專利名稱：鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質的制備方法
技術領域：
本發明屬于生物技術中色素蛋白質材料領域，具體涉及一種鏈霉親和素標記的結合PEB 藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質的制備方法。
背景技術：
藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍藻和紅藻光合作用捕光復合物的功能組分。根據其 吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱CPE)、藻紅 藍蛋白(phycoerythrocyanin，簡稱PEC)、藻藍蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和變藻藍蛋 白(allophycocyanin，簡稱APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含alpha和beta亞基，每個亞基 中藻膽色素(phycobilin)通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein)半 胱氨酸殘基的巰基共價結合，其種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜性質。 藻膽色素與脫輔基蛋白共價結合形成特定的構象，使得CPE主要吸收約560nm的可見光，發 射約580nm的熒光；PEC吸收約570nm的可見光，發射約630nm的熒光；CPC吸收約620nm的 可見光，發射約640nm的熒光；APC吸收約650 660nm的可見光，發射約660 670nm的熒 光。CPE結合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡稱PEB); PEC的alpha亞基結 合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡稱PVB); PEC的beta亞基結合的輔基色素 為藻藍膽素(phycocyanobilin，簡稱PCB); CPC和APC結合的輔基色素都為藻藍膽素PCB。
鏈霉親和素可以跟生物素特異結合，通過鏈霉親和素-生物素系統，可以實現信號放大作 用，提高檢測靈敏度。目前鏈霉親和素-生物素系統已經廣泛應用于生物學檢測和醫療檢測等 領域。目前主要是通過化學交聯實現鏈霉親和素對目標的標記。
CPC的alpha亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(Tooley A J， Cai Y A, Glazer A N. Biosynthesis of a fluorescent cyanobacterial C-phycocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(19) : 10560 10565)。我 們發現，藻藍蛋白alpha亞基裂合酶不僅可以催化PCB與藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白結 合，還能催化藻紅膽素PEB與藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白結合。通過基因工程技術，把 鏈霉親和素基因和藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于表達載體，可以在大腸 桿菌內表達得到鏈霉親和素和藻藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白的融合蛋白，直接實現鏈霉 親和素和藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的連接，而不需要通過化學交聯等方法來實現鏈霉 親和素標記；把藻藍蛋白alpha亞基裂合酶基因、PEB生物酶合成基因克隆于表達載體。利 用以上表達載體，通過基因工程菌，可以直接生成鏈霉親和素標記的結合PEB的藻藍蛋白 alpha亞基類熒光蛋白質。藻膽蛋白類熒光蛋白質可以應用于食品、化妝品、醫藥和生物工程領域。藻藍蛋白類熒 光蛋白質具有優良的熒光性質，通過直接實現鏈霉親和素和藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白 的連接，可用于生物學檢測以及醫療檢測領域。本發明為藻藍蛋白類色素蛋白質功能材料應 用于醫藥和生物工程領域，特別是檢測領域奠定了基礎。

發明內容
本發明的目的在于提供一種鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白alpha亞基類熒 光蛋白質的制備方法，它是應用藻藍蛋白alpha亞基裂合催化藻紅膽素(PEB)與鏈霉親和素標 記的藻藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白共價結合，制備鏈霉親和素標記的結合PEB的藻藍蛋 白alpha亞基類熒光蛋白質。將含有藻藍蛋白alpha亞基裂合酶基因、鏈霉親和素基因和藻 藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白基因拼接的基因、藻紅膽素生物合成酶基因的表達質粒依次 轉入宿主菌，得到相應的工程菌，通過這種方法得到的基因工程菌生產鏈霉親和素標記的結 合PEB的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質。
本發明的技術方案是這樣的 一種鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白alpha亞 基類熒光蛋白質的制備方法，包括下述步驟-
(1) 用基因工程方法，將alpha亞基裂合酶基因或其同源基因克隆于表達載體中，得到 alpha亞基裂合酶表達質粒；
(2) 用基因工程方法，將鏈霉親和素基因和藻藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白基因或其 同源基因克隆于第二個表達載體中，得到鏈霉親和素標記的脫輔基蛋白表達質粒；
(3) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因力o7和p^5或其同源基因克隆于第 三個表達載體中，得到力W和/ e6萬表達質粒；
(4) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因pe^或其同源基因克隆于第四個表 達載體中，得到pe^表達質粒；
(5) 將alpha亞基裂合酶表達質粒、鏈霉親和素標記的脫輔基蛋白表達質粒、力o7和peM 表達質粒及pe^表達質粒依次轉入配套的宿主菌，當這些表達質粒都轉入宿主菌后，得到相 應的工程菌，應用此工程菌通過發酵工程生產鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白 alpha亞基類熒光蛋白質；發酵后，按常規蛋白質提純技術，提純得到相應的鏈霉親和素標 記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質。
