專利名稱：傷寒沙門氏菌快速檢測試劑盒的制備和檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種禾傭環介導紫顯擴增(LAMP)技術進行菌樣盼^I檢測的方法，具體是一種傷寒沙門氏菌決速檢測試劑盒的制備和檢測方法。
技術背景傷寒沙門氏(Salmonella enterica)是一類大小0. 6 1. 0X2 3um，無芽胞的革 蘭氏陰性桿菌，是病原件腸道細菌的一個屬，包括腸傷寒桿菌， 一般有鞭毛，無刻莫， 多數有菌毛，在形態l:和生理上都極似大腸桿菌，1885年沙門氏等在霍舌L流行時分離到 豬霍亂沙門氏菌，故定名為沙門氏菌屬。沙門氏菌屬有的專對人類致病，有的只對動物 致病，也有對人和動物者降文病。沙門氏菌病是指由各種類型沙門氏菌所弓跑的X寸人類、 家畜以皿生禽獸不同形式的總稱。感染沙門氏菌的人或帶菌者的糞便污,品，可使 人發生食物中毒。據統計在世界各國的種類細菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中 毒常列榜首。我國內陸地區也以沙門氏菌為首位。沙門氏菌分布很廣，廣泛在于自然界 中，常可在各種動物，如豬、牛、羊、馬、等家畜忠鳥、鴨、鵝、等家禽，飛鳥、鼠類 等野生動物的腸道中發現。雞是沙門氏菌最大的儲存儲主，雞群暴發死亡率高達80%， 也存在于蛋類、穀分及其它食物中(牛肉、豬肉、魚肉、香腸、，退等)。傷寒沙門氏菌， 甲、乙、丙型副傷寒沙門氏菌和仙臺沙門氏菌等只對人類致病，而馬流產沙門氏菌，雛 沙門氏菌只對馬和雞致病。可引起如下類型的疾病:(1)腸熱癥(2)食物中毒(3)慢性腸 炎(4)敗血癥。人們在探索沙門氏菌檢測方法的過程巾，作出了不懈的努力，現有樹則方 法主要有1、同位素fei己，該方溜頓同位素1^i己的傷寒沙門氏菌DNA片段，經大約 48h的增菌步驟后，其檢測敏感性高，但所需時間較長，目前尚未見用環介導等溫擴增 方法檢測傷寒沙門氏菌的試劑紐離測方法附艮道。 發明內容本發明的目的是提供一種傷寒沙門氏菌的快速檢測試劑盒的制備和檢測方法，以 克服現有技術的上述缺點，從而為水產養殖和食品安全掛共科學的依據和指導作用。本發明的主要原理為(1 )特殊設計一組可以識別靶DNA六個不同序列的兩個內弓I 物(上游內弓嫩和下游內引物)和兩個外引物(上游外引物和下游外弓物)，而且內引物包含耙DNA的正義鏈和反義能(2)其中一個內弓物首先和靶DNA雜交，隨后的f趕換 DNA合成在具有高度,連置換活性的DNA聚合酶的參與下由一個外引物啟動，釋放出單f連 DNA，并作為由雜交到耙的另一端的一個內弓嫩和一個夕卜弓嫩啟動的DNA合j^對反，產生 -個原始的莖環DNA; (3)內引物以原始莖環DNA做模板，啟動鏈置換DNA的合成，產 生一個原始的蓬環DNA和一個新的由兩倍蓮長度的莖環DNA; (4)在^M條件下，內引 物以莖環DNA為t對及，ffiilf趕換形成多4^有-革巴DNA重mi^列的莖環DNA，在一小時 內該循環反應可使革巴DNA累積到109拷貝，可fflJl熒光染料^^^T增結果。本發明涉及的傷寒沙門氏菌卜魏檢測試劑盒，其中的試劑包括如下(1) - (4):(1)環介導紫顯擴增(L鮮)反應液 其中包括10XThermopol反應緩沖液、300—500 timol/L dNTP、 2—4mmol/L硫酸 鎂(MgS04)、 0. 8—1. 2umol/L上游引內物(FIP)、 0. 8—1. 2umol/L下游內引物(BIP)、 0. 2—0. 3 y mol/L上游外弓l物(F3)、 0. 2—0. 3 li mol/L下游外弓l物(B3)和1—1. 5mol/L 甜熟庇上游內引物5- TTACGTCACCAACGACACGGG-ACGTATTGGGCAATGACTGG -3 、 下游內引物5- CGGTAAATACCATCCCCACGGC陽TAACGCAGCGAGAATGGC -3 、上游外弓l物5- GTCGCGTACTTTACGCCAT -3 、下游外引物5-ACCCTGACCATCCACCAG-3 ， 其中混合物dNTP內的四種脫氧核糖核酸的質量比為dUTP: dATP: dGTP: dCTP=2:1:1:1。