專(zhuān)利名稱(chēng)：Hiv基因檢測(cè)芯片,其制備方法和應(yīng)用其檢測(cè)hiv核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)基因檢測(cè)芯片，其制備方法和應(yīng)用其檢測(cè)HIV核酸的方法。
背景技術(shù)：
獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)是由人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)引起的一種全身性疾病，在短短的20年間已給全球造成十分嚴(yán)重的危害，幾乎波及全球所有國(guó)家和地區(qū)。HIV的實(shí)驗(yàn)室診斷包括病原學(xué)診斷和免疫學(xué)檢測(cè)，目前最常用的檢測(cè)方法(包括初篩和確診)為抗體檢測(cè)法。該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但由于檢測(cè)的是人體內(nèi)產(chǎn)生的針對(duì)HIV的特異性抗體，因此，必須要等到HIV病毒在體內(nèi)繁殖一段時(shí)間，刺激機(jī)體產(chǎn)生一定滴度的抗體后，才能檢測(cè)出。而在體內(nèi)抗體產(chǎn)生之前的這段時(shí)期，盡管病人體內(nèi)已經(jīng)感染了HIV，但檢測(cè)結(jié)果仍然為陰性，這段時(shí)期稱(chēng)之為窗口期，一般在6-12周內(nèi)。因此，用抗體法確診HIV感染的也一般在感染后的6-12周以后。除抗體法以外，其他如HIV抗原檢測(cè)和病原學(xué)檢測(cè)中的病毒培養(yǎng)也都有14-21天和11天的窗口期。如果病人在窗口期獻(xiàn)血，用目前常用的抗體法篩檢，將檢測(cè)不出HIV病毒，該血樣視為合格，但輸給別人后，將會(huì)造成艾滋病病毒的傳播。因此，艾滋病病毒感染的早期診斷不僅對(duì)疾病的早期發(fā)現(xiàn)有重要意義，而且對(duì)控制其流行，提高用血安全性也具有極為重要的意義。
目前HIV的早期診斷趨勢(shì)是HIV的核酸檢測(cè)。通過(guò)檢測(cè)來(lái)自受試者的樣本中是否存在HIV核酸來(lái)判斷受試者體內(nèi)是否感染HIV。這種方法只要體內(nèi)存在HIV病毒就可以檢測(cè)，理論上不存在窗口期。目前，用于HIV核酸檢測(cè)的試劑和方法主要有羅氏(Roche)公司的Amplicor(Saag Set al.HIV viral loadmarkers in clinical practice.Nature Medicine 1996；2625-629.)、拜爾(Bayer)公司的bDNA、Organnon Teknika NucliSens等，這些方法的特點(diǎn)是用一條HIV保守基因片段作為參照探針，病人體內(nèi)的核酸片段經(jīng)擴(kuò)增后與之雜交(BayerbDNA方法只擴(kuò)增雜交信號(hào))，這樣如果為了提高檢測(cè)的靈敏度，就需要加大探針的上樣量，而大的上樣量則會(huì)增加檢測(cè)的非特異信號(hào)，降低檢測(cè)特異性。
由于HIV是RNA病毒，因此HIV核酸檢測(cè)中存在的另一個(gè)困難是檢測(cè)時(shí)需要將RNA先逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA再進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)步驟。欲檢測(cè)標(biāo)本中的RNA時(shí)，目前的檢測(cè)步驟是，先用逆轉(zhuǎn)錄引物將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用多條引物分幾次擴(kuò)增，標(biāo)記后再與靶DNA雜交。不僅操作煩瑣，還增加了成本和交叉污染的機(jī)會(huì)。因此，這種方法很難在基層臨床檢測(cè)中得到推廣和應(yīng)用。在該領(lǐng)域迫切需要能夠在一個(gè)試管中一次性完成逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和標(biāo)記的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供的實(shí)施例要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種HIV檢測(cè)基因芯片，旨在解決目前HIV核酸檢測(cè)中的靈敏度與特異性之間的制約關(guān)系。
本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種HIV基因檢測(cè)芯片，其中在固相載體上固定有HIV特異性基因片段和陽(yáng)性及陰性對(duì)照，該HIV特異性基因片段包括SEQ ID NO1-6的序列，陽(yáng)性對(duì)照為SEQ ID NO7，陰性對(duì)照為SEQ IDNO8。