上述一種鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質的制備方 法中，所述的宿主菌為大腸桿菌；所述的alpha亞基裂合酶基因是指與^7a6ae"asp. PCC7120 中和c; cF基因或M 7a/w'"os"s sp. PCC7603中c/ cf和c/ c尸基因同源的基因；所述的藻 藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白基因是指與力朋&e朋sp. PCC7120或i/. 7a/w'/ os"s sp. PCC7603中cpc力同源的基因。本發明與現有技術相比，具有以下優點
1、 不使用藻類為原料而是利用大腸桿菌生產藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質，大腸桿 菌繁殖快，可以大大縮短周期；
2、 與藻類相比，大腸桿菌細胞壁容易破碎，純化過程中可節省能源；
3、 通過大腸桿菌生產，目標蛋白含量高，有His-tag標記，且體系中幾乎沒有性質類似 的蛋白，提取方便；
4、 生成結合PEB的新型藻藍蛋白alpha亞基類色素蛋白，具有與天然藻藍蛋白alpha亞 基類色素蛋白不同的光譜特性，為發展熒光藻膽蛋白類色素蛋白質功能材料提供更多選擇；
5、 產物中鏈霉親和素與熒光藻藍蛋白alpha亞基類色素蛋白質直接結合，不需額外進行 處理，有利于發展熒光藻膽蛋白類色素蛋白質在檢測領域的應用。


圖1為本發明中CpcE/CpcF催化下生成的鏈霉親和素標記的結合PEB藻藍蛋白alpha亞 基類熒光蛋白質的吸收光譜和熒光光譜。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步地詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。 實施例1
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種力朋6朋朋sp. PCC7120的全序列已經測定完 成，Ja/w'/ osiAS sp. PCC7603部分序列已經測定。^/7aZ ae;7a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019， ；(/. 7a/w'/ o幼s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254, 可從所査到序列中找到所需基因；C^"力rix sp. PCC7601已經部分測序，所用到基因序列在 GeneBank中編號為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peW和pe/^)。通過基因工 程方法，將七aZ^e朋sp. PCC7120中的藻藍蛋白alpha亞基裂合酶基因cpcf和c/ c,克隆于 Novagen公司購買的pETDuet-l中，所得質粒叫pETDuet-c/ c^-c/7c/S在大腸桿菌中能表達藻 藍蛋白alpha亞基裂合酶CpcE/CpcF，得到藻藍蛋白alpha亞基裂合酶表達質粒。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒 中同樣的酶切位點上。
(2) 將鏈霉親和素基因(簡稱幼)和^7a6ae朋sp. PCC7120中的藻藍蛋白alpha亞基 脫輔基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公司購買的pET30中，所得質粒叫pET30-s『cpd， 在大腸桿菌中能表達鏈霉親和素和藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親 和素標記的藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和pe力5)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-/ o/-pe/^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質粒叫pACYCDuet-pe^，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因c/7c^在pET30中是在)5boRV和J力o I兩個酶切位點之間，鏈霉親和素 基因m在I和《g7II兩個酶切位點之間；裂合酶基因cpcf在pETDuet中，處于第一個多 克隆位點，酶切位點是和尸WI之間，裂合酶基因cpcf在pETDuet中，處于第二個多 克隆位點，酶切位點是fcoRV和I力o I之間；PEB合成酶基因是3個(力o厶peM和pe力5)， 力o7和pe/^在同一個載體pCDFDuet-l中，力o7在第一個多克隆位點I和戶W I之間，/ e幼 在第二個多克隆位點；We I和J力o I之間，peM在pACYCDuet-l中第二個多克隆位點AWn和 之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5) 將pETDuet-c/ cf-cpc尸、pET30-sa~cpcA pCDFDuet-力o7—peZ^和pACYCDuet-peM 轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養基中，37'C振蕩培養至006。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2CTC至37。C振蕩表 達約12小時，生產鏈霉親和素標記的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白 A;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可 提純得到相應的鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A。其吸收與熒 光光譜見附圖1中所示，其中實線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式如下
從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mL LB培養基，37°C
振蕩培養過夜;取100pL飽和培養物，無菌轉接至5mL LB培養基，37。C振蕩培養至OD6。。=0. 3
0.4時，將菌液轉移至5mL無菌離心管中，冰上放置10分鐘；離心l分鐘(10000g， 4'C)棄
去上清，收集沉淀菌體；用lmL預冷的0.1mol/LCaCl2無菌溶液重懸菌體,離心30s(10000g，
4'C)去上清，菌體沉淀用100nL預冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置于冰上，加入一定量的構
