專利名稱：：抗cd20四價抗體、其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及抗體領域，更具體地，本發明公開了一種抗四價抗體、其制備方法和其在制備抗B細胞淋巴瘤藥物方法的用途。
背景技術：
：惡性腫瘤是當今世界嚴重危害人類健康的疾病，在各種疾病所致死亡中高居第二位。非霍奇金淋巴瘤(NonHodgkin，sly即homa，NHL)是臨床最常見的淋巴系統惡性腫瘤，其中B細胞來源的約占85。/。，好發于青壯年，發病率和病死率呈逐年上升趨勢。根據病情特點，NHL可分為低、中、高三度。其中低度和部分中度NHL病程進展緩慢，統稱為惰性NHL。它們對首次化療敏感，但很容易復發或耐藥，當再次化療或放療時，療效明顯降低，因而被認為是難以治愈的惡性腫瘤。近年來，單克隆抗體及其導向治療NHL的臨床試驗研究取得了重大進展，其中被廣泛使用且富有成效的是抗CD20的單抗制劑。CD20抗原是一種B細胞分化抗原，僅位于前B細胞和成熟B細胞，它在95y。以上的B細胞性淋巴瘤中表達，且表面密度很高，而在造血干細胞、血漿細胞和其他正常組織中不表達。更為重要的是，CD20分子在與單克隆抗體結合后，無顯著內化及脫落，故成為治療B細胞淋巴瘤的理想耙點[SacchiS，FedericoM，DastoliG，FioraniC，VinciG，CloV，CasolariB.TreatmentofB-cellnon-Hodgkin，slymphomawithantiCD20monoclonalantibodyRituximab.CritRevOncolHematol，2001，37(1):13-25]。目前采用抗CD20抗體治療非霍奇金淋巴瘤已取得了較好的療效。Rituxan(Rituximab，C2B8)為美國基因科技公司研制的以CD20為耙點的單克隆抗體，它是一種人鼠嵌合基因工程抗體，包含了鼠單克隆抗體的可變區基因和入抗體的恒定區基因[ReffME，CarnerK，ChambersKS，ChinnPC，LeonardJE，RaabR，NewmanRA，HannaN,AndersonDR.DepletionofBcellsinvivobyachimericmousehumanmonoclonalantibodytoCD20.Blood.1994,83(2):435-45.]。Rituxan己于1997年11月獲FDA的批準上市，用于復發性或頑固性低度或濾泡性非霍奇金淋巴瘤的臨床治療[LegetGA，CzuczmanMS.L'seofrituximab，thenewFDA-approvedantibody.CurrOpinOncol.1998;10:548-551]。盡管C2B8抗體在臨床治療中已顯示出較好的療效，仍有52%的病人對C2B8治療不產生反應。因此，尋求更為有效用于治療B淋巴瘤的CD20抗體藥物顯得尤為迫切。已有許多相關的研究闡述了抗CD20單克隆抗體可能的作用機制，主要包括撲體介導的細胞溶解作用(CDC作用)，抗體依賴細胞介導的細胞毒作用(ADCC)和對腫瘤細胞的誘導凋亡作用(Apoptosis)及生長抑制作用。而對于抗CD20抗體主要通過其中何種機制發揮抗腫瘤作用仍存在爭論中。'可是，目前變得越來越清楚的是，這些機制不是互相孤立地、而是互相協同地發生作用[EisenbeisCJF，CaligiuriMA，ByrdJC.Rituximab:convergingmechanismsofactioninnon-Hodgkin，slymphomaClinCancerRes.2003;9:5810-5812.]。因此我們推測，對于C2B8抗體治療不敏感的病人或許會對其它類型和結構的、發揮不同生物學功能的抗CD20抗體產生反應。抗CD20抗體根據其體外生物學功能的不同可以分為兩型I型CD20抗體包括C2B8和其它大部分CD20抗體，主要通過CDC功能發揮作用而凋亡作用很弱；而II型CD20抗體包括B1和11B8，主要通過凋亡發揮作用而CDC功能很弱。除了I型抗體C2B8獲批準用于臨床治療以外，II型抗體Bl與mI偶聯制備的標記抗體藥物Tositumomab也已獲得批準用于非霍奇金氏淋巴瘤的治療。更為重要的是，臨床前試驗已經表明11B8的裸抗體同':"I標記的11B8抗體同樣有效[BuchsbaumDJ，WahlRL，NormolleDP，I^aminskiMS.Therapywithunlabeledand1311-labeledpan-B-cellmonoclonalantibodiesinnudemicebearingRajiBurkitt'slymphomaxenografts.CancerRes.1992:52:6476-6481]。