專(zhuān)利名稱：青藤堿衍生物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于高分子化合物技術(shù)領(lǐng)域，涉及青藤堿的衍生物，具體為青藤堿衍生物及 其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
青藤堿(sinomeiiine)是從防己科植物青風(fēng)藤及毛青藤的根莖中提取的臨床上被應(yīng) 用于治療風(fēng)濕和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)腫脹等疾病的最有效的生物堿類(lèi)藥物，具有顯著的 抗炎、鎮(zhèn)痛、降壓及抗腦缺血等藥理作用。通過(guò)對(duì)青藤堿的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，尋找結(jié)構(gòu)新穎的、活性更高效的青藤堿衍生物是目 前的研究熱點(diǎn)，而對(duì)青藤堿C環(huán)的結(jié)構(gòu)改造更是研究重點(diǎn)。姚祝軍(OV.7份707創(chuàng)， CAC/儲(chǔ)7郎54)合成出C環(huán)連接有吡嗪環(huán)和五元雜環(huán)的青藤堿衍生物。葉仙蓉等(^"學(xué) 學(xué)叛，W似，WG人7卵—/幼)對(duì)青藤堿C環(huán)進(jìn)行了修飾得到了系列化合物，并采用 小鼠醋酸扭體法進(jìn)行動(dòng)物活性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)化合物7—甲氧基一二氫青藤堿鎮(zhèn)痛活性優(yōu)于 青藤堿。CV.7《^ 7^^同樣對(duì)青藤堿C環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾并得到一系列衍生物，該衍生物 具有較強(qiáng)的抗炎鎮(zhèn)痛活性，可用于制備治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及心率失常方面的藥物。青藤堿結(jié)構(gòu)改造同樣發(fā)生在D環(huán)，專(zhuān)利CAC 77S597fi4、 JZ9朋;T^和CW鄰2^ 別 分別報(bào)道了一類(lèi)N—烴基青藤堿及其制備方法， 一類(lèi)17—磺酰基青藤堿及其制備方法以 及一類(lèi)具有右旋C環(huán)缺失嗎啡喃骨架的青藤堿化合物及制法。最新的研究出現(xiàn)在對(duì)青藤堿A環(huán)l一位碳的修飾，7P^9i^W合成了一類(lèi)l一取 代胺甲基青藤堿衍生物，專(zhuān)利/S7MW在A環(huán)1位分別引入醛基及羥乙基。縱觀上述文獻(xiàn)，對(duì)青藤堿的結(jié)構(gòu)改造主要集中在C、 D環(huán)，新的青藤堿衍生物還有 待研究發(fā)現(xiàn)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的問(wèn)題是通過(guò)對(duì)青藤堿的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，得到結(jié)構(gòu)新穎的、抗炎活 性更高效的青藤堿衍生物。本發(fā)明的技術(shù)方案是青藤堿衍生物，青藤堿結(jié)構(gòu)式如下-<formula>formula see original document page 9</formula>在青藤堿A環(huán)、C環(huán)和D環(huán)通過(guò)化學(xué)合成后得到青藤堿衍生物，包括: 1)通過(guò)硝化還原在1位得到氨基連接取代基的青藤堿衍生物Sl-S5:<formula>formula see original document page 9</formula>2)或通過(guò)4位羥基或1位氨基形成的兩分子青藤堿加合物S6-S8:<formula>formula see original document page 9</formula>3)或在3， 4位連接有吡嗪環(huán)的青藤堿衍生物S9-S14:<formula>formula see original document page 9</formula>4)或在6位通過(guò)氨基/羥基連接取代基的青藤堿衍生物S15-S22:<formula>formula see original document page 0</formula>R1= H, R2= S02R3其中R3= CH3; Ph; 2-OH-3,5《l2C6H2; 2,4"Cl2-5"COOHC6H2等。或者R1= H. R2= COR3其中Ph; 4-C"C6H4; 3,4"ClrC6H3; 4-CH3-C6H4; 4-0<^3-<;61^等。或者R尸H, R2= "COC(R3)NHR4其中R3=CH3, PhCH2, (CH3)2CHCH2; CH3SCH2CH^， R4= H; S02Ph; CONHC6H5等o5)或在6， 7位通過(guò)氨基形成吡嗪環(huán)的雙青藤堿分子衍生物S23-S24:S23 S246)或?qū)η嗵賶AD環(huán)開(kāi)環(huán)后末端氨基進(jìn)行改造的衍生物S25-S26:H或CH3， R2= S02R3其中R3= CH3; Ph; 2-OH-3,5-CI2C6H2; 2,4-012-5-000^061"12等。或者R產(chǎn)H或CH3， R2= COR3其中R3= Ph; 4-CI-C6H4; 3,4-ClrC6H3; 4-CHrC6H4; 4-00143"0^4等。或者R1= H或CH3, R2= -COC(R3)NHR4其中R3=CH3， PhCH2， (CH3)2CHCH2; CH3SCH2CH2等， R4- H; S02Ph; CONHC6H#。7)或在青藤堿A環(huán)1位以C-C或者C-0方式連接形成的青藤堿衍生物S32-S34:<formula>formula see original document page 11</formula>(V CI, Br, OMe, C02Me，CHO, CH2C02CH4, CH2CN, NHCOCF3， CH3， COPh, NH2, CN, CF3， CH(OH)COOH等; R2=R3= OH, NH2， N02,或者R2= OH, R3= OCH3, N02, CI, Br, CH3等，R4-R5= H; R3=R5=N02, R2=R4=H本發(fā)明青藤堿衍生物的制備方法如下通過(guò)1位氨基化及其酰基化制備青藤堿衍生物SI-S5，化學(xué)式<formula>formula see original document page 11</formula>或者R，- H, R2= COR3其中R3= Ph; ^CI-CeHU; 3,4"ClrC6H3; 4-CH3-C6H4: 4-OCHrCeH4等。 