建好的質粒，混勻后冰浴放置30分鐘，42。C熱休克90s,冰浴5分鐘后加入300pL LB培養基，37'C低速振蕩培養45分鐘，無菌涂布在含有相應抗生素的LB培養基平板上，倒置于37
t;培養箱至形成可見的單克隆菌斑。
提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養基中，振蕩培養至飽和；分 別從中取100pL轉接至5ml含相應抗生素的LB培養基中；37。C振蕩培養至0D6。。=0. 5-0. 7時， 冰浴約30分鐘，加入IPTG誘導表達；避光、20°C、 150轉/分，表達約12小時。離心收集 細胞，細胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測其產物熒光量，選取熒光產量高的菌株進行大量 表達。
實施例2
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種力朋/ ,a sp. PCC7120的全序列已經測定完成， 必Z3肌'y70 "s sp. PCC7603部分序列已經測定。^ a力ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為 BA000019， J^柳i/ 。愿sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為:M34254,可 從所查到序列中找到所需基因；CW"力n'義sp. PCC7601己經部分測序，所用到基因序列在 GeneBank中編號為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因。e^和pe力5)。通過基因工 程方法，將必Js歷i/70^A9 sp. PCC7603中的藻藍蛋白alpha亞基裂合酶基因cpcf和cpc尸克 隆于Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-cpcf-cpc尸，在大腸桿菌中能 表達藻藍蛋白alpha亞基裂合酶CpcE/CpcF，得到藻藍蛋白alpha亞基裂合酶表達質粒。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒 中同樣的酶切位點上。
(2) 將鏈霉親和素基因(簡稱sa)和^朋6ae朋sp. PCC7120中的藻藍蛋白alpha亞基 脫輔基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公司購買的pET30中，所得質粒叫pET30-stcp", 在大腸桿菌中能表達鏈霉親和素和藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親 和素標記的藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893,通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和pe65)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-peZ^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。eW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-pe力A在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因cpd在pET30中是在化oRV和兩個酶切位點之間，鏈霉親和素
基因sa在1和％711兩個酶切位點之間；裂合酶基因cpcf在pETDuet中，處于第一個多
克隆位點，酶切位點是Afco I和尸"I之間，裂合酶基因cpc尸在pETDuet中，處于第二個多
克隆位點，酶切位點是AcoRV和i7 oI之間；PEB合成酶基因是3個(Zw7、 peM和peM)，力o/和peZ^在同一個載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個多克隆位點I和尸"I之間，/ eM 在第二個多克隆位點yWe I和i7 o I之間，/ eW在pACYCDuet-l中第二個多克隆位點5g7II禾口 Iol之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5)將pETDuet-c; cf—cpc尸、pET30_sa~c/ c力、pCDFDuet—力o7-pe/^和pACYCDuet—peM 轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養基中，37'C振蕩培養至006。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1畫1/L， 20。C至37。C振蕩表 達約12小時，生產鏈霉親和素標記的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白 A;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過N;T親和層析，可 提純得到相應的鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例3
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種^a&e朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成， 7a/z j'/30Si/s sp. PCC7603部分序列已經測定。sp. PCC7120在GeneBank中編號為
BA000019, #. 7柳i廳"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為:M34254,可 從所査到序列中找到所需基因；sp. PCC7601已經部分測序，所用到基因序列在 GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(pe似和/ eZ^)。通過基因工 程方法，將^7a^e/ a sp. PCC7120中的藻藍蛋白alpha亞基裂合酶基因cpcf和cpcF克隆于 Novagen公司購買的pETDuet-l中，所得質粒叫pETDuet-cpcf-c/ c尸，在大腸桿菌中能表達藻 藍蛋白alpha亞基裂合酶CpcE/CpcF，得到藻藍蛋白alpha亞基裂合酶表達質粒。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒 中同樣的酶切位點上。
(2) 將鏈霉親和素基因(簡稱sa)和M 7a/w'/70s"s sp. PCC7603中的藻藍蛋白alpha
亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公司購買的pET30中，所得質粒叫pET30-s^ "d，
