專利名稱：一種細菌蛋白對抗生素抗性功能研究的技術方法
技術領域：
本發明涉及大腸桿菌(￡.o^)蛋白對抗生素抗性功能重要性研究的技術方法。
背景技術：
上半個世紀以來，抗生素的使用防治了絕大多數人類傳染病和非人類傳染病。然而， 由于人們濫用和非正確使用抗生素使得細菌產生了抗藥性。抗藥性細菌的產生對人類的健 康造成了巨大的威脅。而耐藥菌的防制尚不能完全寄托在新抗生素的發現和發明，因為抗 生素的生產與發展伴隨著細菌耐藥性的不斷發展， 一種新的抗生素投入使用后，很快就發 現有相應的抗性菌株出現。因此，深入研究細菌抗藥性的機理，對于發明防御耐藥細菌的 方法和防治耐藥菌具有重要的理論和現實意義。
細菌對抗生素抗性是一個多蛋白參與的事件。確定這些參與的蛋白質及其在耐藥中的 重要性對耐藥菌的防治具有重要意義，是當前細菌耐藥研究領域的重要研究方面。雖然目 前通過高通量的基因芯片和蛋白質組學研究可以發現許多參與細菌耐藥的分子，但由此也 產生如何從這些差異蛋白質中確定其重要性的問題。這實際上成為目前基于高通量技術研 究重要靶分子的瓶頸。因此，發明鑒定其中主要的關鍵蛋白可能對控制抗生素抗性新藥的研 究和開發提供直接信息，也可以為研究蛋白質抗生素抗性的重要性提供了新的技術方法。

發明內容
本發明的目的在于提供用基因缺失株傳代的方法評估在抗生素抗性中細菌蛋白質的重 要性的技術方法，以期為抗生素抗性新藥的研究和開發提供理想的分子靶標。
本發明通過用微量肉湯兩倍稀釋法測定大腸桿菌蛋白缺失菌株的最小抑菌濃度測定，
發現缺失TolC、 OmpT、 LamB或Dps后，最小抑菌濃度發生變化，而缺失FadL或OmpW 后，最小抑菌濃度不變。
本發明為評估大腸桿菌這些蛋白在抗生素耐藥中的作用，對上述蛋白的基因缺失株在 含1/2最小抑菌濃度鏈霉素G.125、g/mL)的培養基中連續培養10代，獲得相應的耐藥菌 株，并進行了最小抑菌濃度測定。結果表明與對照SM-R相比，缺失FadL后最小抑菌濃度 增加4倍；缺失Dps后增加2倍；而缺失其余蛋白不變。
本發明接著將相關蛋白缺失菌株耐藥菌ASM-R的最小抑菌濃度，分別除以相應的出 發菌株ASM-R-O的最小抑菌濃度，得到倍數變化，結果表明與ASM-R-0比較，缺失蛋白 TolC或OmpT后最小抑菌濃度降低2倍，缺失LamB或Dps后最小抑菌濃度增加2倍，而 缺失FadL或OmpW后最小抑菌濃度保持不變，說明在耐藥菌的誘導過程中，TolC、 OmpT、 LamB和Dps參與了耐藥過程。
在選擇耐藥菌株時，FadL， TolC和OmpT相對于其他蛋白具有更加重要的作用。 本發明為進一步深入研究這些蛋白對鏈霉素的抗性作用，對上述蛋白的基因缺失株和 耐藥菌株在含有抗生素培養基中進行了生存能力的評價，通過對生存率分析比對，發現TolC， OmpT和Dps可能在功能上直接與鏈霉素抗性相關，TolC和OmpT正向參與了鏈霉素耐藥 性的產生，而Dps負向參與了鏈霉素耐藥性的產生。這些結果證明我們發明的方法能夠有 效地評價相關耐藥蛋白的作用。
綜上所述，可以首先對大腸桿菌蛋白缺失菌株在抗生素溶液中進行傳代培養，接著對 這些耐藥菌株及其出發菌株進行最小抑菌濃度和生存率的測定和比較研究，得出細菌在抗 生素耐藥性產生過程中哪些是重要的蛋白，為研究￡. >/7的抗生素抗性提供新的技術方法。


圖1為用肉湯稀釋法測定的6種大腸桿菌蛋白缺失菌株ASM-R-0(Ato/C,A/a必，Aw^r，
Aowp『，A/""7B和A^/m')及其出發菌株(SM-R-O)對鏈霉素的最小抑菌濃度
圖2為蛋白耐藥缺失菌株ASM-R (Ato/C-R, A/aA-R， A(w^r-R， Ao柳p『-R， A/awB-R
和At/;w-R)及出發菌株的耐藥菌株(SM-R)對鏈霉素的最小抑菌濃度
圖3為蛋白缺失菌株耐藥菌與其對應的出發菌株的最小抑菌濃度的比較
圖4為蛋白缺失菌株ASM-R-0 (AtolC， AfadL， AompT， AompW， AlamB和Adps)
及其出發菌株(SM-R-O)對鏈霉素的生存率
圖5為蛋白耐藥缺失菌株ASM-R (Ato/C-R, A/a<iL-R， Awwpr-R， Awwp『-R， A/awS-R
