專利名稱：：慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原特異TCRVα12亞家族的Y基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一個(gè)T細(xì)胞受體(TCR)的核苷酸序列，特別是指一種慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原特異TCRVa12亞家族的Y基因序列。
背景技術(shù)：
：苯是目前應(yīng)用最為廣泛的化工原料和工業(yè)溶劑之一。我國職業(yè)苯暴露工人達(dá)50萬以上，占各種化學(xué)物職業(yè)接觸人數(shù)之首。國際癌癥研究署(IARC)和美國環(huán)境保護(hù)局(EPA)都將苯列為確證的人類致癌物。我國學(xué)者與美國國家癌癥研究所(NCI)合作對中國74828名接苯工人和3580名對照工人進(jìn)行的隊(duì)列研究證明，接苯工人發(fā)生血液淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤，如再生障礙性貧血(AA)、骨髓增生異常綜合征MDS)或白血病的相對危險(xiǎn)性明顯增加。苯致血液系統(tǒng)損傷的機(jī)制目前尚未完全闡明，普遍認(rèn)為是多因素、多水平綜合作用的結(jié)果。近年研究表明，苯對人體血液系統(tǒng)的損傷，其原因之一可能是通過抑制T細(xì)胞的增殖而損傷機(jī)體的免疫功能。T細(xì)胞受損后機(jī)體清除異常細(xì)胞能力下降，最終會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。AA患者存在T細(xì)胞克隆性或寡克隆性活化增殖，并認(rèn)為多克隆淋巴細(xì)胞被高度擴(kuò)張的寡克隆淋巴細(xì)胞取代是再障發(fā)病起始階段主要致病原因之一。國內(nèi)外對慢性輕度苯中毒患者免疫方面的研究主要集中在T淋巴細(xì)胞亞群及TCR(3亞家族的錄用情況。但有關(guān)職業(yè)接苯人群中TCR(x亞家族及其互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)，即與抗原特異性識別結(jié)合的部位的研究資料較少。在慢性苯中毒患者中存在的這種克隆性T淋巴細(xì)胞是否一樣具有惡性克隆的性質(zhì)，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。因此，進(jìn)一步了解慢性苯中毒患者細(xì)胞免疫狀態(tài)，可以為職業(yè)苯中毒免疫方面的研究提供新思路，同時(shí)可將所獲得的T細(xì)胞克隆作為阻斷靶點(diǎn)，為遏制慢性苯中毒病程發(fā)展及免疫抑制治療提供依據(jù)。
發(fā)明內(nèi)容為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的首要目的在于提供慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原特異TCRVa12亞家族的Y基因序列。本發(fā)明從慢性輕度苯中毒患者外周血中存在T細(xì)胞受體(TCR)Va亞家族的克隆性T細(xì)胞，經(jīng)序列分析顯示其特異性TCR序列的高度可變區(qū)V-N-J區(qū)，即互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)，與抗原特異性識別結(jié)合的部位，表明該克隆性T細(xì)胞所表達(dá)的TCR為慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原刺激所產(chǎn)生的特異性TCR，獲得了慢性輕度苯中毒相關(guān)的TCR基因序列。本發(fā)明公開了針對慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原的特異性TCR的基因序列，尤其是TCR的高度可變區(qū)即CDR3，后者是T細(xì)胞表面受體識別抗原的特異區(qū)域，針對于不同抗原，除了機(jī)體所選用的TCRV(x亞家族T細(xì)胞不同，更為關(guān)鍵的是其TCR基因的CDR3序列的差異，該部位決定了所屬T細(xì)胞所能識別的抗原。本發(fā)明提供了識別慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原的TCRVal2基因序列，由于其CDR3的特異性，僅來自于單一克隆的T細(xì)胞，是一高度特異的序列。同時(shí)，根據(jù)CDR3的基因序列編碼的蛋白質(zhì)，可用來了解職業(yè)接苯后的相關(guān)抗原肽，為慢性苯中毒的生物學(xué)特性提供資料。本發(fā)明的另一目的在于提供上述基因序列的應(yīng)用。根據(jù)所獲得的慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原特異TCRVa12亞家族的Y基因序列，可以用于(1)了解職業(yè)接苯人群所存在的TCRVal2亞家族T細(xì)胞的情況，用于評價(jià)病人的免疫功能狀態(tài)，早期發(fā)現(xiàn)可能的不良效應(yīng)、篩檢易感人群等方面及時(shí)提供信息。(2)借助所獲得的T細(xì)胞克隆，尋找接苯后慢性中毒的抗原，并采用TCR特異性單抗及TCRDNA疫苗選擇性地取出異常T細(xì)胞克隆從而靶向治療慢性苯中毒。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原特異TCRVcc12亞家族的Y基因序列，所述基因序列如下所示CGGCCTGGAGCAAC。