬時表達(dá)照片。圖4中A和D為藍(lán)色光激發(fā)下的綠色熒光；圖5中C和F為可見光下的洋蔥細(xì)胞；圖4中B為A和C的疊加，圖4中E為D和F的疊加。
實(shí)施例6、OsWRKY89轉(zhuǎn)錄激活的分析和激活域的確定用89SmaF和w89Rxho引物以pET-OsWRKY89為模板擴(kuò)增得到OsWRKY89的完整編碼區(qū)，用Sma I和Xho I雙酶切，插入到含有酵母GAL4 DNA結(jié)合域(binding domain，BD)載體pGBKT7的Sma I和Xho I酶識別位點(diǎn)之間，得到含有OsWRKY89的完整編碼區(qū)的重組載體pBD-WRKY89。
以同樣的方法構(gòu)建OsWRKY89缺失體ΔC1(自序列2的氨基端第1位至196位氨基酸殘基)、ΔC2(自序列2的氨基端第1位至138位氨基酸殘基)、ΔC3(自序列2的氨基端第1位至95位氨基酸殘基)、N1(自序列2的氨基端第19位至263位氨基酸殘基)、ΔN2(自序列2的氨基端第62位至263位氨基酸殘基)、C1(自序列2的氨基端第197位至263位氨基酸殘基)編碼基因的載體各缺失體編碼區(qū)的擴(kuò)增引物對如下ΔC189SmaF/ΔC1R；ΔC389SmaF/ΔC3R；N1YN1F/w89Rxho；ΔN2YN2F/w89Rxho；C1YN3F/w89Rxho。以pUCmT-OsWRKY89為模板進(jìn)行擴(kuò)增。
上述擴(kuò)增得到的cDNA片段用相應(yīng)的引物攜帶的酶酶切，分別插入到pGBDKT7(購自Clontech公司)的C端相同酶識別位點(diǎn)之間，構(gòu)建各缺失突變體載體，測序驗(yàn)證。將含有ΔC1的重組載體命名為pBD-ΔC1；將含有ΔC2的重組載體命名為pBD-ΔC2；將含有ΔC3的重組載體命名為pBD-ΔC3；將含有C1的重組載體命名為pBD-C1；將含有N1的重組載體命名為pBD-N1；將含有ΔN2的重組載體命名為pBD-ΔN2；。
缺失體ΔC2是利用OsWRKY89中的Sal I位點(diǎn)，將pBD-WRKY89用Sma I和SalI酶切，回收小片段(ΔC2)得到，然后將ΔC2與pBD-WRKY89用Sma I和Xho I酶切的載體片端連接，酶切鑒定，將經(jīng)鑒定表明含有ΔC2與GAL4DNA結(jié)合域的載體命名為pBD-ΔC2。
將上述構(gòu)建的載體分別轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，然后分別在SD培養(yǎng)基(6.7g L-1yeast nitrogen base without aa，2g Agar，PH 5.8)和SD-Trp-Ade-His培養(yǎng)基(SD培養(yǎng)基加0.06g L-1的Trp-Ade-His(購自Clontech公司))上30℃培養(yǎng)3天。然后進(jìn)行α-半乳糖苷酶活性測定，α-半乳糖苷酶活性用試劑盒(購自Clontech公司)測定，按供應(yīng)商說明書進(jìn)行，底物為PNP-α-Gal(p-nitrophenylα-D-galactopyranoside)。以pGBDKT7空載體轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109得到的轉(zhuǎn)化子(pBD)為陰性對照和pGBDKT7-53(購自Clontech公司)轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109得到的酵母轉(zhuǎn)化子(pBD-53)為陽性對照(培養(yǎng)基SD-Leu)。
α-半乳糖苷酶活性測定原理 結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明攜帶pBD-WRKY89的酵母在SD-Trp-Ade-His培養(yǎng)基上生長良好，說明OsWRKY89具有轉(zhuǎn)錄激活的能力。缺失C端74aa(190-263aa)的轉(zhuǎn)化子(pBD-ΔC1)不能在SD-Trp-Ade-His培養(yǎng)基生長；而該段與Gal4-BD融合的轉(zhuǎn)化子(pBD-C1)卻能在選擇培養(yǎng)基上生長，表明C端74aa對OsWRKY89的轉(zhuǎn)錄激活活性來說，不僅是足夠的、而且是必需的。另一方面，去除N端19位aa(ΔN1)或61位aa(ΔN2)不影響各自的轉(zhuǎn)化子在選擇培養(yǎng)基上的生長(圖5中B)。但后者的a-半乳糖酶活性與OsWRKY89全長比降低了46.8％(圖5中C)，說明第20位到第61位aa這一段對OsWRKY89的轉(zhuǎn)錄激活活性有促進(jìn)作用。這種促進(jìn)作用可能是由于該區(qū)域的亮氨酸拉鏈樣結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的蛋白互作所致。
