專利名稱：白木香內生真菌產物螺光黑殼菌酮a的制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明內容屬于化學和生物工程技術領域，具體的說涉及一種真菌來源的螺環化合物螺 光黑殼菌酮A (Spiropreussione A);
本發明還涉及化合物螺光黑殼菌酮A的制備方法；
本發明還涉及化合物螺光黑殼菌酮A在制備抗生素和抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
白木香[y^w7aWaW"e"wi (Lour.) Gilg](又稱沉香)是瑞香科(Thymelaeaceae)白木香屬 tor&)多年生常綠木本植物，其含有黑色樹脂的木質部入藥，名為沉香。沉香具有行 氣止痛，溫中止嘔，納氣平喘的功效，臨床用于治療胸腹脹悶疼痛，嘔吐呃逆，腎虛氣喘。
對中藥沉香的化學成分研究表明其主要含有兩種類型的化學成分即揮發性成分和2-苯 乙基色酮類。現代藥理研究證明沉香中的揮發性成分，如白木香酸及沉香螺旋醇，對神經系 統的藥理模型活性很強；2-苯乙基色酮類具有抗過敏的活性；芐基丙酮是鎮咳的有效成分， 這些結果與沉香傳統用藥的主治功能相吻合。目前國內對白木香的研究主要集中于藥理活性、 化學成分、引種栽培和組織培養等方面，對其內生真菌的研究，以及內生真菌的化學成分的 研究均未見有報道。
內生真菌具有獨特的生理學和生態學特點，更容易產生特殊的次生代謝產物。真菌具有 生長速度快，培養條件易于實現人工控制，可以進行工業化生產的優點。對真菌的研究和開 發利用對生態環境造成的影響小，不會受到自然資源的限制。這些特點使研究真菌的化學成 分及次生代謝產物的生物活性成為尋找新結構的先導化合物的重要途徑之一，為開發新藥、 保健食品等提供了重要的科學依據。自然界存在的真菌種類繁多，從這些真菌的發酵產物中 尋找到結構獨特，作用機理新穎的活性成分，是新藥研制的基礎性工作。

發明內容
本發明的目的在于提供一種化合物螺光黑殼菌酮A (Spiropreussione A)。 本發明的另一目的在于提供一種從光黑殼菌(iVe"M/" sp.) AS-5的液體發酵培養物中制 備化合物螺光黑殼菌酮A的方法。該方法中AS-5的發酵工藝簡單、生產周期短、成本低， 可用于大規模發酵培養；AS-5的次生代謝產物螺光黑殼菌酮A的結構新穎，在發酵產物中的 含量高，制備工藝簡單。本發明的再一 目的在于提供螺光黑殼菌酮A用于抗生素和抗腫瘤藥物的研究和應用。 用于實現本發明目的的化合物螺光黑殼菌酮A是從真菌AS-5的液體發酵物中分離得到 的。真菌AS-5由多年生木本植物白木香[v^m'/fln'a w'"era^ (Lour.) Gilg]的莖中分離純化得到， 經培養鑒定為光黑殼菌(ZVeww'asp.)。該菌種于2007年4月27日在中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心保藏，保藏單位地址北京市海淀區中關村北一條13號，中國科學 院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo.2022。保藏和存活證明見附件。 化合物螺光黑殼菌酮A具有以下理化性質
(1) 形狀黃色針狀結晶；
(2) 熔點153-154°C;
(3) 分子量320;
(4) 分子式C19H1205;
(5) 化學結構式<formula>formula see original document page 5</formula>
制備上述化合物采用的技術方法主要包括以下步驟
(1) AS-5的液體發酵培養
將真菌AS-5自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉接于含PDA培養基的平皿中，于 24-26'C暗培養5-10天，分別在菌落邊緣打孔成菌片，并以小碎塊接入液體培養基進行發酵 培養；
液體培養的培養基組成為葡萄糖1-4%， KH2P040.1-0.5%， MgS040.1-0.3%，麥麩1-5% (煮汁)，以上組分均按重量百分含量計算，其余成分為水，培養基pH 5.0-6.5。三角瓶或其 他容器振蕩培養真菌，容器裝量30-60%。振蕩轉速90-130轉/分鐘，20-26"暗培養4-10天收獲。