其中，Y基因序列為408個(gè)bp:l-144bp為V區(qū)；145-150bp為N區(qū)，151-208bp為J區(qū);209-408bp為C區(qū)。上述慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原特異TCRV(x12亞家族的Y基因序列翻譯的蛋白質(zhì)(136AA)如下QSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAAAWSN。上述慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原特異TCRVa12亞家族的Y基因序列的制備方法，包括如下步驟A、收集慢性輕度苯中毒患者外周血，F(xiàn)icoll分層法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞；B、提取外周血單個(gè)核細(xì)胞的RNA，RT-PCR合成cDNA第一鏈；C、在NCBI的Genebank中查找TCRa鏈的基因序列，并標(biāo)出各亞家族的V區(qū)及C區(qū)在基因組中的位置；D、設(shè)計(jì)29個(gè)V(x特異性上游引物及Ca下游引物；E、PCR擴(kuò)增29個(gè)Va亞家族TCR重排時(shí)產(chǎn)生的V-N-JC區(qū)；F、Ca-Fam標(biāo)記PCR產(chǎn)物，基因掃描分析T細(xì)胞亞家族的表達(dá)和克隆性；G、將呈單克隆或寡克隆掃描圖的亞家族PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化序列分析。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果(1)本發(fā)明制備得到了一種獨(dú)特的慢性輕度苯中毒抗原的相關(guān)TCRVa12基因序列，該序列可以作為一種新的抗原識別TCR基因(主要變化區(qū)在于CDR3序列)補(bǔ)充人類基因庫資料。(2)該TCR基因可用于研究慢性苯中毒的特異性免疫診斷和治療。上述慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原特異TCRVal2亞家族的Y基因序列后，一方面可用于進(jìn)一步檢測病人體內(nèi)所存在的TCRVal2亞家族T細(xì)胞的情況，以評價(jià)其細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，另一方面應(yīng)用是制備選擇性地去除慢性苯中毒患者中異常增殖的T細(xì)胞克隆靶向免疫治療研究方面。前者的檢測所采用技術(shù)與上述檢測TCR基因的技術(shù)相同，通過不同時(shí)間點(diǎn)的分析，可以了解病人所存在的TCRVal2亞家族T細(xì)胞的情況，用于了解病人的免疫狀態(tài)。后者主要通過慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原特異的TCR基因制備對抗確定的特異性抗原的單抗，從而具備了發(fā)揮相應(yīng)特異性去除慢性苯中毒患者中異常增殖的T細(xì)胞克隆。本發(fā)明所提供的TCR基因的應(yīng)用最終目的是通過對慢性苯中毒患者進(jìn)行特異性免疫治療，從而提高療效，改善病人的生存質(zhì)量等，是具有很大的市場推廣應(yīng)用價(jià)值和和較大的社會經(jīng)濟(jì)效益。圖1為慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原特異TCRVal2亞家族的基因掃描圖。其中，A為TCRVal2亞家族多克隆圖；B為TCRVal2亞家族寡克隆圖;。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例(一)抗原特異性TCR基因序列的分析分析TCRVci基因譜的CDR3的長度和堿基序列的方法是利用RT-PCR—基因掃描方法分析TCRVcx29個(gè)亞家族的CDR3長度。首先收集慢性輕度苯中毒患者外周血，F(xiàn)icoll分層法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，留取Pl(T個(gè)PBMCs(外周血單個(gè)核細(xì)胞)提取RNA，RT-PCR合成cDNA。同時(shí)，在NCBI的基因庫中查找出TCRa鏈的基因序列，并標(biāo)出各亞家族的V區(qū)及C區(qū)在基因組中的位置。根據(jù)Va29個(gè)亞家族基因的cDNA設(shè)計(jì)相應(yīng)的29個(gè)Va特異性上游引物，并在Ca區(qū)設(shè)一Ca下游引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增患者29個(gè)Va亞家族TCR重排時(shí)產(chǎn)生的V-N-JC區(qū)。如圖1所示，熒光素Fam標(biāo)記各亞家族PCR產(chǎn)物的Ca區(qū)，基因掃描分析T細(xì)胞各亞家族的表達(dá)，根據(jù)不同位置，高度和形態(tài)的峰，表示產(chǎn)物的大小、量和均一性，從而確定T細(xì)胞克隆性(一般情況下，正常轉(zhuǎn)錄的每個(gè)Va亞家族包含810個(gè)峰，即810個(gè)不同克隆的T細(xì)胞；主峰的出現(xiàn)表明相同大小cDNA的過度擴(kuò)增，單峰表明產(chǎn)物中DNA片斷大小相同，均存在寡克隆或單克隆T細(xì)胞群，三者分別提示產(chǎn)物來自多克隆、寡克隆和單克隆的T細(xì)胞)?