圖5中A為OsWRKY89全長和不同的缺失體ΔC1(aa 1-196)，ΔC2(aa 1-138)，ΔC3(aa 1-95)，N1(aa 19-263)，ΔN2(aa 62-263)，C1(aa 197-263)的編碼區(qū)插入到酵母GAL4 DNA結(jié)合域載體pGBKT7上組成重組載體示意圖；圖5中B為pBD-ΔC1、pBD-ΔC3、pBD-N1、pBD-ΔN2、pBD-C3、pBD-ΔC2轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109得到的轉(zhuǎn)化子，在SD-Trp(左)或SD-Leu-Trp-Ade-His(右)選擇培養(yǎng)上30℃培養(yǎng)3天后的結(jié)果；其中位置1為pBD-OsWRKY89的酵母轉(zhuǎn)化子，位置2為pBD-ΔC1的酵母轉(zhuǎn)化子，位置3為pBD-ΔC2的酵母轉(zhuǎn)化子，位置4為pBD-ΔN2的酵母轉(zhuǎn)化子，位置5為pBD-ΔC3的酵母轉(zhuǎn)化子，位置6為pGBDKT7的酵母轉(zhuǎn)化子。圖5中C為β-半乳糖苷酶活性測定結(jié)果。分別以pGBKT7的酵母轉(zhuǎn)化子(pBD)和pGBDKT7-53(Gal BD和AD融合)的酵母轉(zhuǎn)化子(pBD-53)為陽性對照(培養(yǎng)基SD-Leu)作對照，取三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中得出的值的平均值。
實(shí)施例7、OsWRKY89的逆境誘導(dǎo)表達(dá)1、水稻培養(yǎng)與逆境處理水稻品種秀水11種子在37℃下浸泡1-2天，露白后催芽1天，然后播種在營養(yǎng)土中，在溫室中培養(yǎng)。28℃(晝)/22℃(夜)，自然光周期。25天苗用于各種處理，于不同時間取樣，取葉片提取RNA。
將水稻品種秀水11植株接種稻瘟病菌菌株p131。具體方法為將稻瘟菌菌株p131培養(yǎng)、產(chǎn)孢，將產(chǎn)生的孢子配成以105/L的濃度，噴接到生長至三葉期的水稻品種秀水11植株上，在黑暗、保濕的條件下培養(yǎng)分別于0、1、6、12、24h后取葉片提取總RNA。
激素處理生長21天的水稻品種秀水11植株分別進(jìn)行如下處理用100μmolL-1茉莉酸甲酯(MeJA)、100μmol L-1脫落酸(ABA)、5mmol L-1水楊酸(SA)、1mmol L-1乙烯利(ethephon)、100μmol L-1赤霉素(GA3)噴施，分別于0、1、6、12、24h取葉片提取總RNA。其中MeJA和GA3先溶于少量甲醇，再用ddH2O溶，甲醇終濃度為0.1％(體積百分含量)。上述激素處理以ddH2O或0.1％甲醇(MeOH)噴施為對照。
鹽處理生長21天的水稻品種秀水11植株移至含有200mMol L-1NaCl的營養(yǎng)液中培養(yǎng)，分別于0、1、6、12、24h后取葉片提取總RNA。
冷(cold)、熱(heat)處理生長21天的水稻品種秀水11植株植株置培養(yǎng)箱，維持4℃(冷)或42℃(熱)，黑暗培養(yǎng)，分別于0、1、6、12、24h后取葉片提取總RNA。
機(jī)械傷害(Wound)處理生長21天的水稻品種秀水11植株用止血鉗壓傷葉片，分別于0、1、6、12、24h后取葉片提取總RNA。
紫外(UV)處理生長21天的水稻品種秀水11植株在用于殺菌的紫外燈(20w/m2)下照射15分，作為全波段紫外處理。
然后進(jìn)行紫外A或B(UV-A，UV-B)處理分別用兩盞UV-A或UV-B燈(天津英澤爾科技公司)懸于生長21天的水稻品種秀水11植株上方約0.5m照射30min，劑量分別為2.0、8.0w/m2，紫外輻射強(qiáng)度用UV光輻射儀(北京師范大學(xué)光學(xué)儀器廠)測定。照射后，持續(xù)黑暗。UV-B處理時，燈管上覆蓋聚乙烯濾膜以去除280nm以下的輻射。分別于0、1、6、12、24h后取葉片提取總RNA。
2、RNA提取與Northern分析取上述逆境誘導(dǎo)的水稻品種秀水11植株葉片樣品，RNA提取按Chomczyski和Sacchi(1987)的方法。總RNA(10μg)在1.2％甲醛變性瓊脂糖膠中電泳分級，然后轉(zhuǎn)移至Hybond-N+尼龍膜上，與[α-32P]-標(biāo)記的OsWRKY89特異性探針(自序列1的477-792位核苷酸的單鏈核苷酸序列)在65℃下雜交。65℃下，用2×SSC加0.1％SDS洗5分，在同樣溫度下用1×SSC加0.1％SDS再洗5分。膜壓磷屏(AmershamPharmacia，UK)。
