專利名稱：一種嗜酸乳桿菌的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種嗜酸乳桿菌的制備方法，屬于微生物發酵工程技術領域。

背景技術：
微生態制劑是指將已知的有益微生物通過現代生物工程技術制備成應用于動物的生物制劑，它能有效補充畜禽體內的有益微生物，改善動物體內菌群平衡，提高機體抗病力和飼料吸收利用能力。由于微生態制劑無殘留、不產生抗性，且具有預防疾病和促進動物生長的作用，可有效克服長期使用抗生素造成的一些不良影響，被認為是飼用抗生素潛在的、天然的、對環境和健康無害的替代物。九十年代以來，微生態制劑在畜禽養殖方面的應用發展很快，1989年全球飼用微生態制劑總銷售額為7500萬美元，1993年為1.22億美元，2000年為1.86億美元，2007年估計可達3.5億美元。
微生態制劑按微生物種類可分為芽孢桿菌制劑、乳酸桿菌制劑及酵母制劑等。嗜酸乳桿菌是動物腸道內的重要益生菌，也是可以在腸道中成活和定殖的少數乳酸桿菌之一。嗜酸乳桿菌具有較強的耐酸和耐膽汁鹽能力，不用經特殊處理就能順利通過胃腸環境而有效定殖于動物腸道內形成優勢種群；而且其產生的乳酸和乳酸菌素可直接作用于病原細菌，這是其它微生物活菌制劑無法比擬的。但制備嗜酸乳桿菌比較困難，未見良好的生產方法。嗜酸乳桿菌的培養比較困難，營養要求高，生長條件苛刻。其發酵培養基一般要求以牛奶為基質，再添加一些葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等營養成分；或由高濃度的葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，再加上其他一些營養成分組成，然后在厭氧或微氧狀態下培養。這種方法不但難于規?；?，而且成本極高，產品無法在飼料中應用。因而嗜酸乳桿菌作為微生態制劑的研制開發，具有廣闊的發展前景。


發明內容
本發明的目的是要提供一種新的嗜酸乳桿菌制備方法，該方法可大大降低生產成本，制備的嗜酸乳桿菌產品可望在畜禽養殖業中得到規?；瘧?。
為實現上述目的采取的技術方案 采用液體深層發酵培養技術，通過二步發酵生產嗜酸乳桿菌。一步發酵接種粘紅酵母，通過發酵形成嗜酸乳桿菌培養的基本營養條件；二步發酵接種嗜酸乳桿菌，通過增殖培養形成嗜酸乳桿菌產品。
本發明的具體制備工藝如下 1.菌株鑒定 (1)粘紅酵母ZHRh028 細胞卵形到球形，2.3-5.0×4.0-7.8微米，單個或幾個細胞連結成串，多端出芽。在麥芽汁瓊脂斜面上菌苔呈現珊瑚紅到橙紅色，菌落表面光滑、有光澤、粘稠有時發硬，其橫切面扁平到有較寬的凸起，邊緣不規則到整齊，不形成菌絲，無假菌絲。不發酵任何糖，同化硝酸鉀，分解楊梅苷，不產生類淀粉?？赏咸烟恰Ⅺ溠刻?、半乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖、L-山梨糖、乙醇、D-果糖、松三糖、甘油等，不能同化乳糖、蜜二糖、D-甘露糖、鼠李糖、D-木糖、菊糖、棉子糖、肌醇、可溶性淀粉、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-山梨醇和赤癬醇。無有性生殖現象，生長溫度25-36℃，pH2.5-10.0范圍均能生長。
(2)嗜酸乳桿菌 桿菌，兩端圓，0.6-0.9×1.5-6微米，以單個、成雙或短鏈出現。不運動，無鞭毛，菌落粗糙。在顯微鏡下觀察，顯示纏繞或微毛絲狀物，從似暗影的菌堆的中心放射伸出。無特有的色素?？赏嘈尤受?、纖維二糖、七葉苷、果糖、葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、蜜二糖、棉子糖、海藻糖，不能同化阿拉伯糖、葡萄糖酸鹽、甘露醇、松三糖、鼠李糖、核糖、山梨醇、木糖。同型發酵，產生DL-乳酸。從精氨酸不產氨。15℃下不生長，45℃下生長，最適生長溫度35-38℃，生長初始pH值為5-7，最適pH5.5-6.0。
2.制備工藝 (1)生產菌種 本發明所用的微生物菌種為粘紅酵母ZHRh028(Rhodotorula，glutinis ZHRh028)，保藏于CGMCC，保藏號CGMCC NO.1745，保藏日期為2006年06月27日；嗜酸乳桿菌ZJLa055(Lactobacillus acidlophilus ZJLa055)，保藏于CGMCC，保藏號CGMCC NO.2008，保藏日期為2007年04月13日。
(2)培養基 ①種子斜面培養基 粘紅酵母葡萄糖2％、蛋白胨1.0％、酵母膏0.2％、瓊脂2.0％。
嗜酸乳桿菌蛋白胨1.0％、牛肉膏1.0％、酵母膏0.5％、葡萄糖2.0％、K2HPO4 0.2％、檸檬酸二銨0.2％、乙酸鈉0.5％、吐溫80 0.1％、MgSO4·7H2O 0.058％、MnSO4·4H2O 0.025％、瓊脂2.0％，pH6.0。
②發酵培養基 培養基中的營養源采用常用的碳源和氮源。其中碳源可為玉米粉、淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、飴糖等；氮源可為玉米漿、尿素、硫酸銨、蛋白胨、黃豆餅粉、酵母膏等。在此基礎上再添加一些其它營養成份，如食鹽、磷酸鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽等。
(3)培養方法 本發明所述的嗜酸乳桿菌制備方法，采用液體深層發酵技術，通過分步接種粘紅酵母和嗜酸乳桿菌進行二步發酵培養。首先接種粘紅酵母，培養溫度28-33℃，培養4-30小時后將溫度提高到40-60℃，保溫1-18小時，使粘紅酵母自溶形成嗜酸乳桿菌培養的基本營養條件；然后將溫度降至34-39℃，接種嗜酸乳桿菌，增殖培養15-100小時后放罐。
(4)產品后處理 培養液調制成一定的含菌量，干燥粉碎后分裝，即為產品。
具體工藝流程見說明書附圖。
本發明的顯著優點 嗜酸乳桿菌的培養比較困難，營養要求高和生長條件苛刻。其發酵培養基一般要求以牛奶為基質，再添加一些葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏等營養成分；或由高濃度的葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，再加上其他一些營養成分組成。原材料的高成本，決定現有制備嗜酸乳桿菌產品的成本很高。而本發明提供的嗜酸乳桿菌制備方法，通過發酵粘紅酵母來形成嗜酸乳桿菌培養的基本營養條件；而粘紅酵母營養要求很低，其發酵培養的培養基成分均為一些常見的、低價的農副產品。因此，采用本方法制備嗜酸乳桿菌，可大大降低生產成本。能極大地推動嗜酸乳桿菌作為微生態制劑的開發利用。