(2) 真菌AS-5發酵培養物的獲得
真菌AS-5經發酵培養后，用尼龍網過濾，分離菌絲體和發酵液，按下列方法分別處理菌 絲體和發酵液部分
①菌絲體部分用清水沖洗2-3遍，擠壓除去大量水分，晾干或55-65。C烘干，適當粉碎成粗顆粒；
②發酵液部分冷凍干燥得到發酵液凍干粉，或60-65"C減壓濃縮至小體積得到發酵液濃縮
物；
(3)化合物螺光黑殼菌酮A的制備
①菌絲體粗顆粒和發酵液凍干粉，用甲醇、95%乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、二氯 甲烷、三氯甲烷、二氯甲烷-甲醇或三氯甲垸-甲醇等有機溶劑浸泡提取、超聲波提取或滲漉 提取，提取液55-65'C減壓濃縮至小體積，60-65'C水浴除去有機溶劑，得到提取浸膏；
發酵液濃縮物加入95%乙醇或無水乙醇進行醇沉，使混合物中含有70-80%的乙醇，震 搖或劇烈攪拌后放置分層，收集上清液，沉淀部分加入95%乙醇或無水乙醇，重復以上操作 2-4次，收集上清液后55-65。C減壓濃縮至小體積，60-65。C水浴除去殘留乙醇，得到提取浸膏；
(D提取浸膏用蒸熘水分散，石油醚萃取；萃取液55-65'C減壓濃縮后經100-200目硅膠柱 分離，流動相為石油醚至石油醚-乙酸乙酯(2:1)梯度洗脫，經過重結晶純化，得到化合物 螺光黑殼菌酮A。
化合物螺光黑殼菌酮A對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)為8pg'mL'1，對人肝 癌細胞Bel-7402的ICso為0.95嗎.mU1,對人卵巢癌細胞A2780的1(35()為0.77嗎 mL"。
具體實施方式
實施例
將光黑殼菌(iVei^Wa sp.) AS-5自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉接于含PDA培 養基的平皿中，于25'C恒溫培養6天，在菌落邊緣打孔成菌片，并以小碎塊接入液體培養基 進行發酵培養。真菌液體培養的培養基組成為葡萄糖2%， KH2PO40.3%， MgSO40.15%， 麥麩3%(煮汁)，培養基pH6.0。 250tnL三角瓶裝培養基lOOmL， 121。C滅菌20分鐘，接入 真菌AS-5。培養條件搖床振蕩轉速100轉/分鐘；2fC暗培養7天。
發酵培養結束后，用100目尼龍網過濾，將發酵產物分為菌絲體和發酵液兩部分。菌絲體 部分用水沖洗干凈，擠壓除去大部分水分，6(TC烘干。干燥的菌絲體略碎后，用95%乙醇浸 泡24小時，并不時攪拌，超聲波提取3次，每次提取30分鐘，每次提取溶劑用量(V)分別為 菌絲體重量(W)的10倍、7倍和6倍。合并3次提取液,60'C減壓(真空度0.6)濃縮至浸膏密 度為1.15 (5(TC)，得到菌絲體提取浸膏。
菌絲體提取浸膏用1.5倍體積的蒸餾水分散，石油醚萃取，萃取液55。C減壓(真空度0.6)
濃縮后，經100-200目硅膠柱分離，流動相為石油醚至石油醚-乙酸乙酯(2 : 1)梯度洗脫，
收集石油醚-乙酸乙酯(7 : 2)的流分，經過葡聚糖凝膠SephadexLH-20柱凈化，流動相為三氯甲垸-甲醇(1 : 1),重結晶，得到化合物螺光黑殼菌酮A。 螺光黑殼菌酮A具有以下理化性質
(1) 形狀黃色針狀結晶；
(2) 熔點153-154°C;
(3) 分子量320;
(4) 分子式C19H1205;
(5) 比旋度[a]3 =-0.005° (c=0.078， CH3OH);
(6) 紫外吸收光譜《，(logs) =225,6nm (3.63);
(7) 紅外吸收光譜Om-1: 3510, 3346， 3061， 1749， 1705， 1608， 1587， 1416，
1379， 1344, 1321， 1277， 1246， 1204， 1078， 1059, 1041， 1003, 970， 933;
(8) 高分辨電子轟擊質譜(HREI-MS) m/z: 320.0690(Calc. Mass for C19H1205 320.0685); 電子轟擊質譜(EI-MS) m/z: 320 (100), 303， 291， 275， 265, 237， 197， 170;
