專利名稱：噬氨副球菌hpd-2及其在土壤修復中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及噬氨副球菌，具體涉及一種噬氨副球菌HPD-2及其在多環芳烴污染土;裏 ^修復中的應用。
二背景技術：
多環芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是環境中普遍存在的一類有機污 染物，由于其在環境中的半衰期較長和致癌、致畸、致突變的性質而受到人們的重視。美 國環保局在20世紀80年代初把16種未帶分支的PAHs確定為環境中的優先污染物，我 國也將其列入環境污染的黑名單中。苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene, B[a]P)是由五個苯環組 成的一種多環芳烴化合物，致癌性極強，是閨內外環境監測的重要指標之一。芘(Pyrene, PYR)和熒蒽(Fluoranthene， FA)都是四環的多環芳烴化合物，也具有一定的致癌作用。 三環以上的PAHs都屬于高分子量PAHs。通常認為，PAHs的環數越高，越難被孩i生物降 解利用。
近年來，國內外對高分子量PAHs的微生物降解研究表明，能夠同時降解多種高分子 量PAHs (如四環和五環)的微生物資源還很少。目前有關副球菌屬對PAHs的降解研究 較少，主要針對四環以下的PAHs，有學者發現能降解萘、蒽、菲、芴、熒蒽、屈、芘等 PAHs的副球菌屬細菌。然而，至今還未報道能夠同時降解B[a]P、芘和熒蒽的副球菌。事 實上，環境中PAHs通常以多種組分同時存在，呈現其復合污染現象。目前還沒有發現能 夠同時降解多種高分子量PAHs的微生物資源。
三
發明內容
技術問題本發明的目的在于針對生產實踐中的實際問題和需求，提供了一種能夠 同時降解多種高分子量PAHs (如四環和五環)的微生物資源，該微生物為高分子量PAHs
降解菌嗟氨副球菌(戶aracocow fl附/"ovorara) HPD-2 CGMCC No. 2568,該菌可以使溶 液中苯并[a]芘的含量降低89.7。/0,芘和熒蒽也有大幅降低，具有較廣的降解譜；使污染土 壤中9種PAHs總去除率為22.9%，三環PAHs的降解率為36.1%,四環PAHs的降解率 為20.9%,五環PAHs的降解率為26.0%。該菌抹在PAHs污染土壤的生物修復中具有較 好的應用前景。
技術方案 一種喧氨副球菌(戶flrflcocc船 fir附/wovonms) HPD-2， 該菌抹已在國家知 識產權局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2008年7月3日，保藏單位名稱中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No.2568。噬氨副球菌 (尸ar"coccw aw/"ovorara) HPD-2在降解高分子量多環芳烴污染土壤中的應用。噬氨副 球菌(P"racoccw awzwovorara) HPD-2在降解苯并[a]芘、芘或熒蒽污染土;裏中的應用。 噬氨副球菌(戶amcoo^s am/wovora似)HPD-2的培養基，組成為K2HP04 6.0 g， KH2P04 5.5 g, Na2S04 2.0 g， KC12.0 g， NH4N03 2.0 g, MgS04.7H20 0.2 g，微量元素溶液1.0 mL， 高分子量多環芳烴3mg或50mg，該培養基pH 7.0-7.2。上迷高分子量多環芳烴為苯并[a] 芘、芘或熒蒽。
本發明提供一種高分子量多環芳烴的降解菌，其菌抹是一抹革蘭氏陰性菌HPD-2 (2008年07月03日保藏于中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心，菌種保藏 號為CGMCCNo.2568),經鑒定為嗜氨副球菌(尸aracoccMScwi!'"ovoran5)。該菌林在平板 上生長48 h后呈乳白色凸起菌落，菌落直徑約為l 4mm，表面光滑，邊緣整齊。經染 色鏡檢，該菌為革蘭氏陰性，球狀，菌體直徑為0.6~1.0nm (見圖l、圖2)。