結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明，OsWRKY89的表達(dá)受到MeJA和UV-B誘導(dǎo)，同時傷害對OsWRKY89也有誘導(dǎo)，說明OsWRKY89可能參與到MeJA和UV-B的信號途徑中，也可能與傷害有關(guān)。
圖6中A為100μmol L-1脫落酸(ABA)、100μmol L-1茉莉酸甲酯(MeJA)、1mmol L-1乙烯利(ethephon)、100μmol L-1赤霉素(GA3)、5mmol L-1水楊酸(SA)和200mmol L-1NaCl處理后OsWRKY89的表達(dá)。圖6中B為稻瘟菌菌株p131接菌后OsWRKY89的表達(dá)。圖6中C為UV-A、UV-B(劑量分別為2.0、8.0w/m2)、UV(20w/m2)、機(jī)械損傷(用止血鉗壓傷葉片)，冷(4℃)，熱(42℃)處理后OsWRKY89的表達(dá)。
實(shí)施例8、OsWRKY89轉(zhuǎn)基因水稻的獲得以及OsWRKY89超表達(dá)植株的表型分析OsWRKY89的超表達(dá)載體構(gòu)建用w89F和w89RXho從pUCmT-OsWRKY89擴(kuò)增OsWRKY89的完整編碼序列，用BamH I和Xho I雙酶切，插入到pUCmT的相同酶切位點(diǎn)間，將經(jīng)鑒定正確的載體命名為pUCmT-F-WRKY89；將pUCmT-F-WRKY89用Pst I和Xho I雙酶切后，得到800bp的OsWRKY89片段，將其插入pUC18的Pst I和XhoI酶識別位點(diǎn)之間，經(jīng)鑒定正確的質(zhì)粒命名為pUC18-F-WRKY89；將pUC18-F-WRKY89用BamH I和Sac I雙酶切，得到800bp的OsWRKY89片段，將其插入到pCoU(用引物5’-TAGAATTCTGTTTCAAACTACCTGGTGG-3’和5’-GTGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAG-3’從玉米基因組中擴(kuò)增Ubiquitin啟動子，用EcoRI和BamHI分別酶切擴(kuò)增片段和pCam35S，回收擴(kuò)增片段和pCam35S酶切的大片段，連接的產(chǎn)物叫做pCoU)的BamHI和SacI酶識別位點(diǎn)之間，構(gòu)建OsWRKY89的超表達(dá)載體，將其命名為pCoU-WRKY89。pCoU-WRKY89為基因的超表達(dá)載體，受玉米Ubi基因啟動子驅(qū)動，在E.coli中為卡那霉素抗性，在農(nóng)桿菌EH105中為潮霉素抗性，OsWRKY89的超表達(dá)載體pCoU-WRKY89示意圖如圖7中A所示。
OsWRKY89的RNAi載體構(gòu)建用引物F5’-CGTTGACTACTATGAC-3’和R5’-CATCCCCATATGCATAT-3’，以pUCmT-OsWRKY89為模板，擴(kuò)增得到315bp片段(序列表中序列1的5′端第477-792核苷酸片段)，將其連接到pUCmT載體上得到的重組載體pUCmT-89m，用Pst I和Xho I雙酶切pUCmT-89m，回收得到320bp的片段，將pUC-CatIN(過氧化氫酶(catalase，Cat)基因的內(nèi)含子(具有GENBANK號為AY436346的5′端第31-220核苷酸序列)插入到pUCmT載體，得到pUC-CatIN)用Pst I和Sal I雙酶切，回收2900bp的片段。將回收的兩個片段連接，將經(jīng)鑒定表明正確的重組載體命名為pUC-IN-89mR；將pUC-IN-89mR用EcoR I和Xho I雙酶切后，回收510bp的片段，插入到pUCmT-89m的EcoR I和Xho I酶識別位點(diǎn)之間，將經(jīng)鑒定表明正確的重組載體命名為pUC-89mF-IN-89mR；pCam35S用Pst I酶切，回收13337bp的片段，再將pUC-89mF-IN-89mR用Pst I酶切、回收900bp的89mF-IN-89mR片段，將兩個片段連接，用Xba I酶切鑒定，選擇按pCam35S-89mF-IN-89mR正向插入的重組載體，即OsWRKY89的RNAi載體，將其命名為pCam35S-ds89。pCam35S-ds89載體示意圖如圖7中B所示。