；驋呙杞Y(jié)果發(fā)現(xiàn)患者的Val2亞家族T細(xì)胞呈明顯單克??；將Val2亞家族的PCR產(chǎn)物切膠純化，序列分析Val2亞家族TCR的基因序列及其CDR3區(qū)(V-N-J區(qū))，即為與慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原特異性結(jié)合的部位。慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原特異TCRVod2亞家族的Y基因序列的制備方法1、分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(1)取淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll，密度1.077)4mL加入離心管內(nèi)，將稀釋后的抗凝外周血標(biāo)本混懸液平鋪于分離液之上，以水平離心機(jī)，2000rpm，離心15分鐘。(2)吸取中間單個(gè)核細(xì)胞層轉(zhuǎn)移至另一離心管內(nèi)，再加入5mL1640液，輕輕吹打，以1500rpm，離心洗滌10分鐘，棄上清，加入1640液至2mL，混勻后計(jì)數(shù)，并用同樣的方法洗滌兩次，按2xlO々mL調(diào)整細(xì)胞濃度備用。2、RNA提取(TRIzol試劑盒方法提取法)(1)將已加入TRIzol試劑一20。C凍存的細(xì)胞取出，置冰上解凍，混勻后加入0.2mL氯仿，充分混勻，4°C，14000rpm離心30分鐘。(2)吸取上層液至另一離心管，加入0.5mL異丙醇并混勻，室溫靜置IO分鐘后4。C，14000rpm離心30分鐘。(3)去上清，并用lmL75^乙醇(一20。C)洗兩次(28。C，14000rpm)，每次混勻30秒后，離心IO分鐘。(4)去上清，再離心23分鐘，去除剩余的乙醇，置于超凈臺上自然干燥11.5小時(shí)。加入超凈水(2050pL)溶解。(5)于紫外線分光光度儀中檢測樣品的純度和含量，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性和質(zhì)量。(6)RNA保存脂A樣品加入其O.l倍容積的3mol/LNaAC(醋酸鈉)和2倍容積的乙醇后，保存于一80。C備用。3、cDNA合成(1)應(yīng)用六聚體隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒合成cDNA第一鏈。l|igRNA加入16.5pL預(yù)先配制的混合液其中包括7|iLH20、2pL10xPCR-Buffer、2|iL0.lmmol/LDTT、5fxL2.5mmol/LdNTP和0,5jiLRand.Hexmer。(2)于73°C3分鐘后，置于冰中30秒。低溫高速離心30秒置于冰中23分鐘。(3)加入0.6fiLRnasin(33U/pL)和0.5pLSuperscript(200UVL)后，低溫高速離心30秒。(4)室溫靜置10分鐘；42°C，40分鐘以上；83°C，5分鐘，一20。C保存?zhèn)溆胦4、cDNA合成質(zhì)量檢測將所有樣本的cDNA經(jīng)PCR檢測(32M基因(引物序列見表1)而確定其合成質(zhì)量?？偡磻?yīng)體系20jiL，其中上下游引物0.5(imol/L，dNTP0.1mmol/L，Taq聚合酶l.OU，MgCL21.5mmol/L，10xPCR緩沖液2pL，cDNA產(chǎn)物l)iL和dH20，同時(shí)設(shè)置陽性和陰性對照。在德國BiometraPCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件94°C1分鐘(首次3分鐘)，58°C1分鐘，72°C1分鐘(末次6分鐘)，共35個(gè)循環(huán)，最后保存于4。C中。取8^LPCR產(chǎn)物以1.5%(w/v)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，(32M陽性者可進(jìn)一步研究，陰性者視為無cDNA合成，棄去不用。5、PCR擴(kuò)增TCRVa29個(gè)亞家族以29個(gè)TCRVa亞家族基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性上游引物，并在Ca區(qū)設(shè)計(jì)一下游引物(引物序列見表l)。PCR按常規(guī)方法進(jìn)行?？偡磻?yīng)體系20(iL，其中含任一Va引物(29個(gè)Va亞家族之一)和Ca引物0.5[imol/L，余同上。反應(yīng)條件94°C、1分鐘(首次3分鐘)，6(TC、1分鐘和72°C、1分鐘(末次6分鐘)，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后PCR產(chǎn)物保存于4t:中。取8pLPCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果。6、T細(xì)胞克隆性分析(1)標(biāo)記PCR產(chǎn)物10pL的反應(yīng)體系含2.5)aL未標(biāo)記的PCR產(chǎn)物、0.15pmol/LC|3-fam引物、1.5mmol/LMgCl2，O.lmmol/LdNTP，0.75UTaq聚合酶，lpL10xPCR緩沖液和dH20。PCR共進(jìn)行35循環(huán)，每一循環(huán)包括94°C、1分鐘(首次3分鐘)，66°C、l分鐘和72"、l分鐘(末次6分鐘)，最后PCR產(chǎn)物保存于4匸中。