本發(fā)明實(shí)施例的要解決的另一技術(shù)問(wèn)題在于提供一種上述HIV基因檢測(cè)芯片的制備方法，其步驟包括(1)在一個(gè)試管中加入含有隨機(jī)六核苷酸引物的反應(yīng)體系，該反應(yīng)體系還含有引物組SEQ ID NO.14+12、SEQ ID NO.20+10、SEQ ID NO.20+11、SEQID NO.21+13、SEQ ID NO.18+12、SEQ ID NO.15+12、SEQ ID NO.20+9、SEQID NO.16+9、SEQ ID NO.17+10、SEQ ID NO.19+11中的一種或幾種，對(duì)HIVRNA樣品一次完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR擴(kuò)增；(2)從以上得到的片段中挑取陽(yáng)性片段克隆，測(cè)序證實(shí)后保存；(3)將上述克隆的陽(yáng)性片段引物組合在不同病人血液中經(jīng)RT-PCR證實(shí)后，選出具有SEQ ID NO1-6的序列的引物組合探針，保存。
(4)將所述保存的探針擴(kuò)增產(chǎn)物純化后與經(jīng)擴(kuò)增、純化步驟的所述陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照分別放置到微型板中，然后將濃度調(diào)整為所述不同濃度梯度后點(diǎn)膜；(5)將點(diǎn)膜后濾膜進(jìn)行交聯(lián)固定，制成HIV基因檢測(cè)芯片。
本發(fā)明實(shí)施例的要解決的另一技術(shù)問(wèn)題在于提供一種應(yīng)用上述HIV基因檢測(cè)芯片檢測(cè)HIV核酸的方法，包括以下步驟(A)從樣本中分離RNA；(B)將得到的RNA轉(zhuǎn)移到一個(gè)試管中，加入含有SEQ ID NO9-21序列的反應(yīng)體系，一次完成逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和地高辛標(biāo)記；(C)將標(biāo)記好的探針與所述HIV基因檢測(cè)芯片雜交，根據(jù)雜交結(jié)果判斷樣本中是否存在HIV。
與目前所采用的檢測(cè)試劑和方法相比，本發(fā)明實(shí)施例提供的檢測(cè)芯片由于采用了序列表中包括SEQ ID NO1-6序列的特異性基因片段，SEQ IDNO7的陽(yáng)性對(duì)照，SEQ ID NO8的陰性對(duì)照，很好地解決了靈敏度與特異性之間的制約關(guān)系，提高了產(chǎn)品的質(zhì)量和實(shí)用性。而且，應(yīng)用本發(fā)明實(shí)施例提供的HIV基因檢測(cè)芯片也更好地解決了HIV核酸半定量方面的問(wèn)題，而HIV體內(nèi)核酸半定量的測(cè)定對(duì)病人預(yù)后、藥物療效的評(píng)估，具有重要意義。
另外，采用本發(fā)明提供的HIV核酸檢測(cè)方法時(shí)，由于可以一次加入含有序列表中SEQ ID NO9-21序列的反應(yīng)體系，就可以在試管中一次完成逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和地高辛標(biāo)記，操作簡(jiǎn)單，減少了成本和交叉污染的機(jī)會(huì)，有利于在基層臨床檢測(cè)中得到推廣和應(yīng)用。


圖1顯示本發(fā)明實(shí)施例提供的HIV基因檢測(cè)芯片的結(jié)構(gòu)圖；圖2顯示應(yīng)用圖1中芯片檢測(cè)經(jīng)過(guò)確認(rèn)的HIV陽(yáng)性樣本的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
本發(fā)明的HIV基因檢測(cè)芯片是在固相載體上固定有不同濃度梯度的HIV特異性基因片段以及陽(yáng)性和陰性對(duì)照。所述的固相載體可以是尼龍膜，也可以是其他合適的材料。所述的HIV特異性基因片段是HIV gag基因片段，包括具有SEQ ID NO1-6的序列的核酸片段。由于采用了多個(gè)片段組合，降低了由于HIV核酸變異帶來(lái)的檢出率下降的可能性，提高了檢測(cè)的靈敏性和特異性。雜交結(jié)果顯示，該芯片的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到＜50copy。
陽(yáng)性對(duì)照是具有SEQ ID NO7的序列的核酸片段。陰性對(duì)照是具有SEQID NO8的序列的核酸片段。陰性對(duì)照采用的是一段植物基因，與HIV片段同源性很低。陰性對(duì)照應(yīng)該與HIV基因片段無(wú)非特異性雜交反應(yīng)，如陰性對(duì)照出現(xiàn)雜交陽(yáng)性信號(hào)，說(shuō)明芯片受到HIV核酸片段的污染或RT-PCR反應(yīng)體系受到其它核酸片段的污染。陽(yáng)性對(duì)照采用小鼠GAPDH基因片段，與HIV基因片段同樣沒(méi)有非特異性雜交反應(yīng)，并且該片段的質(zhì)粒克隆擴(kuò)增效率很高，在RT-PCR地高辛標(biāo)記反應(yīng)體系中加入微量的該克隆質(zhì)粒即可產(chǎn)生高效的擴(kuò)增。如果芯片雜交后沒(méi)有該片段的雜交陽(yáng)性信號(hào)，說(shuō)明RT-PCR標(biāo)記反應(yīng)體系出現(xiàn)問(wèn)題，如少加了某種RT-PCR反應(yīng)成分或反應(yīng)體系有逆轉(zhuǎn)錄酶或TaqDNA聚合酶的抑制劑。通過(guò)設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，有效排除了假陽(yáng)性和假陰性反應(yīng)。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，HIV基因檢測(cè)芯片為膜芯片，基因點(diǎn)樣直徑為0.15-0.2mm的斑點(diǎn)，膜芯片的大小為4cm×3.5cm，六個(gè)HIV基因片段以六個(gè)濃度梯度點(diǎn)樣，點(diǎn)樣數(shù)為36個(gè)，另加陽(yáng)性對(duì)照樣6個(gè)，陰性對(duì)照樣6個(gè)。上述六個(gè)濃度梯度為，第1梯度濃度為0.5μg/μl，第2梯度濃度為0.1μg/μl，第3梯度濃度為0.05μg/μl，第4梯度濃度為0.01μg/μl，第5梯度濃度為0.005μg/μl，第6梯度濃度為0.001μg/μl。當(dāng)然，根據(jù)需要可以將上述不同濃度梯度個(gè)數(shù)及濃度值進(jìn)行調(diào)整。