因此，由于這兩型抗體具有明顯不同的生物學活性，對于I型抗體治療不敏感的病人很可能將會對II型的治療產生反應，而反之亦然。由此，我們想到，如果一種抗體既有很強的CDC作用又具備很強的誘導凋亡的能力，它或許可以更為有效的殺傷CD20+腫瘤細胞。經二抗交聯后的CD20抗體具有明顯增強的誘CD20+細胞凋亡的作用[ShanD,LedbetterJA,PressOW.ApoptosisofmalignanthumanBcellsbyligationofCD20withmonoclonalantibodies.Blood.1998;91:1644-1652]，因為這種方法用于體內治療則不可行，因而人們繼續致力于制備新型有效的抗體分子。研究表明，成為二聚體形式的抗體，其凋亡作用和生長抑制作用均可明顯增強[GhetieMA，BrightH，VitettaES.HomodimersbutnotmonomersofRituxan(chimericanti-CD20)induceapoptosisinhumanB-lymphomacellsandsynergizewithachemotherapeuticagentandani讓unotoxin.Blood.2001;97:1392-1398.]。但是，通過化學交聯法產生二聚體的方式存在很多缺陷，主要是二聚體抗體的分子量大(300kDa)和半衰期短[WolffEA，SchreiberG丄CosandWL，RaffHV.Monoclonalantibodyhomodimers:enhancedantitumoractivityinnudemice.UmcerRes.1993:53:2560-2565.GhetieMA，PodarEM，IlgenA，GordonBE,UhrJW，VitettaES.Homodimerizationoftumor—reactivemonoclonalantibodiesmarkedlyincreasestheirabilitytoinducegrowtharrestorapoptosisoftumorcells.ProcNatlAcadSciUSA.1997:94:7509-7514.]。
發明內容為了解決上述問題，本發明的申請人進行了大量的實驗，采用基因工程技術構建了兩種I型抗體C2B8和2F2的四價基因工程抗體，2F2是一種全人源抗CD20單克隆抗體，其CDC作用強于C2B8抗體。本發明公開的四價抗CD20抗體和原親本抗體都可以與Raji細胞特異性結合，而且其相對親和力相似，但本發明公開的四價抗CD20抗體有更強的凋亡誘導作用和生長抑制功能，并具有能顯著提高荷瘤小鼠的生存率的優點。實驗結果表明，本發明公開的四價抗體雖然具有四個抗原結合位點，構建的四價抗體的分子量只比親本兩價抗體大25KDa，其在小鼠體內的血漿半衰期稍長于親本二價抗體，表明這種四價抗體的結構高度穩定；本發明的申請人進而通過體內外試驗比較四價抗體和原親本二價抗體的抗腫瘤活性[按Teeling幾，FrenchRR，CraggMS，etal.CharacterizationofnewhumanCD20monoclonalantibodieswithpotentcytolyticactivityagainstnon-Hodgkinlymphomas.Blood.2004;104:1793-1800進行]，研究結果表明，2F2的四價抗體2F2(ScFvHL)廣Fc不僅具有與其親本兩價抗體2F2相同的CDC和ADCC活性，而且在促腫瘤細胞凋亡和生長抑制功能上較原二價抗體均有明顯增強，甚至強于C2B8的四價抗體C2B8(ScFvHL)rFc。體內免疫治療實驗更進一步證體2F2(ScFvHL)廠Fc在延長荷瘤SCID小鼠的生存期上明顯強于其它可以成為B淋巴瘤的治療提供新型抗體藥物。利用基因工程技術構建了四價抗CD20抗體，本發明公開了1，一種抗CD20四價抗體；2，上述1所述的抗CD20四價抗體為C2B8(ScFvHL)廠Fc;3，上述2的抗CD20四價抗體，其氨基酸序列為SEQIDNO:18;4，編碼上述3所述抗體的核苷酸序列，為SEQIDN0:17;5，上述1所述的抗CD20四價抗體為2F2(ScFvHL)廠Fc;6，上述5所述的抗CD20四價抗體，其氨基酸序列為SEQIDN0:20;./，編碼上述6所述抗體的核苷酸序列，為SEQIDN0:198，制備上述的抗CD20四價抗體的方法，包括a.構建CD20單抗c2B8或2F2的單鏈抗體ScFv并克隆獲得人抗體IgGlFc基因；b.將2個相同的單鏈抗體基因串聯連接后再與人抗體Fc段基因相連得到融合基因；c.將上述融合基因克隆到真核表達載體pcDNA3.1(+)，構建成真核表達載體pcDNA3.1(C2B8(ScFvHL)2Fc)或pcDNA3.1(2F2(ScFvHL)2Fc);d.