(2)基因掃描樣品配制熒光素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物(2pL)加入高質(zhì)量的去離子甲酰胺(Hi-DiFormamide)與Genescan-500LIZ分子量標(biāo)準(zhǔn)品按20:1比例配好的lOpL混(3)基因掃描(按操作指南進(jìn)行)1)按操作指南準(zhǔn)備好儀器并更換水和緩沖液。2)灌膠灌膠前2小時(shí)從4。C冰箱取出POP-4(PerformanceOptimizedPolymer-4)膠回溫12小時(shí)，把膠液抽進(jìn)貯膠5mL針筒中(抽取的mL數(shù)約為0.5+0.07x做樣次數(shù))，倒置排出針筒內(nèi)氣泡，裝緊針筒。3)上樣將備好的樣品于94"變性4分鐘，然后立即放置冰上冷卻2分鐘。變性后的樣品加入96孔板，直接裝載到3100遺傳分析儀進(jìn)行電泳。4)運(yùn)行自動進(jìn)樣器會自動把樣品板移到要分析的4個(gè)樣品的位置，電泳過程中CCD檢測器把熒光信號轉(zhuǎn)換為電信號并把它傳送給安裝了3100數(shù)據(jù)采集軟件的計(jì)算機(jī)工作站。5)數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理完成后就存貯在計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)庫里并以電泳信號圖的形式顯示出來。電泳信號圖的X軸表示時(shí)間，Y軸表示相對熒光強(qiáng)度，每個(gè)圖中同時(shí)畫出幾種用于標(biāo)記DNA片斷的熒光素信號，電泳信號圖中的每個(gè)峰代表一個(gè)DNA片斷。完成處理的數(shù)據(jù)被自動地從數(shù)據(jù)庫中提取并進(jìn)行分6)結(jié)果分析打開GeneMapperSoftwareTMv3.5，將保存于計(jì)算機(jī)硬盤數(shù)據(jù)庫中的原始數(shù)據(jù)加進(jìn)分析軟件，分析產(chǎn)物的長度和熒光素強(qiáng)度。7、核苷酸序列分析(1)E.Z.N.A.凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物1)切膠將PCR產(chǎn)物全部加入l2。/。的瓊脂糖凝膠的加樣孔，當(dāng)電泳至足以分離目的DNA時(shí)，于紫外燈下用干凈的手術(shù)刀切下含有目的條帶的瓊脂糖凝膠塊，切下的凝膠塊置于1.5mL離心管中。2)按E.Z.N.A.凝膠回收試劑盒說明進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化，先加入500BindingBuffer,5565。C孵育至凝膠塊完全溶解；凝膠溶解液加入HiBindDNAspin-column中高速離心去廢液后，再依次加入300pLBindingBuffer、700jxLSPWBuffer洗膜；高速離心甩干spin-column的濾膜后，加入30DNAElutionBuffer(加于濾膜上)，室溫靜置5min，高速離心1min后可得純化的PCR產(chǎn)3)取3純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察純化效果；剩余的PCR純化產(chǎn)物真空冷凍干燥濃縮約20min至10左右。(2)BigDye標(biāo)記用BigDyeTerminatorv3,lCycleSequencingkit標(biāo)記純化后的PCR產(chǎn)物，反應(yīng)體系為BigDyeTerminator1)iL、相應(yīng)單向引物(2|imol/L)1.6jxL、純化后PCR產(chǎn)物2.4piL，反應(yīng)條件96°C1min，(96°C10sec、50°C5sec、60°C4min)25個(gè)循環(huán)。(3)測序?qū)?biāo)記好BigDye的5[iL體系的測序產(chǎn)物補(bǔ)水至20(iL，轉(zhuǎn)入1.5ml的離心管，再依次加入23MNaAc(pH5.2)、2(iL125mMEDTA-Na2、5095%乙醇，旋渦振蕩后室溫下避光放置15min;5415型高速臺式離心機(jī)2800g離心20min，沿離心沉淀物的對側(cè)小心吸取上清并棄去，加入250(iL70%冰凍乙醇，2800g離心5min，棄上清；將管蓋打開置于加熱板上，9495°C1min使其干燥。加入10高質(zhì)量的去離子甲酰胺，反復(fù)吹打混勻，轉(zhuǎn)入0.2pL的PCR管內(nèi)，在PCR儀上95"變性4min，然后迅速置冰中冷卻至少4min后，裝載到3100DNA序列分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。表1RT-PCR實(shí)驗(yàn)所涉及的弓I物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>Votl75'-TGGGAAAGGCCGTGCATTATTGAT-3'Val8'-CAGCACCAATTTCACCTGCAGCTT-3,Val2'-ACACTGGCTGCAACAGCATCCAGG-3'Va20，-TCCCTGTTTA丁CCCTGCCGACAGA-3'Va21'-AGCAAAATTCACCATCCCTGAGCG-3'Va22'-CCTGAAAGCCACGAAGGCTGATGA-3'Va23^'-CC丁GAAAGCCACGAAGGCTGATGA-3'Va245，'-CTGGATGCAGACACAAAGCAGAGC-3'Va255'-TGGCTACGGTACAAGCCGGACCCT-3'Va265