該菌具有較高的降解高分子量多環芳烴的能力。將降解高分子量多環芳烴的 尸aracocctw fl附!7wvom附HPD-2 CGMCC No.2568菌^K接種于牛肉膏蛋白胨培養基搖瓶中， 振蕩培養至對數期；將上述培養好的菌種按10。/o的接種量接種入500mL三角瓶，培養至 對數生長期。在B[a]P濃度為3.0 mg/L的培養液中生長5 d后，B[a]P的降解率為89.7%; 濃度為50 mg/L時，15 d后B[a]P的降解率為46.2% 。該菌抹對四環PAHs也有較好降解 能力，7 d后芘和熒蒽的降解率分別為47,2%和84.5% (見

圖1 ~圖6 )。
將尸aracoccm a附/"ovo/ww HPD-2 CGMCC No.2568菌液按20 %的接種量接入多環芳 烴污染土壤中，28 。C避光培養2周后結果發現，與對照相比，污染土壤中9種PAHs總 去除率為22.9%,三環PAHs的降解率為36.1%,四環PAHs的降解率為20.9%,五環PAHs 的降解率為26.0% (見圖7 ~圖8 )。該菌林在PAHs污染土壤的生物修復中具有較好的應 用前景。
本發明提供的CGMCCNo.2568菌能在苯并[a]芘、芘和熒蒽為唯一碳源和能源的無機 鹽基礎培養基中生長并降解利用高分子量PAHs，其培養基組成為K2HP04 6.0 g, KH2P04 5.5 g, Na2S04 2.0 g, KC12.0 g， NH4N03 2力g， MgS04-7H20 0.2 g，樣i:量元素溶液1.0 mL， pH為7.0-7.2。 12rC滅菌30min。
有益效果該降解菌具有較廣的底物譜，對環境中的PAHs有很好的降解能力。
圖1為菌株HPD-2在固體培養基上菌落形態(A)
圖2為單菌林在透射電鏡(15000倍)下的形態(B)
圖3基于16S rRNA序列同源性的菌林HPD-2和相關細菌的系統發育樹
圖4為菌林HPD-2在B[a]P培養液中的生長曲線(A)
圖5為培養液中B[a]P濃度隨時間的變化(B )
圖6培養7天后菌林HPD-2對PYR和FA的降解情況
圖7土壤中各多環芳烴組分濃度隨時間的變化
圖8生物修復后土壤中三環、四環、五環PAHs及總PAHs的降解率(％)
五具體實施例方式
實施例1:虔氨副球菌(i arac< cci fl附/iKnwwis HPD-2 CGMCC No. 2568)的分離、
鑒定及其降解特性 1.1供試土壤
采自長江三角洲某地多環芳烴重度污染土:l裏。其基本理化性質為pH6.4,有沖幾質 19.2g/kg，堿解氮1.0g/kg,全磷0.5g/kg,有效鉀14.2 g/kg,陽離子交換量21.5cmol/kg。 16種EPA定為優先污染物的PAHs的總量達10.3 mg/kg。新鮮土i裏樣品過2mm篩，于 暗處4'C保存。
1.2供試多環芳烴
B[a]P、 PYR和FA都購自Sigma公司(美國)，均為分析純。 1.3培養類型
①牛肉膏蛋白胨培養基；②無機鹽培養基(MS):每升含K2HPO4 6.0g， KH2P04 5.5 g, Na2S04 2.0 g， KC12.0 g, NH4NCb 2.0 g， MgS04'7H20 0.2 g,樣i量元素溶液1.0 mL (其
組成為1000 mL蒸餾水中溶解lg FeSO7H20， lg MnSO.H20, 0.25gNa2MoO4.2H2O， 0.1gH3BO4， 0.25gCuCl2.2H2O， 0.25gZnCl2， 0.1gNH4VO3， 0.25g Co(N03)2.6H20, O.lg NiS04.6H20)，蒸餾水1000 mL, pH7.0-7.2;③含PAHs的無機鹽培養基以DMF配制 1000 mg/L的不同PAHs (B[a]P， PYR， FA)溶液，按B[a]P濃度(3.0 mg/L或5.0 mg/L) 及PYR， FA按(50.0mg/L)濃度加入滅菌的上述配方的無機鹽培養基。 1.4 PAHs降解菌的分離與純化