(9) 氫核磁共振譜('H-NMR)和碳核磁共振譜(13C-NMR)數據見表1
表1螺光黑殼菌酮A的NMR數據(600 MHz for 'H-NMR and 150 MHz for 13C-NMR in CDC13)
Position(C)力-麗R(J in Hz)"C-NMRCOSY correlation腹BC
166.78sC-3,C-4, C-4，，C-5'
2198.49sC-3
37.19 (1H, d, 6)150.16dH-4C-4
47.13 (1H, d, 6)150.77dH-3C-3
197.57sC-4
2，5.38(1Ha, d， 10.8)77.74tH隱2，bC-4，， C-5'， C-2'
2.66 (1Hb， d， 10.8)H-2'a
3，110.10sC-4，， C-5'
4，6.00 (1H, d, 6)129.59dH-5'C-5,, C-2'
5，6.41 (1H, d， 6)140.84dH-4，C-4，， C-2'
4，，6.89 (1H, d，7.8)IIO扁H-5"C-5"
S "7.38 (1H, dd, 7.8, 8.4)127.60dH-4", H-6"C-4", C-6"
6，，7.46 (1H, d， 8.4)121.21dH-5'，C-5，，
7'，7.45 (1H, d, 8.4)120.93dH-8"C-8"
8，，7.37 (1H, dd, 7.8, 8.4)127.28dH-7", H-9"C-7"， C-9"
9"6.85 (1H, d, 7.8)109.62dH-8,,C-8"10" 146.86s C-9"
11" 147.17s C-4"
12" 113.24s C-4"， C陽9"
13" 134.09s C-5", C-6", C-7" C-8
(10)推定化學結構式
經以上物理方法和波譜數據測定，螺光黑殼菌酮A (Spir叩reussioneA)的結構為二螺[3-環戊烯-1,1，-[4]環戊烯-3，,2"陽萘并[1,8-d,e][1，3] 二氧雜芑]-2,5- 二酮,2，-羥基 (Despiro[3-cyclopentene-l,r-[4]cycolpentene-3，,2"-naphtha[l，8-d,e][l，3]dioxin]-2，5-dione,2，-hydro
xy-[9Ci])。
3
比較例
1.從AS-5發酵液中制備螺光黑殼菌酮A
將經過PDA平板活化的真菌AS-5接入麥麩液體培養基，24'C搖床振蕩暗培養8天。培 養結束后，用100目尼龍網過濾，將發酵產物分為菌絲體和發酵液兩部分。發酵液冷凍干燥 成凍干粉。將發酵液凍干粉以石油醚(60-90'C)滲漉提取，溶劑用量(V)為凍干粉重量(W) 的15倍。滲漉液于55。C減壓回收溶劑，得到發酵液提取浸膏。提取浸膏經100-200目硅膠柱 分離，流動相為石油醚至石油醚-乙酸乙酯(2:1)梯度洗脫，收集石油醚-乙酸乙酯(7 : 2) 的流分，經過葡聚糖凝膠SephadexLH-20柱凈化，流動相為三氯甲垸-甲醇(1 : 1)，重結晶， 可得到化合物螺光黑殼菌酮A。2. 螺光黑殼菌酮A的抗菌活性
用紙片法測定，紙片(①6mm)含螺光黑殼菌酮A5嗎時對金黃色葡萄球菌(&印/^/ococow fl"w^)的抑菌圈直徑為16-17mm。用倍比稀釋法測定螺光黑殼菌酮A對金黃色葡萄球菌的 最低抑菌濃度(MIC)為8嗎'ml/1。以芐基青霉素鈉為標準品，用管蝶法測定螺光黑殼菌酮 A的抗生素效價為0.05 U。
3. 螺光黑殼菌酮A的抗腫瘤活性
采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT法)測定螺光黑殼菌酮A對人大腸癌細胞 HCT-8，人胃癌細胞BGC-823,人肺癌細胞A549,人卵巢癌細胞A2780和人肝癌細胞Bel-7402 的半數抑制濃度(IC5o)，結果表明螺光黑殼菌酮A對人肝癌細胞Bel-7402的IC5o為0.95嗎-mL—1,對人卵巢癌細胞A2780的ICso為0.77嗎.mU1，對其他三種癌細胞的ICso均高于3.2嗎 ml/1。
權利要求