''-AGCGCAGCCATGCAGGCATGTACC-3'Va275，-AAGCCCGTCTCAGCACCCTCCACA-3'Va285，-TGGTTGTGCACGAGCGAGACACTG-3'Va295，-GAAGGGTGGAGAACAGATGCGTCG-3'Ca5，-GTTGCTCCAGGCCGCGGCACTGTT-3'Ga-fam5，-Fam-ATACACATCAGAATCCTTACTTTG-3卩rM5'5，-TACACTGAATTCACCCCCAC-3'卩2-M3'5'-CATCCAATCCAAATGCGGCA-3'(二)抗原特異TCR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)1、重組質(zhì)粒TCRVa12(Y)-pIRES的構(gòu)建*(1)目的基因的擴(kuò)增根據(jù)慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原特異TCRVocl2亞家族基因序列(包括完整的CDR3區(qū))設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增病人樣本中的TCRV(xl2基因序列的上游引物上帶有Xhol酶切位點(diǎn)、下游引物上帶有EcoRl酶切位點(diǎn)(與真核表達(dá)載體pIRES中的插入位點(diǎn)A的酶切位點(diǎn)相對應(yīng))。按BDAdvantage2PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)PCR總反應(yīng)體系50|^L，其中含lOxBDAdvantage2PCRBuffer、上下游引物各0.5jimoI/L、dNTPMix0.2mmol/L、50xBDAdvantage2PolymeraseMix、超純水和1cDNA模板，同時(shí)設(shè)置陽性和陰性對照。反應(yīng)條件94°C1min(首次為3min)、60°C1min、72°C2min(末次為7min)，共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。(2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建A、E.Z.N.A.凝膠回收試劑盒純化目的基因TCRVal2的PCR產(chǎn)物(同第一部分，步驟7);B、將真核表達(dá)載體pIRES與純化后的TCRVal2PCR產(chǎn)物分別用XhoI酶切，體系為①TCRVcd2PCR產(chǎn)物28pL、TangoTMbuffer8]uL、XhoI內(nèi)切酶1jliL、超純水3^L;②pIRES載體4juL、TangoTMbuffer8|iL、XhoI內(nèi)切酶ljliL、超純水27^L;混勻后置于37'C水浴3h;C、純化XhoI酶切后的pIRES載體和TCRVal2PCR產(chǎn)物；D、將已純化好的XhoI酶切后的pIRES載體和TCRVod2PCR產(chǎn)物分別再用EcoRI酶切，體系為①TCRVctl2PCR產(chǎn)物(Xho1)28|uL、TangoTMbuffer8)LiL、EcoRI內(nèi)切酶l)iL、超純水3^L;②pIRES載體(XhoI)28^tL、Tangobuffer8pL、EcoRI內(nèi)切酶ljuL、超純水3^L;混勻后置于37。C水浴3h;E、雙酶切后的pIRES載體和TCRVal2PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)體系為10xT4bufferl|iL、T4DNA酶liiiL、雙酶切后的pIRES載體2pL、雙酶切后的TCRV(313PCR產(chǎn)物6pL，混勻后置于16。C過夜；F、轉(zhuǎn)化①將連接產(chǎn)物(10pL)加入感受態(tài)大腸桿菌DH5a(1.5mL離心管，lOOiaL菌液，一7(TC保存，北京Tiangen公司)中，輕輕混勻，置冰中30min;②42。C熱休克90s，迅速置冰中3min;③加入SOC培養(yǎng)基800]nL，置干燥恒溫振蕩箱中37。C180200rpm振搖60min;菌液用玻璃推鋪于1.5%LB固體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100pg/mL)上，置37。C孵箱過夜培養(yǎng)；G、隨機(jī)挑選10個(gè)菌落，分別接種于5mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C180rpm振搖培養(yǎng)過夜，PureLinkTM超純質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒(5415型臺式高速離心機(jī))①3000rpm室溫下離心菌液15min，去上清；②加入250pL含認(rèn)aseA的ResuspensionBuffer,重懸細(xì)菌；③加入250pLLysisBuffer,輕輕混勻，室溫下放置5min;④加入350pLPrecipitationBuffer,立即振蕩混勻；⑤以11400rpm離心10min后，將上清液轉(zhuǎn)移至Minicolumn中，11400rpm離心lmin，去廢液；加入700|iLWashBuffer,11400rpm離心lmin，去廢液；⑦再以11400rpm離心lmin后，將Minicolumn放入一新的1.5mL離心管中，加入75[iL預(yù)熱65。