本發(fā)明實(shí)施例提供的上述HIV基因檢測(cè)芯片的制備方法，其步驟包括
(1)在一個(gè)試管中加入含有隨機(jī)六核苷酸引物的反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系還含有引物組SEQ ID NO.14+12、SEQ ID NO.20+10、SEQ ID NO.20+11、SEQ ID NO.21+13、SEQ ID NO.18+12、SEQ ID NO.15+12、SEQ ID NO.20+9、SEQ ID NO.16+9、SEQ ID NO.17+10、SEQ ID NO.19+11中的一種或幾種，對(duì)HIV RNA樣品一次完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR擴(kuò)增；(2)從以上得到的片段中挑取陽(yáng)性片段克隆，測(cè)序證實(shí)后保存；(3)將上述克隆的陽(yáng)性片段引物組合在不同病人血液中經(jīng)RT-PCR證實(shí)后，選出特異性高，靈敏度高的引物組合探針，即具有SEQ ID NO1-6的序列的引物組合探針，保存。
(4)將所述保存的探針擴(kuò)增產(chǎn)物純化后與經(jīng)擴(kuò)增、純化步驟的所述陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照分別放置到微型板中，然后將濃度調(diào)整為所述不同濃度梯度后點(diǎn)膜；(5)將點(diǎn)膜后濾膜進(jìn)行交聯(lián)固定，制成HIV基因檢測(cè)芯片。
采用上述方法制備所述芯片，由于在一個(gè)試管中一次完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR擴(kuò)增，操作簡(jiǎn)單，成本低。
本發(fā)明應(yīng)用上述HIV基因檢測(cè)芯片檢測(cè)HIV核酸的方法，包括以下步驟(A)從樣本中分離RNA；(B)將得到的RNA轉(zhuǎn)移到一個(gè)試管中，加入含有SEQ ID NO9-21序列的反應(yīng)體系，一次完成逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和地高辛標(biāo)記；(C)將標(biāo)記好的探針與所述HIV基因檢測(cè)芯片雜交，根據(jù)雜交結(jié)果判斷樣本中是否存在HIV。
其中所述樣本可以是血液、血清、血漿、淋巴液、精液、尿液、唾液和腦脊液。從樣本中分離RNA的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
在本發(fā)明的HIV核酸檢測(cè)方法中，逆轉(zhuǎn)錄步驟中所使用的引物是具有SEQID NO9-13的序列的引物以及隨機(jī)六核苷酸引物。核酸擴(kuò)增采用MultiplexPCR方法，其中使用的引物是具有SEQ ID NO9-21的序列的引物。在實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，一次加入上述所有引物和其他反應(yīng)產(chǎn)物，反應(yīng)就可以在一個(gè)試管中一次完成。
在本發(fā)明的方法中，完成雜交后，可以通過(guò)顯色反應(yīng)判斷反應(yīng)結(jié)果。顯色步驟后，可以通過(guò)肉眼觀(guān)察芯片上的雜交斑點(diǎn)，來(lái)判斷反應(yīng)結(jié)果，或者通過(guò)掃描儀掃描，從而進(jìn)行定量測(cè)定。
實(shí)施例實(shí)施例1HIV基因檢測(cè)芯片的制備從HIV感染者體內(nèi)獲取HIV特異核酸片段，驗(yàn)證后克隆、保存，用作HIV基因檢測(cè)芯片的探針，此方法可細(xì)分為(1)在一個(gè)試管中加入含有隨機(jī)六核苷酸引物的反應(yīng)體系，該反應(yīng)體系還含有引物組SEQ ID NO.14+12、SEQ ID NO.20+10、SEQ ID NO.20+11、SEQID NO.21+13、SEQ ID NO.18+12、SEQ ID NO.15+12、SEQ ID NO.20+9、SEQID NO.16+9、SEQ ID NO.17+10、SEQ ID NO.19+11中的一種或幾種，對(duì)HIVRNA樣品一次完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR擴(kuò)增；其中，上述SEQ ID NO14-21序列是針對(duì)HIV特異片段的寡核苷酸正向引物；上述SEQ ID NO9-13序列是針對(duì)HIV特異片段的寡核苷酸反向引物；隨機(jī)六核苷酸引物是指能夠與上述樣品的HIV RNA接觸，引發(fā)DNA的合成的長(zhǎng)度為六個(gè)核苷酸的引物，隨機(jī)六核苷酸引物的加入可以大大增強(qiáng)RT-PCR的效果。