附圖為本發明制備工藝流程圖。

具體實施例方式 本發明有以下實施例 實施例一活菌總數大于50億/ml粉劑產品的制備 在70L發酵罐中，按葡萄糖3％、硫酸銨0.8％、蛋白胨0.1％、磷酸氫二鉀0.02％、碳酸鈣0.02％配成50L培養液。按常規方法滅菌后冷卻至28℃，接種1個茄子瓶的粘紅酵母生產菌種，培養溫度為28℃，轉速250轉/分；培養23小時后將溫度提高到50℃保溫15小時，使粘紅酵母自溶；然后將溫度降至36℃，接種1個茄子瓶嗜酸乳桿菌生產菌種，增殖培養75小時后放罐。噴霧干燥后加番薯淀粉調劑到總活菌數大于50億/ml，分裝即得產品。
實施例二總活菌數大于10億/克粉劑產品的制備 在70L發酵罐中，按紅糖2.0％、葡萄糖1％、西紅柿汁6％、玉米漿0.5％、尿素0.3％、磷酸氫二鉀0.02％、氯化鈉0.2％配成45L培養液。按常規方法滅菌后冷卻至30℃，接種2個茄子瓶的粘紅酵母生產菌種，培養溫度為30℃，轉速220轉/分；培養10小時后將溫度提高到60℃保溫10小時，使粘紅酵母自溶；然后將溫度降至38℃，接種2個茄子瓶嗜酸乳桿菌生產菌種，增殖培養30小時后放罐。加適量玉米芯粉吸附并調制到總活菌數大于10億/克，沸騰干燥后分裝即為產品。
權利要求
1、一種嗜酸乳桿菌的制備方法，采用液體深層發酵培養技術，其特征是通過二步發酵方法生產，一步發酵接種粘紅酵母Rhodotorula glutinis，通過發酵形成嗜酸乳桿菌培養的基本營養條件；二步發酵接種嗜酸乳桿菌Lactobacillus acidlophilus，通過增殖培養形成嗜酸乳桿菌產品。其制備工藝的特征如下
2、按權利要求1所述嗜酸乳桿菌的制備方法，其制備工藝的特征如下
(1)生產菌種
采用粘紅酵母Rhodotorula glutinis ZHRh028和嗜酸乳桿菌Lactobacillus acidlophilusZJLa055，菌種保藏于CGMCC，保藏號分別為CGMCC NO.1745和CGMCC NO.2008；
(2)發酵培養基
培養基中的營養源采用碳源和氮源，其中碳源為玉米粉、淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖或飴糖；氮源為玉米漿、尿素、硫酸銨、蛋白胨、黃豆餅粉或酵母膏，并添加食鹽、磷酸鹽、鉀鹽、鈣鹽或鎂鹽；
(3)培養方法
采用液體深層發酵技術，通過分步接種粘紅酵母和嗜酸乳桿菌進行二步發酵培養，首先接種粘紅酵母，培養溫度為28-33℃，培養4-30小時后將溫度提高到40-60℃，保溫1-18小時，使粘紅酵母自溶形成嗜酸乳桿菌培養的基本營養條件；然后將溫度降至34-39℃，接種嗜酸乳桿菌，增殖培養15-100小時后放罐；
(4)產品后處理
培養液調制后，干燥粉碎即為產品。
全文摘要
本發明涉及一種嗜酸乳桿菌的制備方法，采用液體深層發酵技術，通過分步接種粘紅酵母和嗜酸乳桿菌進行二步發酵培養生產。首先接種粘紅酵母，培養溫度為28-33℃，培養4-30小時后將溫度提高到40-60℃保溫1-18小時，使粘紅酵母自溶形成嗜酸乳桿菌培養的基本營養條件；然后將溫度降至34-39℃，接種嗜酸乳桿菌，增殖培養15-100小時后放罐，調制后形成嗜酸乳桿菌產品。本方法能顯著降低嗜酸乳桿菌的生產成本。
文檔編號C12R1/23GK101096648SQ200710069019
公開日2008年1月2日 申請日期2007年5月31日 優先權日2007年5月31日
發明者竺利紅, 施躍峰, 吳吉安, 梁建根, 桑金隆 申請人:浙江省農業科學院