或者R1= h, R2=《OC(R3)NHR4其中R3-CH3, PhCH2, (CH3)2CHCH2; ch3sch2ch2等，R4= H; S02Ph; CONHCeHs等。通過(guò)4位羥基或1位氨基連接兩分子青藤堿加合制備青藤堿衍生物S6-S8，化學(xué)式:<formula>formula see original document page 11</formula>通過(guò)3， 4位雙羰基化及六元氮雜環(huán)化制備青藤堿衍生物S9-S14，化學(xué)式:Sinomen'me S9 S10 S"Zn/Hg,con HCIR3,R4,R5,Re= H, Cw4的飽和及不飽和垸基'F, CI, Br, I, OH, NH2, OCH3, OC2H5, N02, CN, CF3, COOCH3, COPh， COOH, Ph為苯基。通過(guò)6位氨基化及其酰基化制備青藤堿衍生物S15-S22，通過(guò)6， 7位同時(shí)氨基化及 六元氮雜環(huán)化制備青藤堿衍生物S23-S24,化學(xué)式R1= H, R2= S02R3其中R3=CH3; Ph; 2-OH-3,5-CI2C6H2; 2,4-Cl2"5-COOHC6H2等。或者H, R2= COR3其中R3= Ph; 4-CI-CeH4; 3,4"ClrC6H3; 4-CH3-C6H4; 4"OCH3"CsH4等。或者Ri= H, R2= ^COC(R3)NHR4其中R3=CH3, PhCH2, <CH3)2CHCH2; CH3SCH2CH2等，F(xiàn)U= H; S02Ph; CONHCeH5等。制備青藤堿衍生物S25-S26的化學(xué)式如下，S27—S31為中間化合產(chǎn)物:S29 S30 S31 S26H或CH;j, R2= S02R3其中R3= CH3; Ph; 2"OH-3,5"CI2C6H2; 2.4-Cl2"&COOHC6H2等。或者H或CH3, R2= COR3其中R3= Ph; 4-CI-C6H4; 3,4"Cl2"CeH3; 4"CH3"CeH4; 4"OCH;rC6H4等。或者R1= H或CH3， R2=國(guó)COC(R3)NHR4其中R3=CH3, PhCH2, (CH3)2CHCH2; 0133(:^120^12等,1^4- H; S02Ph; CONHCeH5等。 制備青藤堿衍生物S32-S34的方法包括(1):微生物/酶催化多底物交叉偶聯(lián)，(2):Suzuki芳基交叉偶聯(lián)；通過(guò)微生物/酶催化多底物交叉偶聯(lián)制備，其制備步驟如下1) 菌株分離野外采取特定生境，稀釋涂布分離，選擇性篩選，菌種斜面0'C保藏； 轉(zhuǎn)化粗酶來(lái)自上述菌株，粗酶的分離采用蛋白質(zhì)鹽析分離方法，其余使用的酶購(gòu)自Sigma;2) 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的制備活化7天的斜面菌種，轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在 25。C，150r/rain的搖床上培養(yǎng)4天，加入青藤堿鹽酸鹽，終濃度《400 n g/ml，同樣條件 下繼續(xù)培養(yǎng)1天后加入第二種底物，終濃度《400ug/ml，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4天， 停止培養(yǎng)；將發(fā)酵液過(guò)濾，濾液用NH40H調(diào)節(jié)pH值8 9，用二氯甲烷多次萃取，合并 二氯甲垸萃取液，無(wú)水NaS(X干燥，過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；3) 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離采用填充的層析柱為硅膠柱，層析液為100:0 50:50V/V 氯仿一甲醇混合液；通過(guò)Suzuki芳基交叉偶聯(lián)反應(yīng)制備，其制備步驟如下將l-溴代青藤堿(0.5mmol)、芳基硼酸(0.7mmol)、 Pd(OAc)2 (3mol%)、 DABCO (6mol%)和K2C03 U.5mmo1)組成的混合物，懸浮于3ml的DMF中，8(TC下攪拌反 應(yīng)，TLC檢測(cè)反應(yīng)完畢后，過(guò)濾，萃取，干燥，柱分離得產(chǎn)物。通過(guò)微生物/酶催化多底物交叉偶聯(lián)的制備步驟1)中的生物轉(zhuǎn)化菌株或者酶包括 霉菌菌株爿/ tiWie77a se/M'51,./73及其同屬菌株、單色云芝Corio7〃s i/77icoJor及其 同屬菌株、過(guò)氧化物酶、脂肪酶、漆酶、水解酶、纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶。本發(fā)明針對(duì)青藤堿分子結(jié)構(gòu)對(duì)酸堿熱不穩(wěn)定的性質(zhì)，提出創(chuàng)新性的結(jié)構(gòu)改造思路， 通過(guò)化學(xué)合成制備了新的青藤堿A環(huán)、C環(huán)和D環(huán)青藤堿衍生物，方法新穎，具有獨(dú)特 性；采用滑膜腫瘤細(xì)胞(SW982)評(píng)價(jià)其抗炎活性，生物活性良好，可應(yīng)用于抗類(lèi)風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎(RA)藥物和保健品中。