在大腸桿菌中能表達鏈霉親和素和藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893,通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o/和peZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-; eZ^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質粒叫pACYCDuet-; eM，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因c; "在pET30中是在fcoRV和i7w I兩個酶切位點之間，鏈霉親和素 基因sa在A>71和^WII兩個酶切位點之間；裂合酶基因cpcf在pETDuet中，處于第一個多 克隆位點，酶切位點是I和尸5t I之間，裂合酶基因c/ c尸在pETDuet中，處于第二個多 克隆位點，酶切位點是^coRV和J力ol之間；PEB合成酶基因是3個(力o7、 pe似和peM)， 力o7和pe力5在同一個載體pCDFDuet-1中，Z W在第一個多克隆位點Afco I和尸"I之間， 在第二個多克隆位點〃ofe I和i7 o I之間，； e/W在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點ife7II和 之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5) 將pETDuet-cpcf-c/ cF、 pET30-sa~cpc」、pCDFDuet-力o7-peZ^和pACYCDuet—; e^ 轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養基中，37'C振蕩培養至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmraol/L， 2(TC至37。C振蕩表 達約12小時，生產鏈霉親和素標記的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白 A;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可 提純得到相應的鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例4
(1)從GeneBank中可以査到，藻種力"a6ae朋sp.PCC7120的全序列已經測定完成，
yK 73肌'/70s〃s sp. PCC7603部分序列已經測定。」朋6朋朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為
BA000019， Ja/w'加犯s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可
從所查到序列中找到所需基因；CWW/^i義sp. PCC7601已經部分測序，所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因。e^和peZ^)。通過基因工 程方法，將尨J柳i/7os"s sp. PCC7603中的藻藍蛋白alpha亞基裂合酶基因c/ cf和c/ c尸克 隆于Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-cpcf-cpc尸，在大腸桿菌中能 表達藻藍蛋白alpha亞基裂合酶CpcE/CpcF，得到藻藍蛋白alpha亞基裂合酶表達質粒。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒 中同樣的酶切位點上。
(2) 將鏈霉親和素基因(簡稱sa)和屈Ja/M'/305"5 sp. PCC7603中的藻藍蛋白alpha 亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公司購買的pET30中，所得質粒叫pET30-s『cpcA 在大腸桿菌中能表達鏈霉親和素和藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親 和素標記的藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-/ o7-pe6&在大腸桿菌中能同時表達HOI和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因c; c」在pET30中是在fcoRV和J力o I兩個酶切位點之間，鏈霉親和素 基因sa在f/wl和v ^ni兩個酶切位點之間；裂合酶基因cpcf在pETDuet中，處于第一個多 克隆位點，酶切位點是I和尸"I之間，裂合酶基因cpcF在pETDuet中，處于第二個多 克隆位點，酶切位點是fcoRV和之間；PEB合成酶基因是3個(力o入pe^和/ eZ^)， 力o7和pe65在同一個載體pCDFDuet-1中，Z o7在第一個多克隆位點Afco I和尸st I之間，peM 在第二個多克隆位點Aye I和J力o I之間，在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點《WII和 J/wI之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5) 將pETDuet-c/ cA-cpc尸、pET30-sa"cpc/J、 pCDFDuet-力o/-/ e/ 5和pACYCDuet-pe似 轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于PH 7. 0
的LB培養基中，37t:振蕩培養至0Ds。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 2(TC至37。C振蕩表 達約12小時，生產鏈霉親和素標記的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白 A;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可 提純得到相應的鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例5
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種^7a&e/7a sp. PCC7120的全序列已經測定完成， 必7ayw'/ o^As sp. PCC7603部分序列已經測定。^ W朋/ a sp. PCC7120在GeneBank中編號為 BA000019， M 73/w'/70犯s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可 從所査到序列中找到所需基因；sp. PCC7601已經部分測序，所用到基因序列在 GeneBank中編號為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(和pe力i9)。通過基因工 程方法，將^朋&e朋sp. PCC7120中的藻藍蛋白alpha亞基裂合酶基因cpcf和c/ c,克隆于 Novagen公司購買的pETDuet-l中，所得質粒叫pETDuet-c々cf-c/ c尸，在大腸桿菌中能表達藻 藍蛋白alpha亞基裂合酶CpcE/CpcF,得到藻藍蛋白alpha亞基裂合酶表達質粒。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒 中同樣的酶切位點上。
