專利名稱：紅樹(shù)植物根際促生固氮菌(dzy-n56)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種對(duì)紅樹(shù)林植物具有良好促生效果紅樹(shù)林根際固氮菌及 其制備生物固氮菌肥的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
紅樹(shù)林為自然分布于熱帶、亞熱帶海岸潮間帶的木本植物群落，覆蓋大約60-75%熱帶和亞熱帶 海岸，對(duì)維護(hù)海灣河口的生態(tài)平衡起重要作用，是海洋生產(chǎn)力的重要組成部分(Holguineta1.,2001)， 被認(rèn)為是具有較高生產(chǎn)力的生態(tài)系統(tǒng)。該生態(tài)系統(tǒng)具有較高的有機(jī)質(zhì)水平(全球每年凋落物為100Tg C)，為毗連的沿岸水域和相關(guān)的生物群落生境提供有機(jī)物(Holguin et al., 2001; Lugomela and Bergman, 2002)。然而紅樹(shù)林生態(tài)系統(tǒng)的無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)較貧乏，尤其是無(wú)機(jī)氮水平較低(Holguin et al.， 1992; Vazquez etal.,2000)，固氮生物的生物固氮被證明是紅樹(shù)林生態(tài)系統(tǒng)無(wú)機(jī)氮的主要來(lái)源(Hicks and Sylvester, 1985; Kyaruzi etal 2003)。生物固氮作為紅樹(shù)林生態(tài)系統(tǒng)和生源元素生物地球化學(xué)循環(huán)的重要環(huán)節(jié)， 對(duì)紅樹(shù)林生態(tài)系統(tǒng)及生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生極大的影響。由于人類的過(guò)度開(kāi)發(fā)、圍海造地和都市化等行為，使全球的紅樹(shù)林正以驚人的速度減少，據(jù)聯(lián)合 國(guó)糧農(nóng)組織保守的數(shù)據(jù)估算，紅樹(shù)林正以每年平均減少1-2%的速度消失，其速度甚至超過(guò)了珊瑚礁 和熱帶森林的消失速度。在發(fā)展中國(guó)家中，消失的速度更快，而紅樹(shù)林的90%以上位于發(fā)展中國(guó)家。 美國(guó)紅樹(shù)林行動(dòng)項(xiàng)目組負(fù)責(zé)人Aheredo (1999)認(rèn)為，熱帶亞熱帶國(guó)家曾在3/4的海岸線上分布有紅 樹(shù)林，現(xiàn)在僅剩下不到一半，而且大部分紅樹(shù)林為嚴(yán)重退化的生態(tài)系統(tǒng)。科學(xué)家預(yù)言，如果任其發(fā)展， 在未來(lái)的近100年內(nèi)，人類將徹底失去紅樹(shù)林(Duke， 2007)。近年來(lái)，紅樹(shù)林生態(tài)系統(tǒng)的維護(hù)和紅樹(shù)林植株的保育等研究成為熱門研究領(lǐng)域，也有多個(gè)國(guó)際組 織和團(tuán)體發(fā)起的旨在保護(hù)紅樹(shù)林的國(guó)際會(huì)議。《中國(guó)21世紀(jì)議程》(1994)優(yōu)先項(xiàng)目計(jì)劃中把紅樹(shù) 林恢復(fù)與重建技術(shù)納入了議事日程。ITTO組織，2002-2006年的計(jì)劃目標(biāo)亦把紅樹(shù)林生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)列 為首要資助目標(biāo)之一 (廖寶文，2005)。可見(jiàn)紅樹(shù)林濕地生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)工作亟需我們大力開(kāi)展，但 無(wú)論理論的研究還是實(shí)際恢復(fù)工作的開(kāi)展都面臨較大困難。紅樹(shù)林的恢復(fù)建設(shè)工作一直比較緩慢，這主要是由于紅樹(shù)林造林成活率極低(廖寶文，1999)。 墨西哥和印度等國(guó)家的科學(xué)家利用植物生長(zhǎng)促生菌(PGPB, plant growth-promoting bacteria)對(duì)紅樹(shù) 林進(jìn)行促生，取得了一定階段性進(jìn)展，但發(fā)現(xiàn)的適合紅樹(shù)林促生的菌種仍為少數(shù)，此類菌種依舊缺少 且多數(shù)被保密收藏。目前中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所正與墨西哥西北生物研究中心合作，引進(jìn)相關(guān)菌種對(duì)我 國(guó)主要紅樹(shù)植物進(jìn)行接種測(cè)試和相關(guān)菌劑研究，以期解決我國(guó)灘涂地段紅樹(shù)林造林成活率極低的棘手 問(wèn)題。