圖1為本發(fā)明青藤堿衍生物采用滑膜腫瘤細(xì)胞(SW982)評(píng)價(jià)其抗炎活性的測(cè)試結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。 實(shí)施例11,10位氮硫六元雜環(huán)的合成H3CO、 H3CO、H3CO1 2如上述化學(xué)式，稱取化合物h l—氨基青藤堿550 mg (1.6mrno1)，加入4.0mlKSCN(632 mg， 2.4mmo1)的冰醋酸溶液中，攪拌溶解后緩慢滴加Br2 (96mg,0.6 mmol) 的冰醋酸溶液1.5 ml。室溫?cái)嚢?4h,冰浴下滴加10XNaOH進(jìn)行淬滅，調(diào)節(jié)pH值至 8.0，用CHCl3萃取，得到的有機(jī)層用飽和食鹽水水洗，再由無(wú)水NaS04干燥，減壓濃 縮，硅膠柱分離(CH3C1:CH30H=9:1)，得相應(yīng)化合物2，產(chǎn)率59%。 化合物2:NMR (300 MHz， CDC13) 5 ppm 8.45(s， 1H)， 7.35(s, 1H), 6.30(s, 1H), 5.85(s， 1H， OH), 5.50(s, 1H), 4.24(d, 1H, J=15.9 Hz)， 3.82(s, 3H), 3.29(m， 4H), 3.08(s, 1H)， 2.56(m， 1H)，2.44(s, 3H)， 2.40(s， 1H)， 2.07-1.90(m， 4H).13C麗R (300 MHz, CDC13) S 192.50， 178.92, 151.72, 146.90， 141.90, 128.05, 120.68: 114.55, 111.58， 95.68， 59.90, 56.18, 54.99,49.09,46.64， 45.48， 44.69, 42.77， 40.90， 35.80.實(shí)施例21位氨基磺酰化反應(yīng)如上述化學(xué)式，稱取化合物l: 1—氨基青藤堿550mg (1.6mmol)，溶于3mlCH2Cl2 ， 滴加Et3N0.34ml (2.5mmo1)，冰浴下加入對(duì)甲基苯磺酰氯381mg (2.0 mmol)，冰浴下 攪拌5h。倒入30mlCH2Cl2中萃取，有機(jī)層用用飽和食鹽水水洗，再用無(wú)水NaS04干 燥，減壓濃縮，硅膠柱分離(CH3C1:CH30H=9:1)，得相應(yīng)化合物3，產(chǎn)率52%。 化合物3:NMR (300 MHz, CDC13) S ppm 7.58(d， 2H, J=6.6 Hz)， 7.25(d， 2H, J=6.6 Hz), 6.39(s, 1H), 5.85(s, 1H， OH)， 5.39(s， IH)， 4.30(d, 1H, J=15.9 Hz), 3.85(s， 1H), 3.62(s, 3H)， 3.47(s， 3H)， 3.20(brd, 1H)， 3.01(brd, IH)， 2.78(m， 1H), 2.59-2.44(brd, 1H), 2.40(s， 3H), 2.36(s, 1H), 2.19(brd， 3H), 2.03-1.82(m， 4H).13C NMR (300 MHz， CDC13) S 193.50, 152.66, 144.80， 143.81， 129.80, 129.71， 127.41, 126.98， 126.90,123.93,114.09,108.15, 63.20, 60.93, 56.18， 55.89， 54.89， 48.92, 46.71， 42.22, 40.46, 35.43.實(shí)施例31位氨基酰化反應(yīng)如上述化學(xué)式，稱取化合物l: l一氨基青藤堿550mg (1.6mmol),溶于3 ml CH2C12 ， 滴加EbN 0.34 ml (2.5 mmol)，冰浴下加入苯甲酰氯313mg (2.0 mmol)，冰浴下攪拌 5h。倒入30mlCH2Cl2中萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水水洗，再用無(wú)水NaS04干燥，減 壓濃縮，硅膠柱分離(CH3C1:CH30H=9:1)，得相應(yīng)化合物4，產(chǎn)率73%。 化合物4:NMR (300 MHz, CDC13) 5 ppm 7.95(d, 2H, J=7.2 Hz), 7.54(d, IH, J=9.3 Hz), 7.53(dd, 2H: J=7.2， 9.3 Hz), 6.93(s, IH), 5.49(s， IH)， 4.39(s, 1H， J=15.9 Hz), 3.82(s, 3H)， 3.61(brd, IH), 3.51(s， 3H), 3.40(brd, IH)， 3.10-2.90(m， 4H)， 2.65(s, 3H), 2.55-2.48(m, 2H)， 2.21-2.05(m， 2H).13C NMR (300 MHz, CDC13) 5 193.63， 152.68, 145.79， 143.77， 134.17, 132.14， 128.80, 127.45, 126.03， 123.55, 121.34， 113.03， 108.84， 57.38, 56.20, 55.07， 49.97, 49.70， 49.41， 49.13， 48.01,47.56， 43.15, 41.54， 39.69, 33.83.實(shí)施例4通過(guò)4一OH形成兩分子青藤堿加合物稱取青藤堿(sinomenine) 329mg (lmmol)，溶于25 ml CH2C12 ，滴加Et3N 1.1 ml (8 mmol)，冰浴下加入戊二酰氯169mg (lmmol)，冰浴下攪拌5h。倒入30mlCH2Cl2中 萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水水洗，無(wú)水NaS04干燥，減壓濃縮,硅膠柱分離(CH3C1:CH30H =15:1),得相應(yīng)化合物5，產(chǎn)率72%。 化合物5:lH NMR (300 MHz, CDC13) S ppm 6.91(d， IH, J=9 Hz)， 6.76(d， IH, J=9 Hz), 5.44(s, IH)， 5.28(s, 1H， OH)， 3.82(d， 1H， J=15 Hz)， 3.74(s， 3H)， 3.46(s， 3H), 3.27(s， IH)， 3.10-3.01(m， 2H)， 2.89-2.70(m， 3H)， 2.6(d， IH, J=12 Hz), 2.54(s， IH), 2.47(s, 3H)， 2.18(td， IH, J=6, 12 Hz), 2.24-2.13(m， 1H)， 1.95(td, IH, J=6,12 Hz)， 1.6(d， IH, J=12 Hz). 13C NMR (300 MHz, CDC13) S 192.18， 172.14， 152.56, 149.98, 139.59, 129.73, 129.03，125.59, 114.34, 110.98, 56.73, 56.02， 54.97, 49.92, 46.88, 45.36, 42.53， 40.46, 36.80, 33.29: 24.35， 20.18.實(shí)施例56位氨基磺酰化反應(yīng)如上述化學(xué)式，稱取化合物6: 6—氨基一7， 8 二氫青藤堿260 mg (0.78mmo1)，溶于 20mlCH2Cl2 ，滴加Et3N0.16ml (U7mmo1)，冰浴下加入對(duì)甲苯磺酰氯179mg (0.94 mmol)，冰浴下攪拌6h。