C的TEBuffer,室溫下放置3min，11400rpm離心2min，所收集的溶液即為富含質(zhì)粒溶液；H、提取質(zhì)粒DNA后用XhoI和EcoRl雙酶切鑒定，同時(shí)在pIRES載體的IRES區(qū)設(shè)計(jì)一下游引物IRES-R(5'-TATAGACAAACGCACACCGG-3，)，結(jié)合pIRES載體上游的T7公共引物(5，-TACGACTCACTATAGGCTAG-3，)進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)體積為25pL，包括O.lmmol/LdNTP、1.5UTaq聚合酶、10xPCR緩沖液、1.5mmol/LMgCl2和超純水，引物濃度均為0.4jumol/L，以1:500稀釋的質(zhì)粒DNA1pL作為模板。PCR擴(kuò)增條件為94。C3min，(94°C30s，6(TClmin，72。C2min，35個(gè)循環(huán))，72°C5min;酶切產(chǎn)物及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。篩選出陽性克隆，再對其進(jìn)行雙向測序鑒定，證實(shí)為本發(fā)明特異基因序列后擴(kuò)增陽性克隆并提取質(zhì)粒，從而獲得特異性慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原特異的TCRVod2-pIRES質(zhì)粒。用紫外分光光度計(jì)測定重組質(zhì)粒的濃度。2、脂質(zhì)體介導(dǎo)的重組質(zhì)粒TCRVal2-pIRES轉(zhuǎn)染(1)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞株、Molt4細(xì)胞株轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞株①將處于對數(shù)生長期的八549細(xì)胞株以4><105個(gè)細(xì)胞/孔的密度，加入2mL無血清無抗生素的IMDM培養(yǎng)基，接種6孔培養(yǎng)板；②取TCRVal2-pIRES重組質(zhì)粒(4嗎)置于1.5mL離心管中，加入無血清無抗生素的IMDM培養(yǎng)基至250^L，輕輕混勻；③取15脂質(zhì)體Lipofectamine2000置于1.5mL離心管中，加入無血清無抗生素的IMDM培養(yǎng)基至250pL，輕輕混勻后室溫下孵育5min;將②和③混勻后，室溫下孵育20min;◎?qū)ⅱ芗尤擘俚腁549細(xì)胞培養(yǎng)基中(轉(zhuǎn)染平行2孔)，另設(shè)1孔轉(zhuǎn)染pIRES空載體作為陰性對照，具體操作方法同轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒；置于37'C、5y。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后全量換液為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)72h后加G418進(jìn)行篩選(終濃度600pg/mL)，每4天換一次培養(yǎng)基，同時(shí)加入相同濃度的G418，在此篩選條件下培養(yǎng)20d可得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染Molt4細(xì)胞株將處于對數(shù)生長期的Molt4細(xì)胞株以2"06個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種6孔板，取4pgTCRVctl2-pIRES重組質(zhì)粒和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000混合后轉(zhuǎn)染Molt4細(xì)胞株，方法同轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞株。3、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后TCRVal2基因表達(dá)的鑒定(1)RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR檢測TCRVal2mRNA的表達(dá)轉(zhuǎn)染7天后，各孔收集3xl(^細(xì)胞，用TRIZol試劑盒和SurperScriptII逆轉(zhuǎn)錄試劑盒分別提取總RNA、合成cDNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增管家基因卩2M檢測cDNA的合成質(zhì)量(同第一部分，步驟7);用相應(yīng)的TCRVctl2引物以及相應(yīng)的C(3引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，轉(zhuǎn)染空載體組作為陰性對照，PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件同前所述。(2)間接免疫熒光法和流式細(xì)胞儀檢測重組質(zhì)粒的表達(dá)轉(zhuǎn)染10天后，收集lxl(^細(xì)胞，用0.1mol/L的PBS洗滌細(xì)胞兩次后，標(biāo)記大鼠抗人TCRVa單抗(一抗，1:100稀釋)，37。C孵育lh;PBS洗滌細(xì)胞三次后，標(biāo)記FITC-兔抗大鼠IgG抗體(二抗，1:50稀釋)，37。C孵育lh;PBS洗滌細(xì)胞三次后，在熒光顯微鏡下觀察重組質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株中的表達(dá)情況；或直接用FITC-大鼠抗人TCRVal2單抗標(biāo)記，37。