然而，引進(jìn)菌種在我們國(guó)家紅樹(shù)林中的成活率小，并且也存在外種入侵所會(huì)產(chǎn)生的各種隱患。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一株從中國(guó)熱帶紅樹(shù)林中篩選分離，具有較高的生物固氮活性的紅樹(shù)植物根 際促生固氮菌新種。本發(fā)明的另一目的是提出所述的紅樹(shù)植物根際促生固氮菌在制備生物固氮菌肥的應(yīng)用。 本發(fā)明所提出的紅樹(shù)植物根際促生固氮菌，是從海南省三亞市的熱帶紅樹(shù)林區(qū)采集紅樹(shù)植物根際 沉積物樣品中分離出來(lái)的固氮菌新種。其分類命名為鞘氨醇單胞菌屬(印/H"go附oMos sp.) DZY-N56。 該菌于2007年7月28日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，地址中國(guó)武漢市武漢大學(xué))， 保藏編號(hào)CCTCCNO: M207120。本發(fā)明所述菌種的菌學(xué)特性描述如下革蘭氏陰性，桿狀，不產(chǎn)生孢子，0.2-0.4x1.6-2.5nm，細(xì)胞單個(gè)，也有較少成對(duì)(圖l-3)。氧化 酶反應(yīng)陰性，接觸酶陽(yáng)性，好氧或兼性厭氧。在Ashby、 LB以及BUG培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。耐鹽性較 好，可以在鹽分為5%的培養(yǎng)液中正常生長(zhǎng)。在Ashby培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)10d左右培養(yǎng)可以長(zhǎng)為直徑l-2cm 左右，胡蘿卜色、圓形、邊緣整齊表面較為干燥的凸起菌落。乙炔還原法(ARA)表明該菌可以利用 N2作為氮源，具有較高的生物固氮活性，純培養(yǎng)條件下，其固氮活性20-74umolC2H2h"mg"鮮重。從菌株(印/H'"go"w"os sp.) DZY-N56的純培養(yǎng)物提取基因組DNA，運(yùn)用固氮基因特定的引物 PolF/PolR (參考Poly et al., 2001)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增到較理想的目的條帶，證明該菌株具有生物 固氮基因(圖4)，其序列如SEQ2所示。運(yùn)用細(xì)菌16S rDNA全序列通用引物16SF/16SR (參考 Weisenburgetal.， 1998)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)測(cè)序分析得到16S rDNA序列，該菌株的16SrDNA的 全序列如SEQ1所示。通過(guò)GenBank中的BLAST軟件將16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列 進(jìn)行比對(duì)，在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有找到完全相似的序列，表明為首次發(fā)現(xiàn)的新基因序列。向基因庫(kù)成功遞交 新基因序列得到登錄號(hào)為EF202991。在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中選取了部分與測(cè)定的16S rDNA序列相似性較高的代表性基因序列，通過(guò) ClustalW軟件和Mega軟件以Neibor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖5)，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。從系 統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖5)可以看出與(5^/"gowo"ossp.) DZY-N56的16SrDNA序列與鞘氨醇單胞菌 S/^/"gowo"aspa朋/(AJ575818,2)同源性最相近，為97% (Query coverage為96%)。生理生化、BIOLOG 等結(jié)果進(jìn)一步顯示這兩種菌有明顯區(qū)別(如表l)。這表明菌株(5^ >zgomo"a$sp.) DZY-N56為一株 新的固氮菌種。