其中所述的lOXThemopol反應緩沖液中含有200 mmol pH8. 8的三羥基甲基MS 甲烷—鹽酸(Tris—HC1)、 100mirol/L氯化鉀(KC1)、 100腿ol/L硫酸智((肌)2SO〗)、 20 imol/L硫^!美(MgSCU禾口1X曲拉通X—100 (Triton X—100);(2) UNG酶1 U/";(3) Bst DNA聚合酶8 U /uL;(4) 顯色劑為10X的熒光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。 上面所述環介導等溫擴增(LAMP)反應液中每管23 uL的最佳紹成為2.5uL 10XThermopol反應緩沖液、1. 0 u L 10ramol/L dNTP、 1. 0 u L 20 y mol/L上游內引物(FIP)、 1.0iiL20iimol/L下、游內弓lt/ (BIP)、 0. 25y L 20 y mol/L Ji游夕卜弓l物(F3)、 0. 25nL20u mol/L下游外引物(B3)、 0. 5 u L 100 mmol/L MgS(X、 12. 5 u L 2M甜菜石堿和4 u L ddH20 (滅菌雙蒸水)。使用上述試劑盒檢測傷寒沙門氏菌的方法，依次包括下列步驟(1) - (3):(1) 待檢樣品或細菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA ，其DNA 0D250/0D250加在1.6-2.0范圍內， 濃度在10-100 ng/ ii L范圍內。(2) 進行傷寒沙門氏菌的環介導等顯擴增反應A. 在裝有23 y L LAMP反應液的反應管中加入1卩L待檢模板DNA，和0. 5 u L的UNG 酶，于恒溫浴上50。C放置3 rain， 95。C放置3—5 min，立即置于冰上l一3 min;B. 在反應管中加入1 li L Bst DNA聚合酶；C. 于恒溫65。C放置45—90 min;D. 將水浴調到8。C中止反應，3—5min后取出待檢；(3) 顯色檢測在待檢的針反應管中加入b L顯色劑，直接用卿B見察顏色變化，如果顏色為黃 色，說明待檢樣品不含或者不是傷寒沙門氏菌，如果顏色變為鄉絶，貝lj說明待檢樣品含 有或者為傷寒沙門氏菌。本發明建立了傷寒沙門氏菌的環介導等溫擴增檢測試劑M檢測方法，本試劑獻艮 據傷寒沙門氏菌的gyrA基因的基本保守區的六個序列設計了兩^#異性內弓胸和兩個 特異性外引物，該保守基因序列為傷寒沙門氏菌各不同血清型和菌株MJ^共有，以保證 從種的水平上檢測不同來源的傷寒沙門氏菌株的可靠性。本發明采用環介導等溫擴增 (LAMP)技術，該技術特異性強，與PCR檢測方法有相同的高靈敏度，但不需要昂貴的 PCR儀，只需普通的水浴鍋即可，且結果不必用翻交電泳方、 辣觀察，4頓熒光染料來 觀察即可，簡單而快速。可用于傷寒沙門氏菌的檢測，特別適用于基層醫療機構。下列實施例進一歩說明本發明，但不應當作對本發明的限制。 實施例1按下歹脂己方制作傷寒沙門氏菌的環介導樂顯擴增試劑盒 (1)酉己制LAMP反應液含有2.5 u lOXThemopol反應緩沖液、l.O卩L 10mmol/L dNTP、 1.0 uL 20Umol/L上游內引物(FTP)、 1.0uL20umo〗/L下游內弓i物(BIP)、 0. 25y L20"mol/L 上游外引物(F3)、 0.25yL20iimol/L卜游外引物(B3)、 0. 5 u L 100ramol/LMgS04、 12.5 u L 2 mol/L甜^l!^卩4 u L ddH20 。 其中戶7M的上游內引稱5- TTACGTCACCAACGACACGGG-ACGTATTGGGCAATGACTGG -3 、下游內引物5- CGGTAAATACCATCCCCACGGC-TAACGCAGCGAGAATGGC-3、匕游外弓(物5- GTCGCGTACTTTACGCCAT -3 、 下游外弓l物5-ACCCTGACCATCCACCAG-3 ;其中混合物dNTP內的四種脫氧核糖核酸的質量比為 dUTP:dATP:dGTP:dCTP=2:1:1:1。