和A^w-R)及出發菌株的耐藥菌株(SM-R)對鏈霉素的生存率
圖6為蛋白耐藥缺失菌株ASM-R與對應出發菌株ASM-R-O對鏈霉素生存率比率
圖7為蛋白耐藥缺失菌株ASM-R與對照菌株在不同濃度鏈霉素濃度時生存率倍數
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而 不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件， 例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(2001 by Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述
的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例l
大腸桿菌蛋白缺失菌株對鏈霉素(streptomycin, SM)的最小抑菌濃度測定
1. 細菌菌株來源大腸桿菌BW25113 (本試驗起始株，SM-R-O)來源于Nara Institute of Science and Technology, Japan。大腸桿菌蛋白基因缺失株(A/ad丄，Aww; r， Ao附; 『， A/a/wB禾卩A傘51)來源于Nara Institute of Science and Technology, Japan。大腸桿菌Ato/C基 因缺失株為本實驗室構建。
2. 蛋白缺失菌株的最小抑菌濃度測定
根據NCCLS程序，用微量肉湯兩倍稀釋法測定所有菌株的最小抑菌濃度，即抑制細 菌生長的最低濃度。試驗中6種大腸桿菌蛋白缺失菌株Ato/C, A/"d Ao"^r， Aow/;Pf， A/flw萬和A4w，命名為ASM-R-O。以SM-R-0為對照，最小抑菌濃度測定結果(圖l) 表明缺失TolC或OmpT后，最小抑菌濃度為3.125 、g/mL，與出發菌株SM-R-0相比 降低2倍；缺失LamB或Dps后，最小抑菌濃度為12.5 、g/mL，比出發菌株SM-R-0增 加2倍，而缺失FadL或OmpW后，最小抑菌濃度與出發菌株SM-R-0 —樣，為6.25 、g/mL。 最小抑菌濃度測定過程為挑取單克隆菌落于LB培養基中，37'C過夜培養。l:100(v/v) 接種于另一試管中，培養至00600=0.5，用MH培養基1:100進行稀釋。在96孔細胞板中 用MH培養基倍比稀釋鏈霉素溶液，每孔90、L。取10 、L上述稀釋好的細菌至含有相應 抗生素MH培養基中，約l()SCFU/mL， 37'C培養16h，觀察其最小抑菌濃度。
實施例2
蛋白缺失菌株耐藥菌的最小抑菌濃度測定
1. 蛋白缺失菌株對鏈霉素的耐藥菌的獲得
分別將大腸桿菌BW25113蛋白基因缺失菌株ASM-R-O以10s菌落形成單位/mL的數量， 在含l/2最小抑菌濃度鏈霉素(3.125、g/mL)的培養基中連續培養10代，將獲得的耐藥缺失 菌株命名為ASM-R，包括Ato/C-R, A/or近-R， Aow/ r-R， Aotwp『-R， A/ot^-R和A4w-R。 同時將對照菌株大腸桿菌BW25113 (SM-R-O)也按照同樣方法連續培養10代，獲得的菌株 命名為SM-R。
2. 蛋白耐藥缺失菌株對鏈霉素的最小抑菌濃度測定
按照上述同樣方法，測定ASM-R最小抑菌濃度，以SM-R為對照。結果見圖2。測定結 果表明，經過在含l/2最小抑菌濃度鏈霉素(3.125Ng/mL)的培養基中連續培養10代后，缺 失FadL后，最小抑菌濃度為100 、g/mL，與對照SM-R相比增加4倍；缺失Dps后，最小抑 菌濃度為50 、g/mL，與對照SM-R相比增力口2倍；而缺失其余蛋白，其最小抑菌濃度與SM-R
一樣，均為25 、g/mL。
實施例3
