專利名稱：一種腸溶衣材料固定化纖維素酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶的固定化技術(shù)，尤其涉及一種腸溶衣材料固定化纖維素酶的 制備方法。
背景技術(shù)：
纖維素是自然界中最豐富的可再生資源之一，利用纖維素酶對其進(jìn)行糖化并進(jìn)而發(fā)酵生成乙醇，純乙醇或與汽油混合可直接代替汽油、柴油等化石燃料， 能有效緩解人類化石能源日益短缺的困境。但是纖維素酶在水解纖維素的過程 中，其穩(wěn)定性差、使用壽命短、催化效率較低，導(dǎo)致纖維素糖化過程中酶的生 產(chǎn)成本過高，影響其工業(yè)化推廣應(yīng)用。所以如何降低纖維素酶的生產(chǎn)成本，增 加其穩(wěn)定性和使用壽命，是打通由纖維質(zhì)原料到燃料乙醇技術(shù)路線的關(guān)鍵，也 是世界范圍內(nèi)所面臨的一項(xiàng)共性關(guān)鍵技術(shù)。纖維素酶的固定化能有效提高其穩(wěn)定性和使用壽命，從而為降低纖維素酶 的生產(chǎn)成本提供了可能。對它的研究已經(jīng)成為纖維素酶學(xué)領(lǐng)域研究的一個熱點(diǎn)， 大量的載體和固定化方法也已被人們陸續(xù)開發(fā)出來。而對固定化酶而言，其性能的優(yōu)劣主要取決于所使用載體材料的性質(zhì)和固定化方法。我國在20世紀(jì)90 年代開展纖維素酶的固定化研究，目前國內(nèi)外已經(jīng)有許多不溶性、可溶性載體和固定化方法被廣泛用于纖維素酶的固定化。把纖維素酶固定在不溶性載體上， 固然有利于酶的回收，但缺點(diǎn)是不利于纖維素酶接近于不溶性纖維素底物，增 加了傳質(zhì)阻力；而采用可溶性聚合物作為纖維素酶固定化的載體，確實(shí)使酶促 反應(yīng)容易進(jìn)行，但是反應(yīng)結(jié)束后，酶又不易回收，失去了固定化酶反復(fù)使用的 優(yōu)點(diǎn)。為克服這些缺點(diǎn)，人們開發(fā)出了可溶(Soluble)-不可溶(Insoluble) (S-IS)互變載體系統(tǒng)。這種載體會隨溶液pH值、溫度、離子強(qiáng)度、光照等的不 同，而呈現(xiàn)出可溶和不可溶性狀態(tài)，用其固定化纖維素酶就可避免單獨(dú)使用不 溶性載體系統(tǒng)酶-底物的傳質(zhì)阻力問題，以及可溶性載體系統(tǒng)酶使用后不易回收 的缺陷。由于S-IS系統(tǒng)的種種優(yōu)越性，對它的研究已成為近年來酶工程領(lǐng)域研 究的一個熱點(diǎn)。但是以可溶-不可溶腸溶衣材料Eudragit L-100作為纖維素酶 固定化的載體，國內(nèi)還未見有專利文獻(xiàn)報道。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種腸溶衣材料固定化纖維素酶的制備方法。 本發(fā)明通過交聯(lián)劑EDC的連接作用，把纖維素酶共價固定于pH值敏感型載 體腸溶衣材料Eudragit L-100上，通過溶液pH值的變化，可實(shí)現(xiàn)固定化纖維 素酶的快速回收，大大提高纖維素酶的穩(wěn)定性和使用壽命，從而為降低纖維素 酶的使用成本提供了可能。 本發(fā)明的具體步驟如下1)將腸溶衣材料Eudragit L-100均勻地分散于pH值5. 5的醋酸-醋酸鈉緩沖液中；2) 先后加入溶解于pH 5. 5的醋酸-醋酸鈉緩沖液中的纖維素酶液和交聯(lián) 劑EDC，室溫下緩慢攪拌固定3 6小時；3) 用3M醋酸調(diào)節(jié)pH值為3. 8，在5000rpm下離心10min;4) 沉淀溶解于pH 5. 8的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，即得到所需的固定化纖 維素酶。所述的載體腸溶衣材料Eudragit L-IOO溶液濃度為質(zhì)量體積比(W/V)濃 度2 5%。所述的交聯(lián)劑EDC用量為0.3g/g載體。所述的固定化纖維素酶中蛋白質(zhì)載量為10 100mg蛋白/g載體。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于可通過溶液pH的變化方便地實(shí)現(xiàn)固定化酶的均相酶解 和異相回收，也能夠確保固定化酶在均相狀態(tài)下對不溶性纖維素材料的高效酶 解，以及酶解后副產(chǎn)物木質(zhì)素的快速分離，具有反復(fù)使用多次，酶活保留率變 化不大的優(yōu)點(diǎn)，制備過程簡單方便，可大大降低纖維素酶的使用成本，具有較 好的推廣應(yīng)用價值。
具體實(shí)施方式