所采用的方法為在一個(gè)200微升的PCR管中，混合以下成分。

*引物組為SEQ ID NO.14+12，SEQ ID NO.20+10，SEQ ID NO.20+11，SEQID NO.21+13，SEQ ID NO.18+12，SEQ ID NO.15+12，SEQ ID NO.20+9，SEQ IDNO.16+9，SEQ ID NO.17+10，SEQ ID NO.19+11組合中的一種或幾種。
按以下方法進(jìn)行擴(kuò)增，典型的變性、退火和聚合條件如下


(2)從以上得到的片段中挑取陽(yáng)性片段克隆，測(cè)序證實(shí)后保存；所用方法為[1].感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取JM109受體菌單菌落(2～3mm)于有2YT培養(yǎng)基的200ml錐形瓶中。
37℃振蕩(250rp)培養(yǎng)2.5小時(shí)(活細(xì)胞數(shù)不超過(guò)108個(gè)/ml)超凈工作臺(tái)上，倒入經(jīng)消毒的50ml離心管中，蓋嚴(yán)。
在冰浴中放置10分鐘，使菌落冷卻至0℃。
4℃，4000rp離心10分鐘收集菌體。
棄上清夜，倒置在衛(wèi)生紙上1分鐘。
加10ml預(yù)冷的0.1mol/L CaCL2，懸浮菌體。
冰浴25分鐘。
離心(4℃ 4,000rpm 10分鐘)加入1.5ml預(yù)冷的0.1mol/L CaCL2小心懸浮。
4℃冰箱保存過(guò)夜。
.連接在微型離心管中制備下列連接反應(yīng)液，總量為10μl。
PMD 18-T Vector1μlControl Insert DNA 1μldH2O 3μlSolution I 5μl16℃反應(yīng)過(guò)夜。
.轉(zhuǎn)化用微量移液器吸取已培養(yǎng)的感受態(tài)細(xì)胞100μl，加入小PCR管中，用微量移液器尖端混合均勻。
冰浴30分鐘。
42℃靜置90秒。
冰浴2～3分鐘。
加入800μl 37℃預(yù)熱的2YT培養(yǎng)基中置于搖床37℃(200rpm)45分鐘。
各取100～200μl涂板，將培養(yǎng)皿置于室溫至液體被吸收。
倒置培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取陽(yáng)性克隆，測(cè)序證實(shí)后，-20℃保存。
(3)將上述克隆的陽(yáng)性片段引物組合在不同病人血液中經(jīng)RT-PCR證實(shí)后，選出特異性高，靈敏度高的引物組合探針，即具有SEQ ID NO1-6的序列的引物組合探針，保存。
(4)將所述保存的探針引物擴(kuò)增產(chǎn)物純化后與經(jīng)擴(kuò)增、純化步驟的所述陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照分別放置到微型板中，然后將濃度調(diào)整為6個(gè)濃度梯度后點(diǎn)膜；
具體步驟為[1].將保存的探針引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
所用方法為

PCR循環(huán)如下
將上述PCR產(chǎn)物純化1.取40μl PCR產(chǎn)物，加200μl體積的GENECLEAN Turbo鹽溶液(BIO 101，GENECLEAN TURBO FOR PCR KIT，Cat No1103-200)，混勻。
2.將上述溶液轉(zhuǎn)移至Turbo Cartridge，10,000rpm離心5秒。
3.加54ml無(wú)水乙醇到Wash Solution中，混勻后，取500μl到TurboCartridge。
4.離心5秒中，去下層洗液5.重復(fù)洗滌一次6.將空的Turbo Cartridge管離心4分鐘，10,000rpm。
7.將Turbo Cartridge管移到一新管中，去掉Turbo Cartridge的蓋子。
8.加30μl洗脫液室溫放置5分鐘。
9.離心30秒，10,000轉(zhuǎn)/分，收集回收液(含PCR產(chǎn)物)10.-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 點(diǎn)膜將經(jīng)擴(kuò)增、純化步驟的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照與上述純化后的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到384孔微型板中，將濃度調(diào)整為0.5μg/μl，加入20×SSC，終濃度為6×SSC，然后調(diào)整為6個(gè)濃度梯度，即第1梯度濃度為0.5μg/μl，第2梯度濃度為0.1μg/μl，第3梯度濃度為0.05μg/μl，第4梯度濃度為0.01μg/μl，第5梯度濃度為0.005μg/μl，第6梯度濃度為0.001μg/μl。最后用384.5a點(diǎn)膜儀(V&P Scientifics Corp.)點(diǎn)膜。
(5)將點(diǎn)膜后濾膜進(jìn)行交聯(lián)固定，制成HIV基因檢測(cè)芯片。
將點(diǎn)膜后的濾膜在80℃真空環(huán)境下，烘烤30分鐘，然后在紫外交聯(lián)儀內(nèi)65毫焦/cm2進(jìn)行交聯(lián)固定。