稱取10 g上述新鮮供試土壤(即采自長江三角洲某地多環芳烴重度污染土壤)，加入 裝有lOOmL無機鹽液體培養基(B[a]P濃度為5.0 mg/L )的三角瓶中，28。C下200 r/min 振蕩培養1周。按10%接種量轉接到新鮮的B[a]P無機鹽培養基中，繼續培養1周，反 復5次。最后吸取O.l mL培養液稀釋不同梯度涂布于牛肉膏蛋白胨培養基平板上，*沐 單菌落，將平板劃線純化后的單菌落再接種到B[a]P無機鹽液體培養基中，選取生長速度 最快的菌林作為研究菌抹。
1.5菌種形態觀察及鑒定
將已充分活化的菌抹接種到牛肉膏蛋白胨液體培養基中，28。C培養24h,革蘭氏染色 后在光學顯微鏡下觀察該菌抹在平板上生長48h后呈乳白色凸起菌落，菌落直徑約為1 ~ 4mm,表面光滑，邊緣整齊(見圖l)。經染色鏡檢，該菌為革蘭氏陰性，球狀，菌體直 徑為0.6-1.0 jum。將活化菌種在牛肉膏蛋白胨平皿上劃線接種，28。C培養箱中倒置培養 2d,觀察菌落形態，并測量菌落大小。細菌樣品經處理后用日立H-7650透射電子顯微鏡 (TEM)觀察菌體結構。
1.6 16SrDNA的PCR擴增、序列分析和系統發育樹的構建
利用Biospin細菌基因組DNA提取試劑盒(杭州博日科技有限公司)提取細菌DNA。 用于16S rDNA PCR反應的引物為一對通用引物。正向引物為BSF8/20: 5-AGAGT1TGATCCTGGCTCAG-3 ; 反向引物為 BSR1541 / 20 : 5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3。 PCR反應條件94。C 3 min; 94。C 1 min, 56°C 1 min， 72。C2min,循環29次；72。C10min。瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物的測序由上海博 亞生物技術有P艮公司完成。降解菌16S rDNA序列通過Blast程序與GenBank中核酸數據 進行比對分析。然后利用MEGA4.0軟件構建系統發育樹，采用Neighbor-Joining法進行 系統發育分析。
1.7菌懸液的制備
在無菌條件下將菌林接種于5.0 mg/L B[a]P無機鹽液體培養基中，28。C下200 r/min
振蕩培養l周，離心收集菌體，并用磷酸鹽緩沖液反復洗滌3次，再用磷酸鹽緩沖液將菌 懸液調至所需濃度備用。
1.8菌林對苯并[a]芘的降解
將該菌接種量為10%的菌懸液加入50 mL上述液體無機鹽培養基中，以加滅活菌懸 液的處理作為對照(CK)，加入B[a]P,使B[a]P的最終濃度約為3.0mg/L,每個處理設3 個重復。28。C下200r/min避光振蕩培養5天，在不同時段(O、 6、 12、 24、 48、 72、 96、 120h)取樣，4。C冷凍保存。測定溶液中B[a]P的濃度和OD6oo的變化。
1.9菌抹對芘和熒蒽的降解
在50 mL液體無機鹽培養基中加入該菌接種量為10%的菌懸液，以加滅活菌懸液的 處理作為對照，PYR和FA的最終濃度為50.0 mg/L,每個處理設3個重復。28°C下200 r/min 避光振蕩培養7 d后取樣，測定溶液中PYR和FA的濃度。
1.10溶液中多環芳烴的提取與分析
將三角瓶中的菌液全部倒入分液漏斗，加入50 mL乙酸乙酯提取3次，合并提取液 后用無水Na2S04去除水分。在水溫為36。C的旋轉蒸發器中旋轉濃縮至干。加2.0 mL乙 腈溶解，用高效液相色譜(HPLC )測定培養液中多環芳烴含量。流動相為乙腈/水(60: 40), FA、 PYR和B[a]P的保留時間分別為32.5、 35.1和56.5 min。液相色謙為日本島津 Class-vp高效液相色譜分析系統，配熒光檢測器RF-10AXL,柱溫箱OTO-10ASVP， 二元 梯度泵LC-10AT,色諳分離柱為美國Varian公司的ChrottiSpher 5 PAH。
2.1多環芳鋒降解菌林的菌落形態、細胞形態及生理生化特征及序列分析