倒入30 ml CH2C12中萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水水洗，無(wú)水 NaS04干燥，減壓濃縮，硅膠柱分離(CH3C1:CH30H =9:1)，得相應(yīng)化合物7，產(chǎn)率 98%。NMR (300 MHz， CDC13) S卯m 7.62(d, 2H， J=6.0 Hz), 7.23(d, 2H, J=6.0 Hz)， 6.71(d， 1H， J-9.0 Hz)， 6.60(d, 1H, J=9.0 Hz)， 4.1 l(d， 1H， J-9.0 Hz), 3.86(brd， IH)， 3.84(s, 3H)， 3.77(dd， 1H, J=3.0， 15.0 Hz), 3.27(s, 1H)， 3.20(dd, 1H， J-3.0, 12.0 Hz), 2.92(s, 3H), 2.86(s， 1H), 2.77-2.67(m， IH)， 2.48-2.39(m， IH)， 2.36(s， 3H)， 2.34(s， 3H)， 1.97(dt， 1H， J=6.0， 12.0 Hz)， 1.81(dt， 1H, J=6.0， 12.0 Hz)， 1.59-1.47(m， 2H),1.37(d， 1H， J=12.0 Hz)， 1.28(d， 1H, J=12.0 Hz).13C NMR (300 MHz, CDC13) S 145.21， 144.63， 142.60, 138.86, 129.52， 129.16， 127.03， 126.96， 124.13,119.34， 109.91， 79.13, 57.41, 56.52, 55.85, 51.03, 47.28, 44.12， 42.29, 37.50， 37.32， 35.20， 32.50， 28.79， 23.86, 21.52.實(shí)施例66位氨基酰化反應(yīng)化合物7:如上述化學(xué)式，稱取化合物6: 6—氨基一7， 8 二氫青藤堿150 mg (0.45mmo1)，溶于 10 ml CH2C12 ，滴加Et3N 0.1 ml (0.68 mmol)，冰浴下加入苯甲酰氯62pL (0.54 mmol)， 冰浴下攪拌6h。倒入30mlCH2Cl2中萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水水洗，無(wú)水NaS04干 燥，減壓濃縮，硅膠柱分離(CH3C1:CH30H=9:1)，得相應(yīng)化合物8，產(chǎn)率90%。 化合物8:!H NMR (300 MHz， CDC13) 3 ppm 7.62-7.24(m, 5H), 6.76(d， 1H, J:9.0 Hz)， 6.67(d, 1H， 7=9.0 Hz)， 5.92(d, 1H， J-9.0 Hz), 4.94-4.90(m, 1H)， 4.03(dd， 1H, 7=3.0, 15.0 Hz), 3.59陽(yáng)3.53(m, 1H), 3.51(s, 1H), 3.38(s, 1H)， 3.07-2.85(m， 3H), 2.58-2.53(m, 1H), 2.45(s, 3H), 2.10-1.95(m， 3H)， 1.98(d， 1H， J^2.0 Hz)， 1.67-1.58(m， 2H), 1.43(dd， 1H， 《/=15.0， 3.0 Hz)， 1.31(t， lH,6.0Hz).13CNMR (300 MHz， CDC13) (5166.51， 144.90, 144.87， 134.47, 130.98, 130.31， 127.99(2C), 126.89(2C), 125.07， 119.26， 108.66, 78.86， 57.50, 56.12， 55.57， 47.44, 46.13， 44.50， 42.56， 37.88， 36.82, 35.60， 29.75,24.05.實(shí)施例7 6位羥基還原稱取青藤堿(sinomenine) 3.6g溶于30ml甲醇，冰浴下緩慢分批加入10g NaBH4，反 應(yīng)24h，冰浴下滴加丙酮終止反應(yīng)，減壓濃縮成固體，加入稀HC1溶解，濃氨水調(diào)節(jié)pH 值至9.0，用CH2C12 (50ml)進(jìn)行3次萃取，有機(jī)層用用飽和食鹽水水洗，無(wú)水NaS04 干燥，減壓濃縮，硅膠柱分離(CH3C1:CH30H=15:1)，得化合物9，產(chǎn)率55%，以及化合物IO，產(chǎn)率30%。化合物9:JH NMR (300 MHz, CDC13) S ppm 6.65(s， 1H， J=9.0 Hz), 6.57(s, IH, J=9.0 Hz)， 5.29(s, 1H， OH)， 4.49(s， IH), 4.17(d, 1H， J=6.0 Hz)， 3.80(s, 3H), 3.68(d, 1H， J=15.0 Hz)， 3.48(s, 3H)， 3.03(s, IH)， 2.90(d, 1H， J-18.0 Hz), 2.75(dd， IH, J=6.0,18.0 Hz), 2.50(brd, 2H), 2.40(s, 3H)， 2.01(td, IH, J=3.0, 12.0 Hz)， L89(d, IH, J=12.0 Hz), 1.72(dd， 1H， J=3.0， 15.0 Hz), 1.63(dd: 1H， J=6.0,15.0 Hz).13C NMR (300 MHz, CDC13) S 156.68, 144.87, 144.44, 131.32, 125.28， 119.04, 108.90, 97.23, 66.95， 57.94, 56.19， 54.47, 48.10， 45.36， 42.78， 40.07, 36.68, 34.40， 24.61.化合物10:iHNMR (300 MHz, CDC13) 5 ppm 6.62(d, IH, J=9.0 Hz), 6.53(d， 1H， J=9.0 Hz)， 4.39(s， IH)， 4.20-4.26(m， IH), 3.83(s, 3H), 3.66(dd, IH, J=6.0， 12.0 Hz), 3.44(s, 3H), 3.01(s, IH), 2.89(d, IH, J=12.0 Hz), 2.75-2.67(m， 2H)， 2.53(d， IH, J=3.0 Hz)， 2.41(s， 3H), 2.06(td， IH, J=3.0, 12.0 Hz)， 1.82-1.74(m, 2H), 1.59(t, 1H， J=12.0 Hz).13C NMR (300 MHz， CDC13) S 156.53, 144.63(2C)， 131.47， 124.52, 118.21， 108.21, 96.62: 66.95， 57.46, 56.21, 54.48,47.86,45.36,42.84,41.13, 37.42, 36.05, 24.13,實(shí)施例8青藤堿A環(huán)1位以C-C或者C-0方式連接形成青藤堿衍生物:采用普通微生物分離方法從特定生境中分離得到青藤堿(sinomenine)轉(zhuǎn)化菌株霉菌 加加力W/a w附&"/ /"a。