HIV基因檢測(cè)芯片為多斑點(diǎn)的膜芯片，點(diǎn)樣直徑為0.15-0.2mm的斑點(diǎn)，膜芯片的大小如下4cm長(zhǎng)×3.5cm寬，HIV基因點(diǎn)樣為36個(gè)，六個(gè)片段以上述六個(gè)濃度梯度點(diǎn)樣，陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)樣6個(gè)，陰性對(duì)照點(diǎn)樣6個(gè)。基因點(diǎn)樣為6個(gè)，其中5個(gè)檢測(cè)基因，1個(gè)內(nèi)參照基因。
實(shí)施例2HIV核酸檢測(cè)方法(A)從樣本中分離HIV RNA，方法為準(zhǔn)備用1ml SKVR(Solution I)結(jié)合溶液溶解Carrier RNA后，轉(zhuǎn)入SolutionI瓶。
將溶解了Carrier RNA的Solution I溶液分裝成小份，4℃冰箱可保存6個(gè)月。如有沉淀，用之前37℃加熱，同一試劑加熱勿超過(guò)5次。
加等體積的無(wú)水乙醇到SKVR洗滌液A中。
在SKVR洗滌液B中加無(wú)水乙醇至乙醇終濃度為35％。
操作取一1.5ml的離心管，加入300μl SKVR結(jié)合溶液后，再加入200μl血漿，用微量移液器輕輕抽吸4次后，室溫放置10分鐘。
取200μl DEPC處理的水放在一小離心管中，65℃水浴，預(yù)熱備用。
向管中加250μl無(wú)水乙醇，上下顛倒試管3分鐘。
將提純樹(shù)脂溶液(Solution II)搖勻至無(wú)肉眼可見(jiàn)的沉淀為止。加50微升提純樹(shù)脂溶液后，將全部液體上柱，12,000轉(zhuǎn)/分，離心1分鐘。
將柱子取出，移到一個(gè)2ml的新管中，小心打開(kāi)蓋子，加入600μlSKVR洗液A(Solution III)，12,000轉(zhuǎn)/分，離心1分鐘。
第二次將柱子取出，移到一個(gè)2ml的新管中，小心打開(kāi)蓋子，加入600μlSKVR洗液B(Solution IV)，12,000rpm，離心1分鐘。
第三次將柱子取出，移到一個(gè)2ml的管中，小心打開(kāi)蓋子，加入500μl75％的乙醇，12,000rpm，離心1分鐘。
最后將柱子轉(zhuǎn)移到一個(gè)1.5ml的收集管中，小心打開(kāi)蓋子，加50μl預(yù)熱的DEPC處理的水，65℃水浴5分鐘，然后12,000rpm，離心2分鐘保存離心后的液體(在1.5ml的收集管中)，備用。
(B)將得到的病毒RNA轉(zhuǎn)移到一個(gè)試管中一次完成逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和地高辛標(biāo)記，方法為


*混合引物為所有引物(SEQ ID NO.9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21)各取1μl充分混勻后的混合引物。
按以下方法進(jìn)行擴(kuò)增，典型的變性、退火和聚合條件如下

(C)將標(biāo)記好的探針與膜上的探針雜交，洗滌后肉眼觀(guān)察結(jié)果，掃描儀進(jìn)行病毒半定量檢測(cè)。具體方法為試劑配制a)經(jīng)變性并被打斷的鮭魚(yú)精DNA
b)把鮭魚(yú)精DNA(Sigma，III型，鈉鹽)溶解于水配制成10mg/ml濃度(必要時(shí)于室溫磁力攪拌2～4小時(shí)助溶)c)把溶液中NaCl的濃度調(diào)至0.1mol/L，并用酚和酚氯仿各抽提一次，回收水相。
d)使DNA溶液快速通過(guò)17號(hào)皮下注射針頭12次，以剪切DNA。
e)加入2倍體積用冰預(yù)冷的乙醇沉淀DNA。
f)離心回收DNA并重溶于水，配制成10mg/ml的濃度。
g)測(cè)定溶液的OD260值并計(jì)算出DNA濃度。
h)煮沸10分鐘，分裝成小份保存于-20℃。
i)臨用前置沸水浴中加熱5分鐘然后迅速在冰浴中驟冷。預(yù)雜交液中應(yīng)含有100μg/ml經(jīng)變性并被打斷的鮭精DNA。
Denhardt試劑Denhardt試劑(Denhardt，1996)通常配置成50×貯存液，過(guò)濾后保存于-20℃。可將該貯存液10倍稀釋于預(yù)雜交液(常為含有0.5％SDS和100μl/ml經(jīng)變性并被打斷的鮭精DNA的6×SSC或6×SSPE)中。50×Denhardt液中含5g聚蔗糖(Ficoll，400型，Pharmacia)、5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白(組分V；Sigma)，加水至終體積為500ml。
預(yù)雜交和雜交雜交液的配制雜交液6×SSC5×Denhardr試劑0.5％SDS
100μg/ml經(jīng)變性并斷裂成片段的鮭精DNA50％甲酰胺操作1、預(yù)雜交1)每一張雜交膜用雜交液2ml。
2)將雜交膜裝入雜交袋中，加入2ml雜交液。盡可能將袋內(nèi)空氣擠壓出來(lái)，加熱封口，將其浸入42℃的水浴中溫育1小時(shí)。
3)100℃加熱5分鐘使探針變性，迅速在冰水浴中驟冷。
4)將雜交袋剪開(kāi)一角，加入探針，盡可能將袋內(nèi)所有空氣擠壓出去，加熱封口。
5)將雜交袋浸入42℃的水浴，雜交過(guò)夜。
6)取出雜交膜并將其置入一個(gè)盛有2×SSC和0.1％SDS的托盤(pán)內(nèi)，于室溫洗滌4次，每次5分鐘。
7)將雜交膜轉(zhuǎn)移至一個(gè)盛有0.2×SSC，0.1％SDS的平底塑料盒中，洗滌2次，每次30分鐘。