pCam35S-ds89和pCoU-WRKY89通過根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化入水稻(pCam35S-ds89轉(zhuǎn)化的是水稻品種中花17，pCoU-WRKY89轉(zhuǎn)化的水稻品種為秀水11)，具體方法為成熟水稻種子用70％的乙醇進(jìn)行表面消毒1分后，用20％(v/v)的次氯酸鈉消毒30分，在NBI培養(yǎng)基上培養(yǎng)(MS添加0.5g L-1谷氨酰胺，0.5g L-1脯氨酰胺，2.0mg L-12，4-D；PH 5.8)，大概14天后長出愈傷，將愈傷組織剝下來放到新的NBI培養(yǎng)基上培養(yǎng)，4天后即可侵染；將含有pCam35S-ds89或pCoU-WRKY89的農(nóng)桿菌液均勻涂在固體YEP平板上培養(yǎng)2-3天，用無菌藥匙從平板上刮菌于液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS+2g L-1肌醇+0.3g L-1CEH+100uM AS)中至細(xì)胞濃度為3×109cfu mL-1，將愈傷放入菌中侵染20分鐘，將愈傷倒在干凈濾紙上吸干表面的菌液，移到Nbco培養(yǎng)基上培養(yǎng)(NBI培養(yǎng)基加100uM AS)；培養(yǎng)2天后，將愈傷轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基NBs上培養(yǎng)(NBI培養(yǎng)基加500mg L-1頭孢霉素，30mg L-1潮霉素)；等到愈傷出綠點(diǎn)后(大概30天)移至分化培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基中添加2.0mg L-16-BAP、0.5mg L-1NAA、30g L-1山梨醇和30mg L-1Hyg)上培養(yǎng)。獲得的小苗種于溫室直到收種。共獲得14株轉(zhuǎn)pCam35S-ds89水稻和9株轉(zhuǎn)pCoU-WRKY89水稻(pCam35S-ds89轉(zhuǎn)化的是水稻品種中花17，pCoU-WRKY89轉(zhuǎn)化的水稻品種為秀水11)，即T0代轉(zhuǎn)基因植株。T0代轉(zhuǎn)基因植株自交所得的種子和由該種子長成的植株為T1代。T1代轉(zhuǎn)基因植株自交所得的種子和由該種子長成的植株為T2代。
測量轉(zhuǎn)pCoU-WRKY89水稻T2代植株14天苗齡時的株高(cm)、全展葉(第二葉)長(cm)、寬(最寬處)(cm)、種子根和不定根長(cm)。統(tǒng)計(jì)不定根數(shù)。按Debi等(Debi BR，Mushika J，Taketa S，Miyao A，Hirochika H，Ichii M.(2003).Isolation and characterization of a short lateral root mutant in rice(Oryzasativa L.).Plant Sci，165895-903)的方法統(tǒng)計(jì)側(cè)根數(shù)。側(cè)根數(shù)＝肉眼觀察到的、種子根長。每株系統(tǒng)計(jì)20株。整株用數(shù)碼相機(jī)拍照。結(jié)果如圖8所示，結(jié)果表明一些轉(zhuǎn)pCoU-WRKY89水稻植株矮小，葉長明顯變短，葉寬稍變窄，不定根少，種子根長與野生型無明顯差異，在發(fā)育上也與野生型同步(只觀察至4葉期)；另一些與野生型的表型一樣(圖8中A，C)。經(jīng)PCR和潮霉素檢驗(yàn)，矮小植株為轉(zhuǎn)基因陽性。
圖8中A為部分轉(zhuǎn)pCoU-WRKY89水稻T2代株系S9、S11、S1、S3、S13，SNT(分離株T1代株系種下去后代進(jìn)行遺傳學(xué)分離，一些植株恢復(fù)為野生型，我們叫分離株)和對照(野生植株)WT的表型，Bar＝8cm。圖8中B為轉(zhuǎn)pCoU-WRKY89水稻T2代株系S9、S11、S1、S3、S13，SNT(分離株)和對照(野生植株)WT在植株重(a)，種子根長(b)，側(cè)根長(c)，不定根數(shù)(d)，葉長(e)，葉重(f)和不定根長(g)的比較。圖8中C為對照WT、超表達(dá)(轉(zhuǎn)pCoU-WRKY89水稻)T2代株系S3和S13的表型，Bar＝2cm。
實(shí)施例9、OsWRKY89超表達(dá)植株和干涉植株抗UV-B分析轉(zhuǎn)pCam35S-ds89水稻和轉(zhuǎn)pCoU-WRKY89水稻T2代植株25天苗齡的轉(zhuǎn)基因植株連續(xù)暴露在UV-B(10w/m2)下2.5小時，UV-B燈離植株0.5米。暗修復(fù)24小時，然后持續(xù)光照恢復(fù)，光強(qiáng)30μmol m-2s-1。2天后用數(shù)碼相機(jī)拍照。