表1 5^/w力gowowoy/ a朋/禾口 S^/z/wgo附owoy sp. strain DZY-N56兩禾中細(xì)菌指標(biāo)比較(+ :表示陽(yáng)性反應(yīng)；-:表示陰性反應(yīng))TestDZY陽(yáng)N56Pigmentation Growth at 37 °CHydrolysis of bis-pNP phosphateN-Acetyl-D-glucosamineL-rhamnoseD-fructoseSucroseD陽(yáng)cellobioseL-alanineYellow ++Yellow++ + + +4L畫Arabinose—+D-Galactose—+D-Maltose(+)+L-proline(+)+D-Mamiose(+)+D-trehalose(+)+L-Histidine——注S^/u"gcwo""j ; a/7"〖(AJ575818.2)的菌種性質(zhì)參考Hans-Jiirgen Busse，2005文章Description of two novel species, iS/ /2/"gyww7"j "6a"' sp.nov.and *Sp/ '"go/woW(iy戸朋/ sp.nov. DZY-N56數(shù)據(jù)為BIOLOG細(xì)菌自動(dòng)分析儀數(shù)據(jù)。用iS^W"gowowos sp, DZY-N56處理兩種紅樹(shù)，木欖(5n/gw/eragy附"oWz/2a)和紅海欖(及/^op/rora j(y/ora)，結(jié)果如表2所示。表2 >S^ >;go/noMav sp. DZY-N56對(duì)木欖和紅海欖肝處理45天后的影響主根長(zhǎng)度(cm)根生物量(g)葉面(cm2)地上(g)chl-achl-b總?cè)~綠素類胡蘿卜素木欖11,930.6419.012.281.250.6118.490.51對(duì)照8.010.357.521.780.820.319.680.18紅海欖11.260.3145.531.371.390.7220.930.4對(duì)照10.30.5431.461.990.880.2919.10.32注表中值均為10組平行樣平均值。生物量中重量指濕重；剩下重量均指干重。從表2中我們可以看出該菌對(duì)于木欖和紅海欖有著良好的促生作用。和對(duì)照組相比，木欖的葉面 積有著明顯的增大，提高幅度為152%;類胡蘿卜素的含量也顯著增加，為對(duì)照組的3.5倍。光合色素含量也有所增加，葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素分別增長(zhǎng)了 52%、 96%、和91%。對(duì)于紅海欖效 果則不如木欖明顯，葉面積增加了44%，光合色素中葉綠素增加了 148%。對(duì)該菌株進(jìn)行生物安全性實(shí)驗(yàn)，土壤接種法結(jié)果表明，在室溫條件下(28'C左右)，濕度60%—75% 條件下，該菌發(fā)酵液對(duì)海欖、紅海欖、木欖等均無(wú)致病能力，對(duì)紅樹(shù)植物的生長(zhǎng)安全無(wú)害。同時(shí)通過(guò) 用平板分離法檢測(cè)供試菌株檢出率、土壤原位固氮酶活性變化等指標(biāo)，結(jié)果顯示該菌接種后可以繼續(xù) 存活，可以顯著促進(jìn)土壤固氮酶活性增加。實(shí)驗(yàn)證明，用含有該菌的菌劑接種海欖、紅海欖和木欖等 紅樹(shù)植物可以明顯促進(jìn)植株生長(zhǎng)，因此，該菌可以作為制備促進(jìn)紅樹(shù)林植物生長(zhǎng)的生物固氮菌肥的應(yīng) 用。本發(fā)明將在以下方面產(chǎn)生有益效果該菌對(duì)于紅樹(shù)林植物的促生效果較好，可用于自然紅樹(shù)林生 態(tài)系統(tǒng)菌肥的生產(chǎn)工程菌，提高紅樹(shù)林生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力，有望用于紅樹(shù)林恢復(fù)、造林的艱巨任務(wù)中。


圖1、圖2、圖3是5^/"gomo"as sp. DZY-N56菌落、掃描、透射電鏡照片；圖4是印W"go/nowas sp. DZY-N56的基因組DNA以及擴(kuò)增到的16S rDNA和固氮基因w;/ /的電泳照 片；圖5是印WwgomoM^ sp. DZY-N56在16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中位置。
具體實(shí)施方式
一、材料與方法1、 材料1.1 土樣采集樣品采自海南省三亞市紅沙河沿岸紅樹(shù)林區(qū)木欖(份wg^ragv柳oA^)根際沉積物，樣品采集 后裝入滅菌的封口聚乙烯袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室低溫保存。 1.2培養(yǎng)基Ashby液體培養(yǎng)基甘露醇10.0g，KH2PO4'H2O0.2g , MgS04'7H20 0.2g， NaCl 0.2g， CaS04 O.lg, CaCO35,0g，去離子水1000mL， pH7.0。Ashby固體培養(yǎng)基Ashby液體培養(yǎng)基+2.2%瓊脂。改良DC)bereiner無(wú)氮液體培養(yǎng)基蔗糖10g,蘋果酸5.0g, K2HP04-H20 O.lg， KH2P04'H20 0.4g， MgS04.7H20 0,2g， NaClO.lg， Na2M。04'H20 0.002g, FeC13 O.Olg，去離子水lOOOml， pH7.0。LB培養(yǎng)基酵母提取物5g，胰蛋白胨10g， NaC110g，瓊脂1-2%，去離子水lOOOml, pH7.0。