8)將濾膜置于一疊紙巾上，以除去大部分液體。
2、顯色1)將HIV膜放入封閉液中封閉30分鐘2)加入2ml抗地高辛抗體稀釋液(稀釋度為1∶3000)3)用10m洗滌液洗滌2次，每次15分鐘4)加入2ml檢測(cè)緩沖液5分鐘5)加入1ml NBT/BCIP底物溶液，平鋪于膜上用塑料紙蓋好，避光(勿晃動(dòng))，反應(yīng)時(shí)間至陽(yáng)性參照有清晰的斑點(diǎn)出現(xiàn)為止。
6)用水沖洗終止反應(yīng)。
3、檢測(cè)結(jié)果申請(qǐng)人采用本發(fā)明的HIV核酸檢測(cè)方法檢測(cè)了經(jīng)過(guò)確認(rèn)的HIV患者標(biāo)本，具體情況如下。共檢測(cè)了20例HIV感染者和5例陰性血清，均與原先的結(jié)果相符。陽(yáng)性標(biāo)本來(lái)源于深圳市疾病預(yù)防控制中心艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室。所有陽(yáng)性標(biāo)本均經(jīng)該實(shí)驗(yàn)室用WB方法確認(rèn)。病人血清中的病毒載量在50copy/ml到50000copy/ml范圍內(nèi)(經(jīng)該室用Roche公司的HIV-1 MONITORTMTEST試劑盒測(cè)定)。陰性標(biāo)本來(lái)源于深圳市疾病預(yù)防控制中心艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)該室用硒標(biāo)法確認(rèn)為陰性。
圖1顯示本發(fā)明實(shí)施例提供的HIV基因檢測(cè)芯片的結(jié)構(gòu)圖。其中陰性對(duì)照為辣椒色素基因，與HIV基因無(wú)同源性，因此，在所有檢測(cè)中，均不應(yīng)出現(xiàn)雜交信號(hào)。HIV基因探針為保守的HIV基因，在與HIV感染者陽(yáng)性病人血清雜交后，出現(xiàn)雜交信號(hào)，而正常人的血清不應(yīng)出現(xiàn)雜交信號(hào)。陽(yáng)性對(duì)照為GAPDH基因，只要操作和檢測(cè)試劑無(wú)誤，應(yīng)出現(xiàn)雜交信號(hào)。圖中1-6為不同的上樣濃度。
圖2顯示應(yīng)用圖1中芯片檢測(cè)經(jīng)過(guò)確認(rèn)的HIV陽(yáng)性樣本的結(jié)果。由該結(jié)果可以看見(jiàn)，本發(fā)明的HIV基因檢測(cè)芯片和應(yīng)用其檢測(cè)HIV核酸的方法可以準(zhǔn)確地檢出樣本中的HIV核酸。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
序列表<110>深圳市疾病預(yù)防控制中心<120>HIV基因檢測(cè)芯片，其制備方法和應(yīng)用其檢測(cè)HIV核酸的方法<160>21<170>Patentln version 3.1<210>1<211>152<212>DNA<213>人類(lèi)免疫缺損病毒<400>1gctaactagg gaacccactg cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag60tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta actagagatc cctcagaccc ttttagtcag120tgtggaaaat ctctagcagt ggcgcccgaa ca152<210>2<211>130<212>DNA<213>人類(lèi)免疫缺損病毒<400>2taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga60ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtgg120cgcccgaaca130<210>3<211>114
<212>DNA<213>人類(lèi)免疫缺損病毒<400>3ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga60tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg aaca114<210>4<211>188<212>DNA<213>人類(lèi)免疫缺損病毒<400>4ataatccacc tatcccagta ggagaaattt ataaaagatg gataatcctg ggattaaata60aaatagtaag aatgtatagc cctaccagca ttctggacat aagacaagga ccaaaggaac120cctttagaga ctatgtagac cggttctata aaactctaag agccgagcaa gcttcacagg180aggtaaaa188<210>5<211>296<212>DNA<213>人類(lèi)免疫缺損病毒<400>5agtgggggga catcaagcag ccatgcaaat gttaaaagag accatcaatg aggaagctgc60agaatgggat agagtgcatc cagtgcatgc agggcctatt gcaccaggcc agatgagaga120accaagggga agtgacatag caggaactac tagtaccctt caggaacaaa taggatggat180