UV-B處理后暗適應(yīng)10分，用便攜式脈沖放大可調(diào)熒光儀(PAM-2000，HeinzWalz，Effeltrich，Germany)測定第2葉的葉綠素?zé)晒狻SII光化學(xué)最大量子產(chǎn)率(Fv/Fm)計(jì)算按(Genty B，Briantais JM，Baker NR.(1989).The relationshipbetween the quantum yield of photosynthetic electron transport and quenchingof chlorophyll fluorescence.Biochim Biophys Acta，99087-92)的方法。Fv/Fm＝(Fm-F0)/Fm，其中F0為葉綠素起始熒光，F(xiàn)m為葉綠素最大熒光，F(xiàn)v為葉綠素可變熒光。結(jié)果如圖9所示，結(jié)果表明pCoU-WRKY89水稻可以增強(qiáng)水稻對UV-B抗性，而轉(zhuǎn)pCam35S-ds89水稻對UV-B抗性減弱。說明WRKY89與水稻的UV-B抗性有關(guān)。
圖9中A為生長25天的轉(zhuǎn)pCoU-WRKY89水稻T2代和轉(zhuǎn)pCam35S-ds89水稻T2代幼苗用UV-B照射2.5小時，暗培養(yǎng)1天，野生型水稻(WT)、轉(zhuǎn)pCoU-WRKY89水稻T2代植株和轉(zhuǎn)pCam35S-ds89水稻T2代植株在UV-B照射后的比較，Bar＝5cm。圖10中B為在不同的時間點(diǎn)測對照水稻秀水11和中花17(購于種子公司)、轉(zhuǎn)pCoU-WRKY89水稻T2代和轉(zhuǎn)pCam35S-ds89水稻T2代植株的第三葉Fv/Fm值。圖10中C為轉(zhuǎn)pCoU-WRKY89水稻T2代植株和轉(zhuǎn)pCam35S-ds89水稻T2代植株的表達(dá)分析。圖9中A和圖9中B中的其中D14、D7為轉(zhuǎn)pCam35S-ds89水稻T2代的兩個植株；ZH、XS分別為對照中花17和秀水11；S1、S13為轉(zhuǎn)pCoU-WRKY89水稻T2代的兩個植株。圖9中C的XS、ZH分別為對照秀水11和中花17；S1、S3、S7、S8、S10、S11、S13為轉(zhuǎn)pCoU-WRKY89水稻T2代的不同植株；I1、I2、I3、I4、I5、I7、I8、I11、I14為轉(zhuǎn)pCam35S-ds89水稻T2代的不同植株。上圖為對照水稻秀水11和中花17(購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院杭州水稻研究所)、轉(zhuǎn)pCoU-WRKY89水稻T2代和轉(zhuǎn)pCam35S-ds89水稻T2代植株的表達(dá)變化；下圖為對照水稻秀水11和中花17、轉(zhuǎn)pCoU-WRKY89水稻T2代和轉(zhuǎn)pCam35S-ds89水稻T2代植株在UV-B照射15分鐘，暗培養(yǎng)3小時后的表達(dá)變化。
序列表<160>3<210>1<211>792<212>cDNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>1atgatagagc accaaaaggc tctcatggtg gagctgcgtg gcatggccat gccattactt60ccgagcgaca atgaacaagc caagcttgct cttcaactct tgggagatat attgagttgc120tcagataagg ctatctccat gctagaactt ggtggagaca ctaaaaagct gaccaatctt180gttggaggta agagaaaagg tgacaagcat agcatggaca accacaactt ggaggaggaa240gctaaagaaa gtgttagcaa gagaagaaag aatgcagaac acacaggttc aactgtggct300caagcacctc acaatgatgg acatcaatgg aggaagtatg gtcagaaatg gatctctaga360gcaaaacatt ccaggagcta ctataggtgt gccaatagta aagtgcaagg ctgtcctgct420acaaagacag tgcaacaaat ggattccagt ggaaatggaa catcaaagtt gttcaacgtt480gactactatg accaacacac atgcagggga gatggcatag ccgatccata tgttgtcgac540acagcccatc acagtatgga acctatcaat caaaacgaat gcaatagccc tacacttgaa600cacgaagccc atgaagttca agatgaaaga tttgaaaact tgtgtatggt acaaaatatg660ccagagtatt tgatagattt tgaattggag agagccttcg agtttattgt gaactcacca720ttgggttctg agcattggac gttcgatgat tcaataagat gtgagcacag tccaatatgc780atatggggat ga792<210>2<211>263<212>PRT<213>稻屬水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>2