2、 方法2.1菌種分離將樣品混勻后取約lg于200ml Ashby、D6bereiner或者Ashby+D6bereiner無(wú)氮液體培養(yǎng)基(Ashby 培養(yǎng)基與DObereiner培養(yǎng)基以1: 1比例混合)中，30'C恒溫48h進(jìn)行加富培養(yǎng)。然后將菌液分別稀 釋至10—4、 10-5、 10-6三個(gè)稀釋度,各稀釋度的菌懸液以涂布法接種于Ashby固體培養(yǎng)基上，30°C 48h 培養(yǎng)后選擇典型的單一菌落進(jìn)一步純化。 2.2菌種純化將分離出的菌落，用接種針挑取典型的單一菌落，經(jīng)涂片染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，如所 分離的菌落不純，應(yīng)做系列稀釋后再次用平板涂布法分離，直至獲得純種。將純化后的菌株接種于無(wú) 氮Ashby固體培養(yǎng)基和LB全培養(yǎng)基甘油保存。 2.3液體培養(yǎng)中固氮酶活力測(cè)定采用乙炔還原法測(cè)定固氮活性(參考Capone 1993),將斜面保存的純菌株接種于10 ml液體改 良DObereiner培養(yǎng)基內(nèi)，于30'C搖床振蕩培養(yǎng)72 h，分別取1 ml于滅菌的5 ml小瓶中，蓋上橡皮塞。 用注射器從容器中抽走5%空氣，然后加入相同體積的乙炔氣體。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，1個(gè)空白對(duì) 照，對(duì)照容器中不加入乙炔氣體。所有樣品于3(TC孵育12 h，用SQ-204氣相色譜檢測(cè)乙烯的生成量。 乙炔還原法(ARA)表明該菌可以利用N2作為氮源，且具有較高的生物固氮活性，純培養(yǎng)條件下平 均固氮活性為20-74umolC2H2h—1 mg"鮮重。 2.4 DNA的提取與純化方法參考東秀珠《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》P409。2.5A^ /基因的擴(kuò)增采用固氮細(xì)菌的niffl基因通用引物PolF/PolR (參考Poly et al., 2001)進(jìn)行PCR擴(kuò)增PolF: 5'-TGCGA (C/T) CC (G/C) AA (A/G) GC (C/G/T) GACTC-3'， PolR: 5'-AT (G/C) GCCATCAT(C/T) TC (A/G) CCGGA-3'。 經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)后建立的適宜的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下 PCR反應(yīng)體系包括 PCR反應(yīng)程序是提取的模板(未稀釋)1 pl預(yù)變性95 °C 5 min上、下游引物(1 mM)各1^1變性95 °C 30 s10xPCR緩沖液5^1退火55°C 30 sMgCl2 (25 mM)4^1延伸72 °C 40 sdNTP混合液(各10mM)1H1后延伸72°C 10 min牛血清白蛋白(5mgml-l)1^1Ex-Taq酶(5Upl-l)0.4 pi無(wú)菌水34總討.50 pi30個(gè)循環(huán)取2pl PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，剩余的PCR產(chǎn)物直接交與Invitrogen生物技 術(shù)有限公司用ABI Prism 3730 XL DNA分析系統(tǒng)測(cè)序。得到332 bp的nifH序列。將序列直接遞交 Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)，序列號(hào)為EU707338。 2.6 16SrDNA全序列的擴(kuò)增DNA提取與純化見(jiàn)方法見(jiàn)東秀珠《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》P409。采用細(xì)菌16SrDNA全序列通 用引物16SF/16SR (Weisenburg et al., 1998), 16SF: 5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，， 16SR: 5 '-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3 ，，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)后建立的適宜的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下 PCR反應(yīng)體系包括 PCR反應(yīng)程序是提取的模板(未稀釋)1 pi預(yù)變性95 °C 5 min上、下游引物(ImM)各1^1變性95 °C 30 slOxPCR緩沖液5 nl退火55 °C 30 sMgC12 (25 mM)4^1延伸72 °C 1 mindNTP混合液(各10mM)1 pi后延伸72°C 10 min牛血清白蛋白(5mgml-l)1 piEx-Taq酶(5Upl-l)0.4 pi無(wú)菌水34 pi總計(jì)50 pi30個(gè)循環(huán)取2pl PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，剩余的PCR產(chǎn)物直接交與Invitrogen生物 技術(shù)有限公司用ABI Prism 3730 XL DNA分析系統(tǒng)測(cè)序。