gacaaataat ccacctatcc cagtaggaga aatttataaa agatggataa tcctgggatt240aaataaaata gtaagaatgt atagccctac cagcattctg gacataagac aaggac296<210>6<211>676<212>DNA<213>人類(lèi)免疫缺損病毒<400>6agtgggggga catcaagcag ccatgcaaat gttaaaagag accatcaatg aggaagctgc60agaatgggat agagtgcatc cagtgcatgc agggcctatt gcaccaggcc agatgagaga120accaagggga agtgacatag caggaactac tagtaccctt caggaacaaa taggatggat180gacaaataat ccacctatcc cagtaggaga aatttataaa agatggataa tcctgggatt240aaataaaata gtaagaatgt atagccctac cagcattctg gacataagac aaggaccaaa300ggaacccttt agagactatg tagaccggtt ctataaaact ctaagagccg agcaagcttc360acaggaggta aaaaattgga tgacagaaac cttgttggtc caaaatgcga acccagattg420taagactatt ttaaaagcat tgggaccagc ggctacacta gaagaaatga tgacagcatg480tcagggagta ggaggacccg gccataaggc aagagttttg gctgaagcaa tgagccaagt540aacaaattca gctaccataa tgatgcagag aggcaatttt aggaaccaaa gaaagattgt600
taagtgtttc aattgtggca aagaagggca cacagccaga aattgcaggg cccctaggaa660aaagggctgt tggaaa676<210>7<211>240<212>DNA<213>小鼠(小鼠(mouse))<220>
<221>misc_feature<222>(112)..(112)<223>n＝a，t，g，or c<400>7tgatgacatc aagaaggtgg tgaagcaggc atctgagggc ccactgaagg gcatcttggg60ctacactgag gaccaggttg tctcctgcga cttcaacagc aactcccact cntccacctt120cgatgccggg gctggcattg ctctcaatga caactttgtc aagctcattt cctggtatga180caatgaatac ggctacagca acagggtggt ggacctcatg gcctacatgg cctccaagga240<210>8<211>176<212>DNA<213>辣椒<400>8ggtaggaaga taagcggtag cttgattgtt gatgcaagtg gctatgctag tgattttata60gagtatgaca agccaagaaa ccatggttat caagttgctc atgggatttt agcagaagtt120
gataatcatc catttgattt ggataaaatg atgcttatgg tattggaggg attctc176<210>9<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9ttttacctcc tgtgaagctt gctcggct28<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10gtccttgtct tatgtccaga atgc24<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>11tttccaacag ccctttttcc tagg24<210>12
<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>12tgttcgggcg ccactgctag aga23<210>13<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>13gctatgtcac ttccccttgg ttctctc27<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>14gctaactagg gaacccactg c21<210>15<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>15ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtg28<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>16tcagacagga tcagaagaac20<210>17<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>17cagaacatcc aggggcaaat ggtac25<210>18<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>18taagcctcaa taaagcttgc cttgag26