C孵育30min，PBS洗滌細(xì)胞一次后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式檢測重組質(zhì)粒的表達(dá)。(3)點(diǎn)印記雜交和WesternBlot檢測TCRVal2蛋白的表達(dá)轉(zhuǎn)染20天后，收集2><106穩(wěn)定表達(dá)重組質(zhì)粒的細(xì)胞，用RIPA蛋白提取試劑盒提取總蛋白，真空冷凍干燥濃縮后考馬斯亮蘭法定量；同樣提取臍血細(xì)胞(TCRVcd2亞家族表達(dá)均陽性)的蛋白作為陽性對照，轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞的蛋白為陰性對照。1)點(diǎn)印記雜交A、取NC膜2cmx4cm，劃分小格，用微量加樣槍分別點(diǎn)膜，重組質(zhì)粒組、陽性對照組、陰性對照組的蛋白樣品分別點(diǎn)3次，每次l)lL;進(jìn)行2個(gè)平行反應(yīng)；B、用blocldngReagent封膜4h后用washbuffer洗滌2次，每次5min;C、加入l:500的大鼠抗人TCRVal2單抗(用blockingReagent稀釋)，4°C孵育過夜后用washbuffer洗滌2次，每次5min;D、加入l:500的HRP-兔抗大鼠IgG抗體(用blockingReagent稀釋)室溫孵育2h，用washbuffer洗滌3次，每次5min;E、將NC膜浸入DAB底物液(避光)顯色。2)WesternBlotA、SDS-PAGE電泳將轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組的濃縮蛋白樣品、陽性對照和陰性對照分別加樣于15。/。SDS-PAGE膠(每孔上樣約100(ig)，以PageRulerPrestainedProteinLadder為預(yù)染marker，進(jìn)行3個(gè)平行反應(yīng)；用恒壓60V電泳30min后，改恒壓100Vlh;B、分離其中1個(gè)平行反應(yīng)的SDS-PAGE膠，用考馬斯亮蘭染色后，用冰乙酸甲醇洗脫液反復(fù)漂洗直至有清晰條帶顯出；C、轉(zhuǎn)膜PVDF膜預(yù)先用甲醇浸泡lmin，再浸泡到轉(zhuǎn)膜液中備用；切好的濾紙和海綿也浸泡到轉(zhuǎn)膜液中10min;將切下的另2個(gè)平行反應(yīng)的SDS-PAGE膠與相應(yīng)的PVDF膜放入轉(zhuǎn)膜液中浸泡片亥I」；將海綿一濾紙一PVDF膜一SDS-PAGE膠一濾紙一海綿依次放到陽極板上，膠大小=膜>濾紙；用4。C預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜液，恒壓40V，90min(濕轉(zhuǎn));D、封膜用blockingReagent封膜4h后用washbuffer洗滌2次，每次5min;E、檢測人P-actin蛋白(內(nèi)參照)的表達(dá)將其中1個(gè)平行反應(yīng)的PVDF膜加入l:800的小鼠抗人卩-actin單抗(用blockingReagent稀釋)，4。C孵育過夜后用washbuffer洗滌2次，每次5min;加入l:1000的HRP-羊抗小鼠IgG抗體(用blockingReagent稀釋)室溫孵育2h，用washbuffer洗滌3次，每次5min;F、檢測目的蛋白TCRVal2的表達(dá)將另1個(gè)平行反應(yīng)的PVDF膜加入1:800的大鼠抗人TCRVa單抗(用blockingReagent稀釋)，4。C孵育過夜后用washbuffer洗滌2次，每次5min;加入l:1000的HRP-兔抗大鼠IgG抗體(用blockingReagent稀釋)室溫孵育2h，用washbuffer洗滌3次，每次5min;G、化學(xué)發(fā)光法顯影在暗室中將PVDF膜轉(zhuǎn)入LumiGLOWorkingReagent中，室溫孵育3min;用鑷子將PVDF膜取出，瀝去多余的試劑；將PVDF膜放入塑料薄膜中，要保證PVDF膜與塑料薄膜之間沒有氣泡；將含有PVDF膜的塑料薄膜放入X線曝光暗盒中，壓上X線膠片(曝光30s)，常規(guī)顯影、定影后得到顯影的X線膠片。4、重組質(zhì)粒TCRVal2-pIRES轉(zhuǎn)染正常人T細(xì)胞，免疫小鼠制備單克隆抗體(1)重組質(zhì)粒TCRVal2-pIRES轉(zhuǎn)染正常人T細(xì)胞將處于對數(shù)生長期的正常人T細(xì)胞以2><106個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種6孔板，取4|igTCRVcd2-pIRES重組質(zhì)粒和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000混合后轉(zhuǎn)染正常人T細(xì)胞，操作方法同前所述，培養(yǎng)擴(kuò)增后得到表達(dá)抗原特異性相關(guān)TCRVal2基因的T細(xì)胞，并檢測驗(yàn)證重組質(zhì)粒的表達(dá)(方法同前)。(2)免疫小鼠制備特異性單抗體外大量培養(yǎng)特異性表達(dá)TCRVal2的T細(xì)胞，收集特異性表達(dá)TCRVal2T細(xì)胞后腹腔注射小鼠，根據(jù)單克隆抗體制備相關(guān)技術(shù)制備針對慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原特異的單抗。