該喧氨副球菌(尸aracocc附twH力ovorara) HPD-2 CGMCC No. 2568具有以下特征(1) 菌落形態特征在牛肉膏蛋白胨平板上培養48h的菌落大小為直徑1~4 mm,菌落呈圓 形，表面光滑，邊緣整齊，凸起，乳白色(見圖1)。 (2)菌體形態特征該菌為革蘭氏 陰性，球狀，不運動，菌體直徑為0.6~1.0nm (見圖2)。 (3)生理生化特征好氧生長， 氧化酶和接觸酶均為陽性，不產色素，能利用曱胺、三曱胺及丙三醇，不能利用曱酸鹽和 曱醇；能利用果糖和廿露醇，不能利用木糖和蔗糖；能利用硝酸銨和硫酸銨，不能利用尿 素。該菌的16S rDNA PCR產物約1.5 kb左右，16S rRNA序列同源性比對(圖3 )表明， 該菌林16S rRNA序列與尸aracoca^a/m'"ovoram細菌的16S rRNA序列相似性高達99。/n 。 結合上述的形態鑒定與16SrDNA分析結果將此菌林鑒定為副球菌屬，其編號為HPD-2。
2.2 HPD-2在苯并[a]芘培養基上的生長曲線
HPD-2在含有B[a]P的無機鹽液體培養基中的生長曲線見圖4。該菌林從接種到第6 h
生長緩慢，處于延滯期；從6h到12h，菌林開始加速生長，細胞數目開始有所增加；從 24h到48 h,細胞數目急劇增加，OZ)6w值從0.1快速增加到0.4,處于指數生長期；第 48h到96h, 0￡)600值變化不大，細胞處于穩定期；到120 h，細胞數目有所減少，進入 衰亡期。
2.3 HPD-2對苯并[a]芘的降解特性分析
無機鹽液體培養基中B[a]P的濃度隨時間的變化情況如圖5所示。由圖可知，B[a]P 的濃度從培養初期即開始下降，第24 h至48 h降低得最快，48h后下降的速度減緩，與 該菌的生長曲線呈現一定的對應關系。與培養初期相比，第120 h時加HPD-2的處理中 B[a]P的降解率達89.7。/0。
2.4 HPD-2對芘和熒蒽的降解特性
圖6所示的是HPD-2培養7天后對PYR和FA的降解情況。從圖中可以看出，PYR 和FA的濃度均明顯低于對照，而且FA比PYR降j氐得更多。表明該菌對PYR和FA都有 一定的降解能力，且對FA的降解能力更強，它們降解率分別為47.2%和84.5%。本研究 中利用B[a]P生長的HPD-2仍然對PYR和FA表現出了較好的降解能力。
實施例2:謹氨副球菌(戶amoicc附a附/"owra/is HPD-2 CGMCC No. 2568 )的土壤
修復效應
1.1供試土壤
采自長江三角洲某地多環芳烴污染土壤。土壤的基本理化性質為pH 6.4, 有機質 19.2g/kg,堿解氮1.0g/kg，全磷0.5g/kg，有效鉀14.2g/kg，陽離子交換量21.5cmol/kg。 9種EPA定為優先污染物的PAHs的總量達10.78 mg/kg。其中，四環、五環PAHs的含 量分別占總量的71.8%和23.0%，說明該土壤中的PAHs主要由高分子量PAHs組成。新 鮮土壤樣品過2mm篩后，于暗處4。C保存。
1.2培養類型
①牛肉膏蛋白胨培養基；②無機鹽培養基(MS):每升含K2HPO4 6.0g， KH2P04 5.5 g， Na2SO42.0g， KC12.0g, NH4N03 2.0 g, MgS04.7H20 0.2 g,微量元素溶液1.0mL, pH7.0-7.2;③含PAHs的無機鹽培養基以DMF配制1000 mg/L的不同PAHs (B[a]P, PYR, FA)溶液，按適當的濃度加入上述配方的滅菌無機鹽培養基。
1.3供試菌抹
喧氨副3求菌尸aracocc^ flrm/"owrara HPD隱2 CGMCC No. 2568。
在無菌條件下將菌林HPD-2接種于含有50.0 mg/L苯并[a]芘的無機鹽液體培養基中， 28。C下200r/min振蕩培養至對數生長期，離心后收集菌體，并用磷酸鹽緩沖液洗滌3次， 再用磷酸鹽緩沖液將菌液調節吸光度(OD60())至適當濃度備用，含菌量為6.2x106 CFU/mL
1.5 PAHs污染土i裏的生物i多復試驗
稱取1000gPAHs污染土壤，加入200mLHPD-2菌液，混合均勻。以加入等量滅活 菌液的處理作為對照(CK),每個處理設3個重復。將土壤水分保持在田間持水量的60 %,于28。C下避光培養。在第O、 7、 14d取樣，土壤樣品4。C冷凍保存。1.6 土壤中PAHs的分析