活化7天的斜面菌種，轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25""C,150r/min 的搖床上培養(yǎng)4天，加入青藤堿鹽酸鹽，終濃度^400^ig/ml，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)1天 后加入第二種底物愈創(chuàng)木酚，終濃度5400pg/ml，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4天，停止培養(yǎng)； 將發(fā)酵液過(guò)濾，濾液用NH4OH，調(diào)節(jié)pH值到8 9，用二氯甲烷多次萃取，合并二氯 甲烷萃取液，無(wú)水NaS04干燥，過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，采用填充的層析柱 為硅膠柱，層析液為100:0 50:50 V/V氯仿一甲醇混合液。分離得化合物11，產(chǎn)率13 %，以及化合物12，產(chǎn)率5%。化合物11:& NMR (300 MHz, CDC13) S ppm 6.94 (d， 1H， J = 8.4 Hz), 6.68 (brs， IH), 6.67 (dd，lH， J = 8.4， 1.8 Hz), 6.56 (s, IH), 5.46 (d, IH, J = 1.9 Hz), 4.42 (d, 1H， J = 15.6 Hz), 3.89 (s, IH), 3.80 (s, 3H)， 3.52 (s, 3H)， 3.12 (brt, J = 4.0 Hz), 3.01 (dd, 1H， J = 4.0， 1.9 Hz)， 2.75 (brd， 1H， J = 18.6 Hz), 2.75 (dd， 1H， J = 18. 6,4.0 Hz), 2.57 (ddd, IH, J = 12.2， 4.4, 1.5Hz), 2.49 (d， 1H， J = 15.6 Hz)， 2.31 (s, 3H)， 2.10 (td, J = 12.2， 3.2 Hz), 2.02 (dt, IH, J = 12.4, 3.2 Hz), 1.89 (td, 1H， J= 12.4， 4.4 Hz).13C NMR (300 MHz, CDC13) S 194.2, 152.3， 143.8, 146.3， 144.6, 144.5， 134.3, 131.8, 127.7, 122.5， 121.9, 115.2， 114.3, 111.7, 111.0, 56.6, 56.0， 55.9， 54.9, 49.1, 47.4, 45.6， 43.8， 40.8, 35.8， 23.4. 化合物12:& NMR (300 MHz, CDC13) 5 ppm 7.00-6.96 (overlapped, 2H)， 6.75 (m， IH), 6.44 (s, IH)， 6.36 (dd, 1H， J = 8.5， 1.1 Hz)， 5.39 (d, 1H， J = 1.8 Hz), 4.37 (d, IH, J = 15.7 Hz), 3.95 (s， 3H)， 3.73 (s，3H), 3.49 (s， 3H)， 3.19 (brt， 1H， J = 5.8 Hz)， 3.03 (brd, 1H， J = 5.8 Hz), 3.00 (d， 1H， J =18.5Hz)， 2.58 (ddd， 1H, J = 12.0， 4.4， 1.8 Hz)， 2.47 (d， 1H， J = 15.7 Hz)， 2.36 (s， 3H), 2.36 (dd, 1H, J = 18.5, 5.8 Hz)， 2.14 (td, 1H， J = 12.0, 3.4 Hz), 2.00 (dt， 1H, J =12.4， 3.4 Hz)， 1.93 (td, 1H， J = 12.4， 4.4 Hz).13C畫(huà)R (300 MHz， CDC13) S 193.7, 152.4, 149.1， 147.5(2C), 141.7， 144.1, 122.3, 120.7, 114.8， 114.6, 123.4， 122.5, 112.2, 103.1， 56.1， 56.0, 55.8, 54.8, 49.0， 47.0, 45.6， 42.7， 40.4， 35.6， 18.5.實(shí)施例9青藤堿A環(huán)1位以C-C方式連接形成的青藤堿衍生物:采用普通微生物分離方法從特定生境中分離得到青藤堿(sinomenine)轉(zhuǎn)化菌株霉菌 CoWo/"s wm'co/or。活化7天的斜面菌種，轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25°C,150r/min的搖 床上培養(yǎng)4天，加入青藤堿鹽酸鹽，終濃度^40(Hig/ml，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)1天后加入第二種底物鄰苯二酚，終濃度5400pg/ml，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4天，停止培養(yǎng)；將 發(fā)酵液過(guò)濾，濾液用NH4OH調(diào)節(jié)pH值至8 9，用二氯甲垸多次萃取，合并二氯甲烷 萃取液，無(wú)水NaS04干燥，過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，采用填充的層析柱為硅 膠柱，層析液為100:0 50:50V/V氯仿一甲醇混合液。分離得化合物13，產(chǎn)率15%。 化合物13:NMR (300 MHz, CDC13) S卯m 6.81(d， 1H, J = 9.0 Hz), 6.61(s， 1H), 6.52(s, 1H), 6.48(d, 1H, J = 9.0 Hz), 5.43(s, 1H), 4.37(d， 1H, J = 15.0 Hz), 3.74(s， 3H), 3.47(s， 3H), 3.38(brd， IH)， 2.75-2.53(m, 3H), 2.45(d, 1H, J = 15.0 Hz), 2.34(s, 3H), 2.21-2.13(m， 1H， )， 2.02-1.89(m, 3H).13C觀R (300 MHz， CDC13) S 194.53， 152.41， 144.97, 144.28, 143.76， 143.58, 133.97， 132.26， 126.06， 121.53, 120.83, 116.11, 115.09, 114.58， 111.53, 56.96, 56.00, 54.96, 47.52, 44.24， 42.05,40.40， 34.64， 29.72， 23.81.