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCEUSTING<110>暨南大學(xué)<120>慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原特異TCRVa12亞家族的Y基因序列<130>41<160>2<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>408<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原特異TCRVot12亞家族的Y基因序列<400>1cttattcgtcggaactcttttgatgagcaaaatgaaataagtggtcggtattcttggaac60ttccagaaatccaccagttccttcaacttcaccatcacagcctcacaagtcgtggactca120gcagtatacttctgtgctctgagtgaccgaaatactggaggcttcaaaactatctttgga180gcaggaacaagactatttgttaaagcaaatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccag240ctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaa300acaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagac360atgaggtctatggacttcaagagcaacagtgccgcggcctggagcaac408<210>2<211>136<212>PRT<213>Artificialsequence<220><223>慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原特異TCRVa12亞家族的Y基因序列翻譯的蛋白質(zhì)<400>2LeulieArgArgAsnSerPheAspGluGinAsnGlulieSerGlyArg151015TyrSerTipAsnPheGinLysSerThrSerSerPheAsnPheThrlie202530ThrAlaSerGinValValAspSerAlaValTyrPheCysAlaLeuSer354045AspArgAsnThrGlyGlyPheLysThrHePheGlyAlaGlyThrArg505560LeuPheValLysAlaAsnlieGinAsnProAspProAlaValTyrGin65707580LeuArgAspSerLysSerSerAspLysSerValCysLeuPheThrAsp85卯95PheAspSerGinThrAsnValSerGinSerLysAspSerAspValTyr100105110HeThrAspLysThrValLeuAspMetArgSerMetAspPheLysSer115120125AsnSerAlaAlaAlaTipSerAsn13013權(quán)利要求1、一種慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原特異TCRVα12亞家族的Y基因序列，其特征在于所述Y基因序列如下CTTATTCGTCGGAACTCTTTTGATGAGCAAAATGAAATAAGTGGTCGGTATTCTTGGAACTTCCAGAAATCCACCAGTTCCTTCAACTTCACCATCACAGCCTCACAAGTCGTGGACTCAGCAGTATACTTCTGTGCTCTGAGTGACCGAAATACTGGAGGCTTCAAAACTATCTTTGGAGCAGGAACAAGACTATTTGTTAAAGCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCCGCGGCCTGGAGCAAC。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原特異TCRVa12亞家族的Y基因序列，其特征在于所述慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原特異TCRVa12亞家族的Y基因序列翻譯的蛋白質(zhì)如下DSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAAAWSN。全文摘要本發(fā)明公開了一個(gè)慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原的特異性T細(xì)胞受體的核苷酸序列。通過RT-PCR基因掃描分析慢性輕度苯中毒患者外周血中TCRVαl2亞家族呈明顯單克隆，其PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析特異性TCR序列的V-N-J區(qū)，即互補(bǔ)決定區(qū)3，是和抗原特異性識別結(jié)合的部位，表明該克隆性T細(xì)胞的TCR為慢性輕度苯中毒相關(guān)抗原刺激所產(chǎn)生的特異性TCR。它是進(jìn)行慢性輕度苯中毒免疫靶向治療的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。該特異性TCR的核苷酸序列為進(jìn)一步開展針對慢性輕度苯中毒的特異性細(xì)胞免疫治療的一個(gè)重要基礎(chǔ)。文檔編號C12N15/12GK101245347SQ20081002580公開日2008年8月20日申請日期2008年1月14日優(yōu)先權(quán)日2008年1月14日發(fā)明者萡李,李揚(yáng)秋,楊力建,陳少華申請人:暨南大學(xué)