Met Ile Glu His Gln Lys Ala Leu Met Val Glu Leu Arg Gly Met Ala1 5 10 15Met Pro Leu Leu Pro Ser Asp Asn Glu Gln Ala Lys Leu Ala Leu Gln20 25 30Leu Leu Gly Asp Ile Leu Ser Cys Ser Asp Lys Ala Ile Ser Met Leu35 40 45Glu Leu Gly Gly Asp Thr Lys Lys Leu Thr Asn Leu Val Gly Gly Lys50 55 60Arg Lys Gly Asp Lys His Ser Met Asp Asn His Asn Leu Glu Glu Glu65 70 75 80Ala Lys Glu Ser Val Ser Lys Arg Arg Lys Asn Ala Glu His Thr Gly85 90 95Ser Thr Val Ala Gln Ala Pro His Asn Asp Gly His Gln Trp Arg Lys100 105 110Tyr Gly Gln Lys Trp Ile Ser Arg Ala Lys His Ser Arg Ser Tyr Tyr115 120 125Arg Cys Ala Asn Ser Lys Val Gln Gly Cys Pro Ala Thr Lys Thr Val130 135 140Gln Gln Met Asp Ser Ser Gly Asn Gly Thr Ser Lys Leu Phe Asn Val145 150 155 160Asp Tyr Tyr Asp Gln His Thr Cys Arg Gly Asp Gly Ile Ala Asp Pro165 170 175Tyr Val Val Asp Thr Ala His His Ser Met Glu Pro Ile Asn Gln Asn180 185 190Glu Cys Asn Ser Pro Thr Leu Glu His Glu Ala His Glu Val Gln Asp195 200 205Glu Arg Phe Glu Asn Leu Cys Met Val Gln Asn Met Pro Glu Tyr Leu210 215 220Ile Asp Phe Glu Leu Glu Arg Ala Phe Glu Phe Ile Val Asn Ser Pro225 230 235 240Leu Gly Ser Glu His Trp Thr Phe Asp Asp Ser Ile Arg Cys Glu His
245 250 255Ser Pro Ile Cys Ile Trp Gly260<210>3<211>990<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>3atgatagagc accaaaaggc tctcatggtg gagctgcgtg gcatggtcat gccattactt60ccgagcgaca atgaacaagc caagcttgct cttcaactct tgggagatat attgagttgc120tcagataagg ctatctccat gctagaactt ggtggagaca ctaaaaagct gaccaatctt180gttggaggta agagaaaagg tgacaagcat agcatggaca accacaactt ggaggaggaa240gccaaagaaa gtgttagcaa gagaaggtat atgtatataa atacatgcca ctagaggaat300gtccactagc ttatcattca ttgctaacga aatttgattg atcctcttga ttatgataga360aagaatgcag aacacacagg ttcaactgtg gctcaagcac ctcacaatga tggacatcaa420tggaggaagt atggtcagaa atggatctct agagcaaaac attccaggta