得到的16S rDNA序列。將序列直接遞交 Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)，序列號(hào)為EU707337。利用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比較，利用BLAST軟件將測(cè)定得到的基因序列與GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)分析，獲取相近 典型菌株的16S rDNA基因序列，然后利用BIOEDIT中的ClustalW對(duì)序列進(jìn)行排列，利用Mega中 的鄰接法(Neighbor-Joining)建立16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，其中的遺傳距 離用Tamura-Nei公式計(jì)算，枝長(zhǎng)代表了分歧程度，各枝上的數(shù)字是1000次bootstrap重抽樣分析的支 持百分比。2.7菌株制劑有效性試驗(yàn)將該菌(5^/H力gowowajsp. DZY-N56)接種到無(wú)氮Ashby液體培養(yǎng)基中，直至濃度為108cell/ml，待用。采用2種紅樹(shù)植物一木欖和紅海欖進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)。每種紅樹(shù)10個(gè)平行樣。外加對(duì)照。塑料盆放 在露天條件下，用已準(zhǔn)備好的菌液浸泡紅樹(shù)根部3-4h后栽種入塑料盆。45天后測(cè)量各個(gè)指標(biāo)。對(duì)比 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)為植物根、葉面積、植株重量、光合色素等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。序列表<110>中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所<120>紅樹(shù)植物根際促生固氮菌(DZY-N56)及其應(yīng)用<160>2<210>1<211>1412<212>DNA<213>鞘氨醇單胞菌屬(5^H'"gomowassp.) DZY-N56 <400>1TCGCCCTCGTCGTCATAGGTGGGATCACTCATGTCAAGTCGAACGAAGCCTTCGGGCTTA60GTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTGGGAATCTGCCCTTTGGTTCGGAATAACAGTTGGAA120ACGACTGCTAATACCGGATGATGACGAAAGTCCAAAGATTTATCGCCAGAGGATGAGCCC180GCGTAGGATTAGCTAGTTGGTGTGGTAAAGGCGCACCAAGGCGACGATCCTTAGCTGGTC240TGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC300AGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGATGAA360GGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTACCCGGGATGATAATGACAGTACCGGGAGAATAAG420CCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAA■TTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGCTTTGTAAGTTAGAGGTGAAAGCCTGGAGCTT540AACTCCAGAACTGCCTTTAAGACTGCATCGCTTGAATCCGGGAGAGGTGAGTGGAATTCC600GAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACT660GGACCGGTATTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGG720TAGTCCACGCCGTAAACGATGATAACTAGCTGTCCGGGGACTTGGTCTTTGGGTGGCGCA780GCTAACGCATTAAGTTATCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAAT840TGACGGGGGCCTGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACC900TTACCAGCGTTTGACATGTCCGGACGACTGGCAGAGATGCCTTTCTTCCCTTCGGGGACT960GGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCC1020GCAACGAGCGCAACCCTCGCCTTTAGTTACCATCATTTAGTTGGGTACTCTAAAGGAACC1080GCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGCGCT1140GGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAGTGGGCAGCAATCCCGCGAGGGTGAGCTA1200ATCTCCAAAAGCCGTCTCAGTTCGGATTGTTCTTTGCAACTCGAGAGCATGAAGGCGGAA1260TCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCAGGCCTTGTACACACC1320GCCCGTCACACCATGGGAGTTGGATTCACCCGAAGGCGTTGCGCCAACCCGCAAGGGAGC1380AGGCGAACCTTTTGTGTTTTTACTTGATATCT1412<210>2<211>338 <212>DNA
<213>鞘氨醇單胞菌屬(5^/H'"gomo"assp.) DZY-N56
<220>
<221>CDS
<400>2
TTGCGATCGA TCCCAAAGCG GACTCGACCC GCCTGATCTT GCACGCGAAG GCTCAGGACA 60 CCATCTTGTC GCTGGCCGCT GAAGCTGGTT CGGTGGAGGA CCTCGAACTG GAAGACGTGA 120 TGAAGGTCGG GTACCGCGAC ATCCGTTGCG TGGAATCCGG TGGCCCTGAG CCTGGGGTGG 180 GCTGCGCCGG CCGCGGCGTG ATCACTTCGA TCAACTTCCT GGAAGAAAAC GGCGCCTACG 240 AAGGCGTGGA CTATGTGTCC TACGACGTGC TGGGCGACGT GGTGTGCGGT GGCTTTGCCA 300 TGCCCATCCG TAGAACAAGC ACATGCATCT GCCCGCCC 338
權(quán)利要求
1、一種紅樹(shù)植物根際促生固氮菌，該菌是從熱帶紅樹(shù)林區(qū)的紅樹(shù)植物根際沉積物樣品中篩選分離出來(lái)的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas sp.)DZY-N56，含有如SEQ1所示的16Sr DNA序列和固氮基因nifH，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NOM207120。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅樹(shù)植物根際促生固氮菌，其特征在于該菌所含的固氮基因wy /含有如SEQ2所示序列。
3、 權(quán)利要求1所述的紅樹(shù)植物根際促生固氮菌在制備促進(jìn)紅樹(shù)林植物生長(zhǎng)的生物固氮菌肥的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種紅樹(shù)植物根際促生固氮菌(DZY-N56)及其應(yīng)用，該菌是從熱帶紅樹(shù)林區(qū)紅樹(shù)植物根際沉積物樣品中篩選分離出來(lái)的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas sp.)DZY-N56，含有固氮基因nifH和如SEQ1所示的16S rDNA，該菌保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NOM207120。該菌種具有較高的生物固氮活性，用含有該菌的菌劑接種海欖、紅海欖和木欖等紅樹(shù)植物可以明顯促進(jìn)植株生長(zhǎng)，因此可以作為制備促進(jìn)紅樹(shù)林植物生長(zhǎng)的生物固氮菌肥的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12R1/01GK101319198SQ20081002895
公開(kāi)日2008年12月10日 申請(qǐng)日期2008年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月23日
發(fā)明者娟 凌, 張燕英, 斌 楊, 楊志浩, 田新鵬, 董俊德 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所