實(shí)施例10通過(guò)4位羥基形成兩分子青藤堿加合物<formula>formula see original document page 21</formula>sinomenine 14稱取青藤堿(sinomenine) 1.5g (4.56 mmol)，溶于20mlEtOH ，加入K2C03 3.15g (22.8 mmol)，滴加1，3-二溴丙烷232^L (2.28mmol)，回流5h。反應(yīng)完全后，用稀HCl調(diào)節(jié) pH值至3，攪拌10min，再用濃NKUOH調(diào)節(jié)pH值至8 9， 二氯甲垸多次萃取，合并 二氯甲垸萃取液，無(wú)水NaS04干燥，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，硅膠柱分離(CH3C1:CH30H-9:1)， 得相應(yīng)化合物14，產(chǎn)率53%。 化合物14:*H NMR (300 MHz, CDC13) S ppm 6.99-6.66(m， 2H), 5.46(s， IH)， 4.35-4.14(m, 3H)， 3.78(s, 3H), 3.47(s， 3H)， 3.16-3.14(m, 1H), 2.95-2.76(m, 2H), 2.72(dd， 1H， J = 6.0， 12.0 Hz)， 2.53-2.45(m， 3H), 2.41(s, 3H), 2.07隱1.87(m, 4H).13C NMR (300 MHz, CDC13) 5 193.71, 152.57， 151.53, 148.26， 130.02, 129.98, 122.54,115.28， 111.54， 69.69, 56.68， 55.90, 54.89, 50.01， 47.26, 46.18， 42.83, 40.91， 37.46， 31.55 24.65.實(shí)施例11對(duì)青藤堿D環(huán)開(kāi)環(huán)后末端氨基進(jìn)行改造稱取青藤堿(sinomenine) 1.5g (4.56mmoD，溶于200ml 15%NaOH溶液中，煮沸8min， 流水冷卻，用濃HCl調(diào)節(jié)pH值至4，再進(jìn)行過(guò)濾，濾液用濃NH4OH，使pH值調(diào)節(jié)至 8，用二氯甲烷多次萃取，合并二氯甲烷萃取液，用無(wú)水NaS04干燥，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑， 硅膠柱分離(CH3C1:CH30H=9:1)，得相應(yīng)化合物15,產(chǎn)率33%。 化合物15:'H NMR (300 MHz, CDC13) 5 ppm 6.73(d, 1H， J = 9.0 Hz)， 6.66(d, IH, J - 9.0 Hz), 6.0(s, 1H), 5.76(s， 1H), 4.23(dd, 1H, J = 18.0 Hz), 3.86(s, 3H), 3.70(s， 3H), 3.17-3.11(m, 2H)， 2.97(s， IH)， 2.84(dd， 1H, J = 6.0, 18.0 Hz)， 2.66(d， 1H， J = 18.0 Hz), 2.42(dd， 1H, J = 3.0, 12.0 Hz), 2.36(s, 3H)， 2.19(dt， 1H, J = 12.0,12.0, 3.0 Hz)， 2.06(dt， 1H， J = 12.0， 12.0， 3.0 Hz), 1.56(dd, IH,J- 12.0 Hz)13C NMR (300 MHz, CDC13) S 194.84, 151.21， 144.79， 143.85， 130.67， 127.08， 119.80, 118.77， 109.07, 58.10， 56.29, 54.97， 48.37， 47.26, 43.30， 42.09， 38.28， 28.25， 27.59.實(shí)施例12通過(guò)Suzuki芳基交叉偶聯(lián)反應(yīng)，制備在青藤堿A環(huán)1位以C-C或者C-0方式連接形 成的青藤堿衍生物S32—S34:<formula>formula see original document page 23</formula>其制備步驟如下-l-溴代青藤堿(0.5mmol)、芳基硼酸(0.7mmol)、 Pd(OAc)2 (3mol%)、 DABCO (6mol%)和K2C03 (1.5mmol)組成的混合物，懸浮于3ml的二甲基甲酰胺DMF中， 80'C下攪拌反應(yīng)，TLC檢測(cè)反應(yīng)完畢后，過(guò)濾，萃取，干燥，柱分離得產(chǎn)物。實(shí)施例13青藤堿衍生物的抗炎作用取滑膜腫瘤細(xì)胞SW982于24孔盤(pán)培養(yǎng)，培養(yǎng)密度lxl04/ 孔，24h后用L-15的完全培養(yǎng)基CGM (終濃度為10%胎牛血清，100U/ml的青霉素和 鏈霉素，2mM的L-谷胺酰胺，pH=7.40)置換培養(yǎng)液，CGM中以0.2%牛血清白蛋白 (BSA)替換胎牛血清(FBS)，再24h后，以lng/ml 1L-Ip的培養(yǎng)基置換培養(yǎng)液，培養(yǎng) 基含0.2%的BSA和終濃度分別為200nmol/L， 100pmol/L， 50pmol/L的測(cè)試藥物，即本 發(fā)明的青藤堿衍生物；繼續(xù)培養(yǎng)48h后，取細(xì)胞上清液，用Human IL-6試劑盒檢測(cè)， 結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖l可以看出，化合物13， 14在三種濃度下均對(duì)細(xì)胞炎癥因子IL-6表現(xiàn)出強(qiáng)的 抑制作用，化合物11在三種濃度下顯示了一定的抑制作用，化合物5， 7， 8在高濃度 下(200pM)對(duì)IL-6有一定的抑制作用，而化合3在低濃度下(5(HiM)有一定抑制作 用，化合物15則在中等濃度下(100pM)對(duì)IL-6有抑制作用。其他化合物，如4， 6 對(duì)IL-6有強(qiáng)的促進(jìn)作用，化合物10， 12也有一定的促進(jìn)作用。化合物9抑制作用基本 上與青藤堿持平。本發(fā)明實(shí)施例中使用的有機(jī)溶劑包括但不限于甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁 醇、異丁醇、叔丁醇、正戊醇、異戊醇、環(huán)己醇、卞醇、二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙 烷、四氯化碳、乙醚、四氫呋喃、苯、甲苯、二甲苯、丙酮、丁酮、乙氰、N，N-二甲基 甲酰胺、乙酸乙酯等。