稱取2.0g風干土樣于索氏管中，向茄形瓶中加入二氯曱烷70mL，索氏抽提24h。 取出后控制水溫為36。C的旋轉蒸發器中旋轉濃縮至干，然后加入2.0 mL環已烷對茄形 瓶中物質進行溶解。另稱1.0 g經400。C下處理4 h的干燥硅膠于小燒杯中，加10 mL 正已烷浸泡15min,然后裝硅膠柱。吸取茄形瓶中環已烷溶解液0.5 mL過柱。用1:1正 已烷和二氯曱烷混合液進行洗脫，首次l.OmL洗脫液棄去，再接2mL洗脫液于刻度 試管中，用高純氮氣吹干。加2.0mL乙腈溶解，用Class-VP5XShimadzuHPLC測定 (錢薇等，2007 )。流動相為乙腈/水(60: 40 )。液相色譜為日本島津Class-vp高效液 相色譜分析系統，配熒光檢測器RF-10AXL，柱溫箱OTO-10ASVP, 二元梯度泵LC-10AT， 色i普分離柱為美國Varian公司的ChromSpher 5 PAH。 2.1 土壤中PAHs的動態變化
微生物能夠利用或P條解的污染物越多，在生物修復中的利用價值就越大，因此微生物 的降解底物譜是生物修復時選擇微生物的重要因素。圖7所示的是在生物修復過程中土壤 中各PAHs組分含量隨時間的變化。從中可以看出，截至第14 d，所有加菌的處理中各 PAHs組分的濃度均明顯低于對照土壤(PO.05 )，降解率均在19.5%~36.2%之間，其中最 高的是菲(36.2% )、蒽(35.4% )和苯并[a]芘(32.2% )。
從多環芳烴的環數看(圖8),加菌處理中三環PAHs的降解率最高(36.1%),五環 次之(26.0% )，西環的最低(20,9% )， PAHs的總去除率為22.9%。
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權利要求
1、一種噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)HPD-2，該菌株已在國家知識產權局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2008年7月3日，保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No.2568。
2、 根據權利要求1所述的噬氨副球菌(尸aracoccRsa附i"ovora"s) HPD-2,該菌 林在降解高分子量多環芳烴污染土壤中的應用。
3、 根據權利要求1所述的噬氨副球菌(戶ar"cocci^a附z'"ovora朋)HPD-2,該菌 抹在降解苯并[a]芘、芘或熒蒽污染土壤中的應用。
4、 一種權利要求1所述的噬氨副球菌(戶flracoccM )HPD-2的培養 基，其特征在于組成為K2HPO46.0g， KH2P045.5g， Na2SO42.0g， KC12.0 g, NH4NO32.0g, MgS04.7H20 0.2 g，微量元素溶液1.0mL,高分子量多環 芳烴3mg或50mg,該培養基pH 7.0-7.2。
5 、 根據權利要求4所述的噬氨副球菌(尸aracocciw "附/"ovorara) HPD-2的培養 基，其特征在于所述高分子量多環芳烴為苯并[a]芘、芘或熒蒽。
全文摘要
一種噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)HPD-2，該菌株已在國家知識產權局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2008年7月3日，保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No.2568。該降解菌具有較廣的底物譜，對環境中的PAHs有很好的降解能力。
文檔編號C12N1/20GK101348773SQ20081002233
公開日2009年1月21日 申請日期2008年7月18日 優先權日2008年7月18日
發明者李振高, 健 毛, 應 滕, 駱永明 申請人:中國科學院南京土壤研究所