<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>19gtagaagaga aggctttcag c21<210>20<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>20cacagtgggg ggacatcaag cagc24<210>21<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>21ataatccacc tatcccagta ggagaaat28
權(quán)利要求
1.一種HIV基因檢測(cè)芯片，其中在固相載體上固定有HIV特異性基因片段和陽(yáng)性及陰性對(duì)照，所述HIV特異性基因片段包括SEQ ID NO1-6的序列，陽(yáng)性對(duì)照為SEQ ID NO7，陰性對(duì)照為SEQ ID NO8。
2.如權(quán)利要求1的芯片，所述HIV特異性基因片段以不同的濃度梯度固定在固相載體上。
3.如權(quán)利要求2的芯片，所述不同的濃度梯度為6個(gè)第1梯度濃度為0.5μg/μl，第2梯度濃度為0.1μg/μl，第3梯度濃度為0.05μg/μl，第4梯度濃度為0.01μg/μl，第5梯度濃度為0.005μg/μl，第6梯度濃度為0.001μg/μl。
4.一種如權(quán)利要求1所述HIV基因檢測(cè)芯片的制備方法，其步驟包括(1)在一個(gè)試管中加入含有隨機(jī)六核苷酸引物的反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系還含有引物組SEQ ID NO.14+12、SEQ ID NO.20+10、SEQ ID NO.20+11、SEQ ID NO.21+13、SEQ ID NO.18+12、SEQ ID NO.15+12、SEQ ID NO.20+9、SEQ ID NO.16+9、SEQ ID NO.17+10、SEQ ID NO.19+11中的一種或幾種，對(duì)HIV RNA樣品一次完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR擴(kuò)增；(2)從以上得到的片段中挑取陽(yáng)性片段克隆，測(cè)序證實(shí)后保存；(3)將上述克隆的陽(yáng)性片段引物組合在不同病人血液中經(jīng)RT-PCR證實(shí)后，選出具有SEQ ID NO1-6的序列的引物組合探針，保存。(4)將所述保存的探針擴(kuò)增產(chǎn)物純化后與經(jīng)擴(kuò)增、純化步驟的所述陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照放置到微型板中，然后將濃度調(diào)整為所述不同濃度梯度后點(diǎn)膜；(5)將點(diǎn)膜后濾膜進(jìn)行交聯(lián)固定，制成HIV基因檢測(cè)芯片。
5.一種如權(quán)利要求4所述HIV基因檢測(cè)芯片的制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述不同濃度梯度為6個(gè)第1梯度濃度為0.5μg/μl，第2梯度濃度為0.1μg/μl，第3梯度濃度為0.05μg/μl，第4梯度濃度為0.01μg/μl，第5梯度濃度為0.005μg/μl，第6梯度濃度為0.001μg/μl。
6.一種應(yīng)用如權(quán)利要求1HIV基因檢測(cè)芯片檢測(cè)HIV核酸的方法，包括以下步驟(A)從樣本中分離RNA；(B)將得到的RNA轉(zhuǎn)移到一個(gè)試管中，加入含有SEQ ID NO9-21序列的反應(yīng)體系，一次完成逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和地高辛標(biāo)記；(C)將標(biāo)記好的探針與所述HIV基因檢測(cè)芯片雜交，根據(jù)雜交結(jié)果判斷樣本中是否存在HIV。
7.如權(quán)利要求6的方法，其中所述樣本可以是血液、血清、血漿、淋巴液、精液、尿液、唾液或腦脊液。
8.如權(quán)利要求6的方法，所述樣本中HIV是否存在的判斷通過(guò)顯色反應(yīng)完成。
9.如權(quán)利要求6的方法，所述步驟還包括通過(guò)掃描儀掃描進(jìn)行半定量檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明適用于HIV核酸檢測(cè)領(lǐng)域，提供了一種HIV基因檢測(cè)芯片，其制備方法和應(yīng)用其檢測(cè)HIV核酸的方法。其中在芯片的固相載體上固定有HIV特異性基因片段和陽(yáng)性及陰性對(duì)照，所述HIV特異性基因片段包括SEQ IDNO1－6的序列，陽(yáng)性對(duì)照為SEQ ID NO7，陰性對(duì)照為SEQ ID NO8。本芯片很好地解決了HIV核酸檢測(cè)過(guò)程中靈敏度與特異性之間的制約關(guān)系，提高了產(chǎn)品的質(zhì)量和實(shí)用性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101045946SQ20071007426
公開(kāi)日2007年10月3日 申請(qǐng)日期2007年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月29日
發(fā)明者馮鐵建, 趙廣錄, 王曉輝, 陳琳, 石向東 申請(qǐng)人:深圳市疾病預(yù)防控制中心