權(quán)利要求
1. 青藤堿衍生物，青藤堿結(jié)構(gòu)式如下id="icf0001" file="S2008100240512C00011.gif" wi="46" he="39" top= "37" left = "87" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>其特征是在青藤堿A環(huán)、C環(huán)和D環(huán)通過(guò)化學(xué)合成后得到青藤堿衍生物，包括1)通過(guò)硝化還原在1位得到氨基連接取代基的青藤堿衍生物S1-S5id="icf0002" file="S2008100240512C00012.gif" wi="158" he="53" top= "97" left = "34" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>2)或通過(guò)4位羥基或1位氨基形成的兩分子青藤堿加合物S6-S8id="icf0003" file="S2008100240512C00013.gif" wi="160" he="23" top= "161" left = "34" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>3)或在3，4位連接有吡嗪環(huán)的青藤堿衍生物S9-S14id="icf0004" file="S2008100240512C00014.gif" wi="159" he="57" top= "196" left = "34" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>4)或在6位通過(guò)氨基/羥基連接取代基的青藤堿衍生物S15-S22id="icf0005" file="S2008100240512C00021.gif" wi="158" he="68" top= "21" left = "29" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>R1＝H，R2＝SO2R3其中R3＝CH3；Ph；2-OH-3，5-Cl2C6H2；2，4-Cl2-5-COOHC6H2等。或者R1＝H，R2＝COR3其中R3＝Ph；4-Cl-C6H4；3，4-Cl2-C6H3；4-CH3-C6H4；4-OCH3-C6H4等。或者R1＝H，R2＝-COC(R3)NHR4其中R3＝CH3，PhCH2，(CH3)2CHCH2；CH3SCH2CH2等，R4＝H；SO2Ph；CONHC6H5等。5)或在6，7位通過(guò)氨基形成吡嗪環(huán)的雙青藤堿分子衍生物S23-S24id="icf0006" file="S2008100240512C00022.gif" wi="96" he="41" top= "122" left = "27" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>6)或?qū)η嗵賶AD環(huán)開(kāi)環(huán)后末端氨基進(jìn)行改造的衍生物S25-S26id="icf0007" file="S2008100240512C00023.gif" wi="84" he="36" top= "175" left = "39" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>R1＝H或CH3，R2＝SO2R3其中R3＝CH3；Ph；2-OH-3，5-Cl2C6H2；2，4-Cl2-5-COOHC6H2等。或者R1＝H或CH3，R2＝COR3其中R3＝Ph；4-Cl-C6H4；3，4-Cl2-C6H3；4-CH3-C6H4；4-OCH3-C6H4等。或者R1＝H或CH3，R2＝-COC(R3)NHR4其中R3＝CH3，PhCH2，(CH3)2CHCH2；CH3SCH2CH2等，R4＝H；SO2Ph；CONHC6H5等。7)或在青藤堿A環(huán)1位以C-C或者C-O方式連接形成的青藤堿衍生物S32-S34id="icf0008" file="S2008100240512C00031.gif" wi="155" he="32" top= "22" left = "29" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>R1＝Cl，Br，OMe，CO2Me，CHO，CH2CO2CH4，CH2CN，NHCOCF3，CH3，COPh，NH2，CN，CF3，CH(OH)COOH等；R2＝R3＝OH，NH2，NO2，或者R2＝OH，R3＝OCH3，NO2，Cl，Br，CH3等，R4＝R5＝H；R3＝R5＝NO2，R2＝R4＝H 。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的青藤堿衍生物的制備方法，其特征是通過(guò)l位氨基化及 其酰基化制備青藤堿衍生物S1-S5，化學(xué)式如下R，= H, R2- S02R3其中R3= CH3: Ph; 2-OH^3.5"CI2C6H2: 2,4-Cl2"5"COOHCeH2等。或者R，= H， R2- COR3其中R3= Ph:傘CI-C6H4; 3.4-Cl2"CeH3:4-CH3~C6H4: 4-OCH3-CsH4等。或者H. r2= "COC(r3)nhr4其中r3=CH3. PhCH2， (CH3)2chch2: CH3SCH2CH2等，R4- H; SO^h; CONHCbH5等。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的青藤堿衍生物的制備方法，其特征是通過(guò)4位羥基或1 位氨基連接兩分子青藤堿加合制備青藤堿衍生物S6-S8，化學(xué)式如下<formula>formula see original document page 4</formula>
4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的青藤堿衍生物的制備方法，其特征是通過(guò)3， 4位雙羰基 化及六元氮雜環(huán)化制備青藤堿衍生物S9-S14，化學(xué)式如下<formula>formula see original document page 5</formula>R3,R4,R5,R6= H, Cw4的飽和及不飽和烷基，F(xiàn), CI, Br, I, OH, NH2, OCH3, OC2H5, N02, CN, CF3, COOCH3, COPh, COOH, Ph為苯基。