為更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。本實(shí)施例采用德國羅姆公司生產(chǎn)的腸溶衣載體材料Eudragit L-100 (Eudragit L-IOO，德國羅姆公司(R5hm GmbH & Co. KG， Darmstadt, Germany) 生產(chǎn)，由甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯(1: 1)共聚而成，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)符合USP/NF/Ph. Eur.，深圳市優(yōu)普惠實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司代售)。將lg腸溶衣Eudragit L-100均勻地分散于pH值5. 5的0. 1M醋酸-醋酸鈉緩沖液中，配置成2%的載體溶液;加入濃度為15mg/mL的纖維素酶液4mL和0. 3g的交聯(lián)劑EDC，室溫下緩慢攪拌固定3 6小時；用3M的醋酸調(diào)節(jié)pH值為3.8，5000rpm下離心10min;將沉淀溶解于pH 5. 8的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，即得到所需的固定化纖維素酶。以Whatman 1號定性濾紙為底物，在固定化酶溶解狀態(tài)下測定纖維素酶的活力，該固定化酶的使用8次后活性回收率為60%，蛋白保留率為48. 71%。
權(quán)利要求
1、一種腸溶衣材料固定化纖維素酶的制備方法，其特征在于包括如下步驟1)將腸溶衣材料Eudragit L-100均勻地分散于pH值5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液中；2)先后加入溶解于pH5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液中的纖維素酶液和交聯(lián)劑EDC，室溫下緩慢攪拌固定3～6小時；3)用3M醋酸調(diào)節(jié)pH值為3.8，在5000rpm下離心10min；4)沉淀溶解于pH5.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，即得到所需的固定化纖維素酶。
2、 如權(quán)利要求1所述的腸溶衣材料固定化纖維素酶的制備方法，其特征在于所 述的載體腸溶衣材料Eudragit L-100溶液質(zhì)量體積比濃度為2 5%。
3、 如權(quán)利要求1所述的腸溶衣材料固定化纖維素酶的制備方法，其特征在于所 述的交聯(lián)劑EDC用量為0. 3g/g載體。
4、 如權(quán)利要求1所述的腸溶衣材料固定化纖維素酶的制備方法，其特征在于所 述的固定化纖維素酶中蛋白質(zhì)載量為10 100mg蛋白/g載體。
5、 如權(quán)利要求4所述的腸溶衣材料固定化纖維素酶的制備方法，其特征在于纖 維素酶液濃度為10 100mg/mL。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種腸溶衣材料固定化纖維素酶的制備方法。其步驟包括1)將腸溶衣材料Eudragit L-100均勻地分散于pH值5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液中；2)先后加入溶解于pH 5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液中的纖維素酶液和交聯(lián)劑EDC，室溫下緩慢攪拌固定3～6小時；3)用3M醋酸調(diào)節(jié)pH值為3.8，在5000rpm下離心10min；4)沉淀溶解于pH 5.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，即得到固定化纖維素酶。本發(fā)明可通過溶液pH的變化方便地實(shí)現(xiàn)固定化酶的均相酶解和異相回收，也能夠確保固定化酶在均相狀態(tài)下對不溶性纖維素材料的高效酶解，以及酶解后副產(chǎn)物木質(zhì)素的快速分離，具有反復(fù)使用多次，酶活保留率變化不大的優(yōu)點(diǎn)，制備過程簡單方便，可大大降低纖維素酶的使用成本，具有較好的推廣應(yīng)用價值。
文檔編號C12N11/00GK101225380SQ200810026158
公開日2008年7月23日 申請日期2008年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月31日
發(fā)明者呂鵬梅, 莊新姝, 宇 張, 東 李, 袁振宏, 許敬亮 申請人:中國科學(xué)院廣州能源研究所