蛋白缺失菌株耐藥菌與其對應的出發菌株的最小抑菌濃度的比較 用蛋白缺失菌株耐藥菌ASM-R的最小抑菌濃度，分別除以相應的出發菌株ASM-R-C 的最小抑菌濃度，得到倍數變化，結果見圖3。與ASM-R-O比較，缺失蛋白TolC或OmpT 后最小抑菌濃度降低2倍，缺失LamB或Dps后最小抑菌濃度增加2倍，而缺失FadL或 OmpW后最小抑菌濃度保持不變。 實施例4
蛋白缺失菌株耐藥菌與其對應的出發菌株的抑制率比較
1. 蛋白缺失菌株ASM-R-O生存率測定
分別挑取ASM-R-0細菌的單菌落過夜培養，飽和后1:1,000 (v/v)稀釋到不含鏈霉素 和含有倍比稀釋鏈霉素濃度的一系列5mL LB培養液中，鏈霉素濃度從3.125到0.39 嗎/mL，每個濃度重復3次；以出發菌株SM-R-O為對照菌株。37°C200轉/分鐘培養6h后.. 在600nm波長處測定OD值。分別用在各個鏈霉素濃度的OD值除以不加鏈霉素的OD值， 即為菌株在此抗生素濃度下的生存率(圖4)。結果表明A/amB分別在0.39或1.562嗎/mL 鏈霉素中顯著降低(P〈0.05)或顯著增加(P〈0.01); /W/w在0.781禾P 1.562 pg/mL鏈霉素中顯 著增加(P〈0.05); AtolC在0.781ng/mL濃度下生存率極顯著下降。
2. 蛋白缺失菌株耐藥菌株ASM-R的抑制率測定
分別挑取ASM-R和SM-R細菌的單菌落過夜培養，飽和培養后1:1，000 (v/v)稀釋到 含有不同濃度鏈霉素的5mLLB培養液中，每個濃度重復3次；37°C200轉/分鐘培養6h后， 在600nm波長處測定OD值。ASM-R的抑制率結果見圖5。
在0.781, 1.562, 3.125, 4.683, 6.25嗎/mL各濃度下，A SM-R的生存率顯著高于其SM-R 菌株。在12.5嗎/mL鏈霉素濃度下，A/aJZ-R和A/fl"W-R生長快于SM-R; △ to/C-R, △ ow/ r-R， Aomp『-R, A^w-R生存率顯著低于對照SM-R。結果表明，缺失這6個蛋白可能 導致了鏈霉素抗性，同時說明了其在鏈霉素調控中的重要角色。發現TolC和OmpT對鏈霉 素耐藥菌株選擇中起到了正向的積極的作用，FadL， Dps起到負調節的作用。
3. 蛋白缺失菌株耐藥ASM-R與其對應的出發菌株ASM-R-0的抑制率比較 我們比較了在0.781, 1.562和3.125 U g/mL濃度下的△ SM-R-O和A SM-R生存率。其
比率是△ SM-R的OD值除以A SM-R-0的OD值的百分比(圖6)。在3.125嗎/mL濃度下， AtoIC-R/AtolC， AfadL-R/AfadL和AompT-R/AompT比率分別達到了 868.3， 958.4， 968.5'
分別是其對照的19.2， 21.2和21.5倍。這些結果表明，與其他缺失菌柱比較，缺失TolC， OmpT和FadL導致了細菌生存率的更加顯著的變化。
進一步，用上述比率在每一個濃度下與對照菌株進行比較，獲得其倍數變化情況(圖7)。
權利要求
1.一種抗生素抗性研究中評價相關蛋白重要性的技術方法，通過細菌蛋白基因缺失株在抗生素中傳代的方法，以評估相應基因在抗生素抗性中重要性。
2. 按權利要求1所述的抗生素抗性研究中評價相關蛋白重要性的技術方法，其特征在于首先測定細菌蛋白缺失菌株最小抑菌濃度和生存率；再通過將這些缺失菌 株在抗生素溶液中進行傳代培養，測定最小抑菌濃度和生存率；通過對這些耐藥 菌株及其出發菌株的最小抑菌濃度和生存率的比較研究，得出相應細菌蛋白在抗 生素耐藥性產生過程中的重要性。
全文摘要
本發明涉及用細菌基因缺失株傳代的方法評估在抗生素抗性研究中評價相關蛋白重要性的技術方法。本發明首先測定細菌蛋白缺失菌株最小抑菌濃度和生存率；再通過將這些缺失菌株在抗生素溶液中進行傳代培養，測定最小抑菌濃度和生存率；通過對這些耐藥菌株及其出發菌株的最小抑菌濃度和生存率的比較研究，得出相應細菌蛋白在抗生素耐藥性產生過程中的重要性，為研究細菌蛋白對抗生素抗性作用提供新的研究方法。
文檔編號C12Q1/02GK101343654SQ20081003014
公開日2009年1月14日 申請日期2008年8月14日 優先權日2008年8月14日
發明者彭宣憲, 惠 李, 王保成, 許文嬌 申請人:中山大學