(2) UNG酶1 U/yL;(3) Bst D魁聚合酶8U(4) 顯色劑為10X的熒光染料SYBR GREEN I。 按照以下(1) - (3)禾M)字進行檢測(1) 樣品DNA的提取檢測薪中鼠傷寒沙門氏菌(&ifflQ/ e"s ^iffiwr/履)，薪中來源中國檢科院食品安 全微生物薪中保藏中心，編號IQCC10503.2。 大連寶生物工程公司的植物核 取試劑盒提取樣品DNA， DNA 0D，/ OD觀育夠 達到1.S，鵬達到20 ng/uL。(2) 進行傷寒沙門氏菌的環介導等溫擴增反應A. 在裝有23 u L LAMP反應液的反應管中加入1 y L待檢豐對及DNA，禾口 0. 5卩L的UNG 酶，于恒溫水浴上50。C放置3 min， 95。C放置5min，立即置于冰上1 min;B. 在反應管中加入l uL Bst DNA聚合酶；C. 于恒溫65 。C放置l小時；D. 將水浴調到80 。C中止反應，3 min后取出；(3) 顯色檢測在待檢的旨反應管中加入l "L上述顯色劑，直接用肉目歐見察顏色變化，如果顏 色為黃色，說明待檢樣品不含或者不是傷寒沙門氏菌，如果顏色變為鄉絶，貝喊明待檢樣品含有或者為傷寒沙門氏菌。實施例2按下歹鵬己方制作傷寒沙門氏菌的環介導等顯擴增試劑盒 (1)酉己制LAMP反應液含有2.5yL lOXThermopol反應緩沖液、1.0yL 10咖ol/L dNTP、 1.0 uL 20u mol/L上游內引物(FTP)、 1.0 yL20 yraol/L下游內引物(BIP)、 0.25 yL20幽l/L 上游外引物(F3)、 0.25 uL20 umol/L下游外引物(B3)、 0.5 M L 100咖ol/L MgS04、 12. 5 u L 2 mo〗/L甜^W3 4 ii L d維其中戶脫的上游內弓嫩、下游內引物、上游外弓嫩、下游外弓嫩同上。 ，混合物dNTP內的四種脫氧核糖核酸的質量比為dUTP:dATP:dGTP:dCTP=2:l:l:l。(2) UNG酶1 U/uL;(3) Bst DNA聚合酶8U /uL;(4) 顯色劑為10%的熒光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。 按照以下(1) - (3)禾旨進行檢測(1) 樣品DNA的提取繊隨種甲型副傷寒沙門氏菌(&i/^W&A2ra^/w J)，菌種繊中國翻棍食 品安全微生物餅中保藏中心，編號IQCC10518。使用北京天根生物工程公司的植物核酸提取試劑盒提取樣品DNA， DNA 0DM/ 0D， 歸達到1. 7，濃度達到22 ng,/ ii L。(2) 進行傷寒沙門氏菌的環介導等顯擴增反應A. 在^W23uL LAMP反應液中的反應管中加入luL待檢豐對及DNA，和0.5uL的 UNG酶，于瞎O7K浴上50。C放置3 min， 95。C放置5min，立即置于冰上1 min;B. 在反應管中加入luL Bst DNA聚合酶；C. 亍,JC浴上63。C體1 h;D. 將水浴調到9(TC中止反應，3min后取出；(3) 顯色檢測在待檢的齡鵬管中加入b L顯色劑，直接用卿^見察顏色變化，如果顏色為黃 色，說明待檢樣品不含或者不趙勞寒沙門氏菌，如果顏色變為纟絶，則說明待檢樣品含 有或者為傷寒沙門氏菌。核苷,列表〈110〉山東出入境檢驗檢疫局檢驗皿,中心〈120〉傷寒沙門氏菌^I檢測試劑盒的帝恪和檢測方法〈160〉 4〈210〉 1〈211〉 41〈212〉 DNA〈213〉 AX序列〈221> prim—bind〈222> (1)…(41)〈400> 1ttacgtcacc aaccacacgg gacgtattgg gcaatgactg g 41〈210〉 2 〈211> 40 〈212>醒 〈213〉 AX序列 〈221〉 prim—bind 〈222〉 (1)…(40) ■> 2cggtaaatac catccccacg gctaacgcag cgagaatggc 40〈210〉 3 〈211> 19 〈212〉 DNA 〈213〉 AX序列 〈221〉 prim—bind 〈222〉 (l)... (19) 〈400〉 3gtcgcgtact ttacgccat 19<210〉 4 〈211> 18 〈212〉 DNA 〈213〉 AX序列 〈221> prim—bind 〈222〉 (1)…(18) 〈400> 4accctgacca tccaccag 18