(2) 將鏈霉親和素基因(簡稱sa)和^ a/ ae朋sp. PCC7120中的藻藍蛋白alpha亞基 脫輔基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公司購買的pCOLADuet-1中，所得質粒叫 pCOLADuet-sa"C/ cA在大腸桿菌中能表達鏈霉親和素和藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融 合蛋白，得到鏈霉親和素標記的藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(Z o7和peZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-/w7-/7"A在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(pe似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達PebA。
即鏈霉親和素基因幼和脫輔基蛋白基因cpd拼接后的片段在pC0LADuet-1中是在第一
個多克隆位點的^boR I和兩個酶切位點之間；裂合酶基因c; c^在pETDuet中，處于第
一個多克隆位點，酶切位點是辰ol和尸"l之間，裂合酶基因cpc,在pETDuet中，處于第
二個多克隆位點，酶切位點是fcoRV和i7wl之間；PEB合成酶基因是3個(力o入/ e^和
peZ 5)，力o7和peZ^在同一個載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個多克隆位點Afco I和戶"I之
間，peZ^在第二個多克隆位點AWe I和屈oI之間，在pACYCDuet-l中第二個多克隆位點《^II和之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5)將pETDuet-c/^f-cpc/^pC0LADuet-sa"cpcApCDFDuet-力o7-/ eZ^和pACYCDuet-; eZ)// 轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養基中，37。C振蕩培養至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-半乳糖苷 (is叩rophyl thio-卩-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1畫1/L, 20。C至37。C振蕩表 達約12小時，生產鏈霉親和素標記的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白 A;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過N:T親和層析，可 提純得到相應的鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例6
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種^7atee朋sp.PCC7120的全序列已經測定完成， ^肌'/70s"s sp. PCC7603部分序列已經測定。^7a6ae/ a sp. PCC7120在GeneBank中編號為
BA000019，屋7扁'愿〃ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為:M34254,可 從所査到序列中找到所需基因；C^"力riz sp. PCC7601已經部分測序，所用到基因序列在 GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(pe/y和peZ^)。通過基因工 程方法，將M Ja肌'/70仰s sp. PCC7603中的藻藍蛋白alpha亞基裂合酶基因cpcf和c/ cF克隆 于Novagen公司購買的pETDuet-l中，所得質粒叫pETDuet-c; c^-cpc尸，在大腸桿菌中能表 達藻藍蛋白alpha亞基裂合酶CpcE/CpcF,得到藻藍蛋白alpha亞基裂合酶表達質粒。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒 中同樣的酶切位點上。
(2) 將鏈霉親和素基因(簡稱sa)和^朋6ae朋sp.PCC7120中的藻藍蛋白alpha亞基
脫輔基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公司購買的pCOLADuet-1中，所得質粒叫
pC0LADuet-s『cpc/1，在大腸桿菌中能表達鏈霉親和素和藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融
合蛋白，得到鏈霉親和素標記的藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893,通過全基因合成得到。(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力a 和/)e/^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-pe6A在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。eW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-pe似，在大腸桿菌中能表達PebA。