1.一種化合物螺光黑殼菌酮A(SpiropreussioneA)，具有以下理化性質(1)形狀黃色針狀結晶；(2)熔點153-154℃；(3)分子量320；(4)分子式C19H12O5；(5)化學結構式
2. —種制備化合物螺光黑殼菌酮A (SpiropreussioneA)的方法，包括步驟(1) 真菌AS-5的發酵培養將光黑殼菌(/Vei^yz'a sp.) AS-5自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉接于含PDA培 養基的平皿中，于24-26'C暗培養5-10天，分別在菌落邊緣打孔成菌片，并以小碎塊接入液 體培養基進行培養和發酵；液體培養的培養基組成為葡萄糖、KH2P04、 MgS04、麥麩；三角瓶或其他容器振蕩培養 真菌；(2) 真菌AS-5發酵培養物的獲得真菌AS-5經發酵培養后，用尼龍網過濾，分離菌絲體和發酵液，按下列方法分別處理菌 絲體和發酵液部分① 菌絲體部分用水沖洗干凈，擠壓除去大量水分，晾干或烘干，適當粉碎成粗顆粒；② 發酵液部分冷凍干燥得到發酵液凍干粉，或減壓濃縮至小體積得到發酵液濃縮物； G)螺光黑殼菌酮A (SpiropreussioneA)的制備① 菌絲體粗顆粒和發酵液凍干粉，用有機溶劑提取；提取液減壓濃縮至小體積，水浴除 去有機溶劑，得到提取浸膏；② 發酵液濃縮物加入95。/。乙醇或無水乙醇進行醇沉，使混合物中含有70-80%的乙醇，震 搖或劇烈攪拌后放置分層，收集上清液，沉淀部分加入95%乙醇或無水乙醇，重復以上操作 1-3次，收集上清液后減壓濃縮至小體積，水浴除去殘留乙醇，得到提取浸膏；③提取浸膏用蒸餾水分散，石油醚萃取；萃取液濃縮后經100-200目硅膠柱分離，流動 相為石油醚至石油醚-乙酸乙酯(2:1)梯度洗脫，經過重結晶純化，得到化合物螺光黑殼菌 酮A。
3. 如權利要求2所述的培養方法，其中所述的真菌為光黑殼菌(iVe,&sp.) AS-5，保 藏編號CGMCCNo. 2022。
4. 如權利要求2所述的方法，其特征在于真菌AS-5液體培養的培養基組分按重量計 為葡萄糖1-4%， KH2P04 0.1-0.5%， MgS04 0.1-0.3%，麥麩1-5% (煮汁)，其余成分為水， 培養基pH 5.0-6.5，培養容器裝量30-60%，振蕩轉速90-130轉/分鐘，20-26。C暗培養4-10天 收獲。
5. 如權利要求2所述的方法，其特征在于AS-5菌絲體或發酵液的干燥、提取、濃縮 等處理過程，菌絲體提取浸膏、發酵液提取浸膏或發酵液濃縮物的萃取、溶劑回收、水浴加 熱等處理過程，其中的處理溫度不得高于7(TC。
6. 如權利要求2所述的方法，其特征在于提取干燥菌絲體和發酵液凍干粉的有機溶劑 可以是甲醇、95%乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、二氯甲垸、三氯甲烷、二氯甲烷-甲醇和 三氯甲垸-甲醇。
7. 如權利要求2所述的方法，其特征在于提取干燥菌絲體和發酵液凍干粉的方法可以 是浸泡提取、超聲波提取或滲漉提取。
8. 如權利要求1和2所述的化合物螺光黑殼菌酮A，具有抗金黃色葡萄球菌和抗腫瘤細 胞的活性，可用于抗生素和抗腫瘤藥物的制備及應用。
9. 用于任一權利要求2-8的真菌為光黑殼菌(尸/rwM/flsp.) AS-5，保藏編號CGMCCNo. 2022。
全文摘要
本發明屬于化學和生物工程技術領域，涉及一種真菌次生代謝產物螺光黑殼菌酮A(Spiropreussione A)的制備方法及其在抗生素和抗腫瘤藥物中的應用，內容包括產生化合物螺光黑殼菌酮A的光黑殼菌(Preussia sp.)AS-5的液體發酵培養工藝；從發酵生產的AS-5菌絲體和發酵液中制備該化合物的方法；該化合物的結構和物理化學性質；該化合物對金黃色葡萄球菌和腫瘤細胞的抑制活性。該項技術中，真菌AS-5生長速度快，發酵工藝簡單，生產成本低，AS-5的次生代謝產物螺光黑殼菌酮A結構新穎，在發酵產物中的含量高，制備工藝簡單。
文檔編號C12R1/645GK101293886SQ20071009772
公開日2008年10月29日 申請日期2007年4月29日 優先權日2007年4月29日
發明者孟志霞, 施琦淵, 王春蘭, 譚小明, 郭順星, 陳曉梅 申請人:中國醫學科學院藥用植物研究所