taaatgagca480tatgaactcc tgtttatttc cattcctcga agcatattgg ttttatctaa cagcaaaata540tatacatcta atgagctcat ttgcttaagc aggagctact ataggtgtgc caatagtaaa600gtgcaaggct gtcctgctac aaagacagtg caacaaatgg attccagtgg aaatggaaca660tcaaagttgt tcaacgttga ctactatggc caacacacat gcaggggaga tggcatagcc720gatccatatg ttgtcgacac agcccatcac agtatggaac ctatcaatca aaacgaatgc780aatagcccta cacttgaaca cgaagcccat gaagttcaag atgaaagatt tgaaaacttg840tgtatggtac aaaatatgcc agagtatttg atagattttg aattggagag agccttcgag900tttattgtga actcaccatt gggttctgag cattggacgt tcgatgattc aataagatgt960gagcacagtc caatatgcat atggggatga 990
權(quán)利要求
1.一種植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子功能的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因，其特征在于所述植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的編碼序列為自序列2的5′端第1位至792位脫氧核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的編碼基因，其特征在于所述植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的cDNA基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的DNA；3)與序列表中SEQ ID №1的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的編碼基因，其特征在于所述植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的基因組基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的DNA；3)與序列表中SEQ ID №3的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID №3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
6.含有權(quán)利要求2-5任一所述的基因的重組表達(dá)載體。
7.含有權(quán)利要求2-5任一所述的基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
8.含有權(quán)利要求2-5任一所述的基因的工程菌。
9.權(quán)利要求2-5任一所述的基因在培育抗逆性植物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。該植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子功能的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄受多種非生物脅迫和激素誘導(dǎo)。UV－B、茉莉酸甲酯、機(jī)械傷害、高鹽、冷(4℃)、熱(37℃)和乙烯利、脫落酸能誘導(dǎo)其表達(dá)；本發(fā)明的植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的T2代植株對UV－B抗性增強(qiáng)，而干涉轉(zhuǎn)基因植株卻使UV－B抗性減弱，表明該基因介導(dǎo)了植物對紫外的防衛(wèi)反應(yīng)。
文檔編號C12N15/29GK101050234SQ20071006456
公開日2007年10月10日 申請日期2007年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月20日
發(fā)明者郭澤建, 郝俊杰, 陳旭君, 王海華, 郝中娜 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)