即鏈霉親和素基因ss和脫輔基蛋白基因cpc力拼接后的片段在pCOLADuet-l中是在第一 個多克隆位點的I和尸st I兩個酶切位點之間；裂合酶基因cpcf在pETDuet中，處于第 一個多克隆位點，酶切位點是Afcol和At I之間，裂合酶基因c; c,在pETDuet中，處于第 二個多克隆位點，酶切位點是fcoRV和Wol之間；PEB合成酶基因是3個(力o入； eM和 peM)，力o7和peM在同一個載體pCDFDuet-l中，7 o7在第一個多克隆位點vVco I和尸W I之 間，pe65在第二個多克隆位點M/e I和l力o I之間，在pACYCDuet-l中第二個多克隆位 點^WII和i7 oI之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5) 將pETDuet-cpc^-cpc,、pC0LADuet-sa"cpc丄pCDFDuet-力o7-peZ 5和pACYCDuet—pe/M 轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養基中，37'C振蕩培養至OD柳為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lramol/L， 20。C至37。C振蕩表 達約12小時，生產鏈霉親和素標記的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白 A;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可 提純得到相應的鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例7
(1)從GeneBank中可以査到，藻種^ a6ae朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成，
yK 7湖u'; ams sp. PCC7603部分序列已經測定。^ a^e朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為
BA000019， zO,7 固s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為:M34254,可
從所查到序列中找到所需基因；6^"力r^ sp. PCC7601已經部分測序，所用到基因序列在
GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(和peZ^)。通過基因工
程方法，將力"a6ae;7a sp. PCC7120中的藻藍蛋白alpha亞基裂合酶基因cpcf和cpc尸克隆于Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-cpcf-c/ c,，在大腸桿菌中能表達藻 藍蛋白alpha亞基裂合酶CpcE/CpcF，得到藻藍蛋白alpha亞基裂合酶表達質粒。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒 中同樣的酶切位點上。
(2) 將鏈霉親和素基因(簡稱sa)和J/. h/M'77oms sp. PCC7603中的藻藍蛋白alpha 亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公司購買的pCOLADuet-1中，所得質粒叫 pCOLADuet-stcpcA在大腸桿菌中能表達鏈霉親和素和藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融 合蛋白，得到鏈霉親和素標記的藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(/ W和pe/^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-peM,在大腸桿菌中能同時表達HOI和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-peW,在大腸桿菌中能表達PebA。
即鏈霉親和素基因幼和脫輔基蛋白基因cpd拼接后的片段在pCOLADuet-1中是在第一 個多克隆位點的^coR I和I兩個酶切位點之間；裂合酶基因c/x^在pETDuet中，處于第 一個多克隆位點，酶切位點是vVcoI和尸WI之間，裂合酶基因cpc尸在pETDuet中，處于第 二個多克隆位點，酶切位點是化oRV和J力ol之間；PEB合成酶基因是3個(力o7、 pe似和 ; eM)，力o/和； eM在同一個載體pCDFDuet-l中，/ W在第一個多克隆位點Afco I和/^t I之 間，peZ^在第二個多克隆位點We I和J力o I之間，在pACYCDuet-1中第二個多克隆位 點《gill和之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5) 將pETDuet-cpcf-cpc尸、pC0LADuet-sa"c; cApCDFDuet-力o7-/ e65和pACYCDuet-/ e^
轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0
的LB培養基中，37。C振蕩培養至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷
(is叩rophyl thio-p_D_galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1睡1/L， 20。C至37。C振蕩表
達約12小時，生產鏈霉親和素標記的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過附2+親和層析，可 提純得到相應的鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例8
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種^朋6se朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成， M ^/zu'/70s"s sp. PCC7603部分序列已經測定。^ a力ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為 BA000019， i/.7柳i/7o雄sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為:M34254,可 從所査到序列中找到所需基因；Cg"Mr^ sp.PCC7601已經部分測序，所用到基因序列在 GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(/ e^和peZ^)。通過基因工 程方法，將尨Ja歷j'/7o幼s sp. PCC7603中的藻藍蛋白alpha亞基裂合酶基因cpcf和"cF克 隆于Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-cpcf-cpcF，在大腸桿菌中能 表達藻藍蛋白alpha亞基裂合酶CpcE/CpcF，得到藻藍蛋白alpha亞基裂合酶表達質粒。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒 中同樣的酶切位點上。