權利要求
1. 一種傷寒沙門氏菌快速檢測試劑盒，其特征在于其中的試劑包括(1)-(4)(1)環介導等溫擴增反應液包括10×Thermopol反應緩沖液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸鎂、0.8-1.2μmol上游內引物、0.8-1.2μmol/L下游內引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜堿；其中10×Thermopol反應緩沖液含有200mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和1％曲拉通X-100；其中上游內引物；5-TTACGTCACCAACGACACGGG-ACGTATTGGGCAATGACTGG-3、下游內引物；5-CGGTAAATACCATCCCCACGGC-TAACGCAGCGAGAATGGC-3、上游外引物5-GTCGCGTACTTTACGCCAT-3、下游外引物5-ACCCTGACCATCCACCAG-3；(2)UNG酶1U/μL；(3)Bst DNA聚合酶8U/μL；(4)顯色劑為10％的熒光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2. 根據權利要求1中所述的傷寒沙門氏菌快速檢測試劑盒，其特征是上述 dNTP內的四種脫氧核糖核酸的質量比為dUTP:dATP:dGTP:dCTP=2:1:1:1。
3. 傷寒沙門氏菌的快速檢測方法，其特征是依次包括下列(1) -(3)步驟(1) 待檢樣品或細菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA 0D柳/ 0D，在1. 6-2. 0范圍 內，濃度在10-100 ng/uL范圍內；(2) 進行傷寒沙門氏菌的環介導等溫擴增反應A.在裝有23uLLAMP反應液的反應管中加入luL待檢樣品模板DNA，和 0. 5yL的UNG酶，于恒溫95 。C放置3 — 5 min，立即置于冰上1 — 3 min;B. 在反應管中加入luL Bst DNA聚合酶；C. 再于金屬浴中恒溫60 — 65 。C放置45 — 90 min ;D. 將浴中溫度調到80 — 95 'C中止反應，3 — 5 min后取出待檢；(3)顯色檢測在每個反應管中加入1PL上述的顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化， 如果顏色為黃色，說明待檢樣品不含或者不是傷寒沙門氏菌，如果顏色變 為綠色，則說明待檢樣品含有或為傷寒沙門氏菌。
全文摘要
本發明涉及一種利用環介導等溫擴增(LAMP)技術進行菌樣的快速檢測的方法，具體說是一種傷寒沙門氏菌快速檢測試劑盒的制備和檢測方法。該試劑盒內包括環介導等溫擴增反應液、Bst DNA聚合酶、顯色劑；環介導等溫擴增反應液中含有反應緩沖液、dNTP、硫酸鎂、上游內引物5-TTACGTCACCAACGAC ACGGGACGTATTGGGCAATGACTGG-3、下游內引物5-CGGTAAATACCATCCCCACGGCT AACGCAGCGAGAATGGC-3、上游外引物5-GTCGCGTACTTTACGCCAT-3、下游外引物5-ACCCTGACCATCCACCAG-3和甜菜堿；檢測傷寒沙門氏菌的方法包括細菌DNA的提取、傷寒沙門氏菌的環介導等溫擴增、顯色檢測。其優點是快速、特異性強、靈敏度高而且成本低。
文檔編號C12Q1/10GK101255460SQ20081001500
公開日2008年9月3日 申請日期2008年3月25日 優先權日2008年3月25日
發明者超 林, 梁成珠, 賈俊濤, 高宏偉 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心