5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的青藤堿衍生物的制備方法，其特征是通過(guò)6位氨基化及其酰基化制備青藤堿衍生物S15-S22,通過(guò)6， 7位同時(shí)氨基化及六元氮雜環(huán)化制備青藤 堿衍生物S23-S24，化學(xué)式如下R，= H, R2= S02R3其中R3= CH3; Ph; 2-OH-3,5"CI2C6H2; 2,4"Cl2"5-COOHCeH2等。或者R產(chǎn)H, R2= COR3其中R3- Ph; 4-CI-CeH4; 3,4"Cl2"C6H3; 4-CH3-CsH4; 4-0(^3"061"14等。或者Ri= H, R2= "COC(R3)NHR4其中R3=CH3, PhCH2, (CH3〉2CHCH2; CH3SCH2CH2等，R4= H; S02Ph; CONHCeH5等。
6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的青藤堿衍生物的制備方法，其特征是制備青藤堿衍生物S25-S26的化學(xué)式如下，S27—S31為中間化合產(chǎn)物<formula>formula see original document page 6</formula>R，= H或CH3, R2= S02R3其中R3= CH3; Ph; 2-OH-3,5-CI2C6H2; 2,4-Cl2"5"COOHCeH2等。或者H或CH3, R2- COR3其中R3= Ph; 4-CI-C6H4; 3,4"ClrCeH3; 4-CH3"C6H4; 4"OCH3-CeH4等。或者R1= H或CH3， R2= "COC(R3)NHFU其中R3=CH3, PhCH2, (CH;3)2CHCH2; CH3SCH2CH2^4= H; S02Ph; CONHC6H^。
7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的青藤堿衍生物的制備方法，其特征是制備青藤堿衍生物S32-S34的方法包括(1)微生物/酶催化多底物交叉偶聯(lián)，(2) Suzuki芳基交叉偶聯(lián)； 通過(guò)微生物/酶催化多底物交叉偶聯(lián)制備，其制備步驟如下1) 菌株分離野外采取特定生境，稀釋涂布分離，選擇性篩選，菌種斜面0'C保藏； 轉(zhuǎn)化粗酶來(lái)自上述菌株，粗酶的分離采用蛋白質(zhì)鹽析分離方法，其余使用的酶購(gòu)自Sigma;2) 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的制備活化7天的斜面菌種，轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在 25'C，150r/rain的搖床上培養(yǎng)4天，加入青藤堿鹽酸鹽，終濃度《400" g/ml，同樣條件 下繼續(xù)培養(yǎng)1天后加入第二種底物，終濃度《400ug/ml，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4天， 停止培養(yǎng)；將發(fā)酵液過(guò)濾，濾液用NH40H調(diào)節(jié)pH值8 9,用二氯甲烷多次萃取，合并 二氯甲烷萃取液，無(wú)水NaS04干燥，過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；3) 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離采用填充的層析柱為硅膠柱，層析液為100:0 50:50V/V氯仿一甲醇混合液；通過(guò)Suzuki芳基交叉偶聯(lián)反應(yīng)制備，其制備步驟如下1-溴代青藤堿(0.5mmol)、芳基硼酸(0.7mmol)、 Pd(OAc)2 (3mol%)、 DABCO (6mol%)和K2C03 (1.5tmno1)組成的混合物，懸浮于3ml的二甲基甲酰胺DMF中， 80'C下攪拌反應(yīng)，TLC檢測(cè)反應(yīng)完畢后，過(guò)濾，萃取，干燥，柱分離得產(chǎn)物。
8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的青藤堿衍生物的制備方法，其特征是通過(guò)微生物/酶催化 多底物交叉偶聯(lián)的制備步驟1)中的生物轉(zhuǎn)化菌株或者酶包括霉菌菌株^7trooVW7a se則's^i朋及其同屬菌株、單色云芝Cor/W"s "/7ico or及其同屬菌株、過(guò)氧化物酶、 脂肪酶、漆酶、水解酶、纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶。
9、權(quán)利要求1所述的青藤堿衍生物在制備類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的抗炎藥物和保健品中 的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明針對(duì)青藤堿分子結(jié)構(gòu)對(duì)酸堿熱不穩(wěn)定的性質(zhì)，提出創(chuàng)新性的結(jié)構(gòu)改造思路，通過(guò)化學(xué)合成制備了新的青藤堿A環(huán)、C環(huán)和D環(huán)青藤堿衍生物，包括青藤堿1位氨基化及其酰基化，1位C-C或者C-O方式連接，3，4位雙羰基化及六元氮雜環(huán)化，4位羥基和1位氨基連接的兩分子青藤堿加合，6位氨基化及其酰基化，6，7位同時(shí)氨基化及六元N雜環(huán)化，D環(huán)開(kāi)環(huán)及其末端氨基修飾，方法新穎，具有獨(dú)特性；采用滑膜腫瘤細(xì)胞(SW982)評(píng)價(jià)其抗炎活性，生物活性良好，可應(yīng)用于抗類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)藥物和保健品中。
文檔編號(hào)C12P17/10GK101265266SQ20081002405
公開(kāi)日2008年9月17日 申請(qǐng)日期2008年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月23日
發(fā)明者珺 劉, 李建新, 鄧張雙 申請(qǐng)人:南京大學(xué)