(2) 將鏈霉親和素基因(簡稱幼)和必7a肌'/7oms sp. PCC7603中的藻藍蛋白alpha 亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公司購買的pCOLADuet-1中，所得質粒叫 pCOLADuet-sa"cpcA在大腸桿菌中能表達鏈霉親和素和藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融 合蛋白，得到鏈霉親和素標記的藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893,通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(/ W和peZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-; eZ^，在大腸桿菌中能同時表達HOI和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-z eM，在大腸桿菌中能表達PebA。
即鏈霉親和素基因幼和脫輔基蛋白基因cp"拼接后的片段在pCOLADuet-1中是在第一
個多克隆位點的I和尸"I兩個酶切位點之間；裂合酶基因c; cf在pETDuet中，處于第
一個多克隆位點，酶切位點是AfcoI和之間，裂合酶基因c/ cf在pETDuet中，處于第
二個多克隆位點，酶切位點是fcoRV和之間；PEB合成酶基因是3個(力o7、 和
/ e6S)，力o7和pe/^在同一個載體pCDFDuet-l中，/w7在第一個多克隆位點Afco I和尸"I之
間，peZ^在第二個多克隆位點7VWe I和J力o I之間，在pACYCDuet-1中第二個多克隆位
點^7II和i7wI之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致h l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5)將pETDuet-c;x^—c/ cF、pC0LADuet-sa~c/7CJ、pCDFDuet-/ o7—pe/^和pACYCDuet—/ e^ 轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養基中，37。C振蕩培養至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-13-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表 達約12小時，生產鏈霉親和素標記的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白 A;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可 提純得到相應的鏈霉親和素標記的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A。 將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 上述制備方法適用于采用各種藍藻中的alpha亞基裂合酶、藻藍蛋白alpha亞基類脫輔 基蛋白和PEB生物合成酶基因或其同源基因以及鏈霉親和素基因及其同源基因來制備鏈霉親 和素標記的結合PEB的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質，但涉及到微生物菌種公開的問題， 本發明只選用了 GenBank中已公開全序列的藍藻^M力a朋a sp. PCC7120和已公開部分序列的 藍藻尨7a/wV7aws sp. PCC7603、 sp.PCC7601為例對本發明方法加以說明，本領
域的技術人員可以根據上述公開的內容采用其它原料實施本發明。
權利要求
1. 一種鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質的制備方法，其特征在于包括下述步驟(1)用基因工程方法，將alpha亞基裂合酶基因或其同源基因克隆于表達載體中，得到alpha亞基裂合酶表達質粒；(2)用基因工程方法，將鏈霉親和素基因和藻藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆于第二個表達載體中，得到鏈霉親和素標記的脫輔基蛋白表達質粒；(3)用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因ho1和pebB或其同源基因克隆于第三個表達載體中，得到ho1和pebB表達質粒；(4)用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因pebA或其同源基因克隆于第四個表達載體中，得到pebA表達質粒；(5)將alpha亞基裂合酶表達質粒、鏈霉親和素標記的脫輔基蛋白表達質粒、ho1和pebB表達質粒及pebA表達質粒依次轉入配套的宿主菌，當這些表達質粒都轉入宿主菌后，得到相應的工程菌，應用此工程菌通過發酵工程生產鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質；發酵后，按常規蛋白質提純技術，提純得到相應的鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的宿主菌為大腸桿菌。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的alpha亞基裂合酶基因是指與 ^7a&e/7a sp. PCC7120中cpcf和cpc尸基因或必^;w'/7a iAS sp. PCC7603中c;x^和cpc尸基 因同源的基因。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的藻藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白 基因是指與力/7a6ae/7a sp. PCC7120或必J柳i/ oOTs sp. PCC7603中c/ c力同源的基因。
全文摘要
本發明公開了一種鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素(PEB)的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質的制備方法，是通過應用藻藍蛋白alpha亞基裂合酶催化藻紅膽素(PEB)與鏈霉親和素標記的藻藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白共價結合，制備鏈霉親和素標記的結合PEB的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質。本發明的方法應用生物過程生產鏈霉親和素標記的結合PEB的藻藍蛋白類alpha亞基熒光蛋白質，是一種環境友好的生產方法。鏈霉親和素標記的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質能應用于生物學和醫藥功能材料領域，特別是應用為生物學和醫學檢測領域的熒光探針。
文檔編號C12N15/60GK101475949SQ20081002562
公開日2009年7月8日 申請日期2008年1月3日 優先權日2008年1月3日
發明者佟順剛, 明 周, 坤 夏, 趙開弘 申請人:廣州天寶頌原生物科技開發有限公司;華中科技大學