表達載體pcDNA3.1(C2B8(ScFvHL)2Fc)或pcDNA3.1(2F2(ScFvHL)2Fc)轉染CHO細胞，篩選，進行亞克隆，將篩選得到的高表達克隆用擴大培養，分離純化即得。9.一種制劑，含有上述l、2、3、5、6任一所述的抗體和可藥用的載體。實，四價抗三種抗體，10.上述l、2、3、5、6、9任一所述的抗體或制劑在制備抗B細胞淋巴瘤的藥物中的用途。11.上述10的用途，其中B細胞淋巴瘤為非霍奇金淋巴瘤。12.上述11的用途，其中非霍奇金淋巴瘤為低度和部分中度非霍奇金淋巴瘤。13.上述10的用途，其中B細胞淋巴瘤為慢性淋巴性白血病。更具體地，本發明的申請人通過大量實驗，首先分別構建了CD20單抗C2B8及2F2的單鏈抗體ScFvHL及ScFvHL，并克隆獲得了人抗體IgGl，k的重鏈恒定區基因。在此基礎上采用分子克隆技術分別將單鏈抗體基因與人抗體Fc段基因相連，進一步將上述融合基因克隆到真核表達載體pcDNA3.1(+)，分別構建成真核表達載體pcDNA3.1(C2B8(ScFvHL)2Fc)及pcDNA3.1(2F2(ScFvHL)2Fc)。將表達載體pcDNA3.1(C2B8(ScFvHL)2Fc)和pcDNA3.1(2F2(ScFvHL)2Fc)分別用脂質體法共轉染CH0細胞，用500ug/ml的G418篩選陽性細胞克隆。將篩選得到的高表達克隆用無血清培養基擴大培養，用ProteinA親和柱分離純化抗CD20四價抗體C2B8(ScFvHL)4-Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc。對于本發明，任何合適的真核表達載體都可以使用，這些載體可以為pCDNA3.1(+)，pDRl(圖l)，pDHFF之一。本發明的申請人對上述的四價抗CD20抗體進行了體外、體內生物學實驗，體外生物學實驗結果表明C2B8、2F2、抗CD20四價抗體C2B8(ScFvHL)廠Fc和22(GcFvHL)4-Fc都能很好地與Raji細胞特異性結合，而且它們的相對親和力相似。但四價抗體C2B8(ScFvHL)4-Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc的解離速率分別明顯低于它們各自的親本抗體C2B8和2F2;雖然具有四個抗原結合位點，四價抗體的分子量只比親本兩價抗體大25KDa;四價抗體在小鼠體內的血漿半衰期稍長于親本二價抗體，表明這種四價抗體的結構高度穩定；四價抗體不僅具有與親本抗體相同的CDC和ADCC活性，而且在促腫瘤細胞凋亡和生長抑制功能上較原二價抗體均有明顯增強，其中，四價抗體2F2(ScFvHL)rFc的作用最強，它在2ug/ml和10ug/ml時誘導了約30%左右Daudi細胞和23%左右Raji細胞的凋亡，而四價抗體C2B8(ScFVHL)4-Fc的作用次之，它使19%左右的Daudi細胞和16呢左右的Raji細胞發生了凋亡。同樣，2F2(ScFvHL)4-Fc具有最強的抑制腫疴細胞增殖的能力，它在2ug/ml以上濃度時的抑制率分別為約95%(Daudi細胞)和88%(Raji細胞)，其作用強于C2B8(ScFvHL)4-Fc抗體，后者在2ug/ml以上濃度時的抑制率分別為約82%(Daudi細胞)和76%(Raji細胞)。體內免疫治療實驗結果更進一步證實，四價抗體2F2(ScFvHL)fFc在延長荷瘤SCID小鼠的生存期上明顯強于其它三種抗體(C2B8，2F2和C2B8(ScFvHL)4--Fc)。以上實驗結果說明這兩種抗CD20四價抗體C2B8(ScFvHL)廠Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc的抗腫瘤療效均明顯優于它們各自的親本抗體c2B8和2F2。而2F2(ScFvHL)rFc的抗腫瘤療效最好。本發明公開上述抗CD20四價抗體，可以和藥學上可以接受的輔料一起組成藥物制劑組合物從而更穩定地發揮療效，制劑可為制藥領域常用的混懸、水針、凍干等制劑，優選水針或凍干制劑，對于本發明公開的上述抗CD20四價抗體的水針或凍干制劑，藥學上可以接受的輔料包括表面活性劑、溶液穩定劑、等滲調節劑和緩沖液之一或其組合，其中表面活性劑包括非離子型表面活性劑如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐溫20或80);poloxamer(如poloxamer188);Triton;十二烷基硫酸鈉(SDS);月桂硫酸鈉；十四烷基、亞油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics;M0NAQUATTM等，其加入量應使抗CD20四價抗體顆粒化趨勢最小，溶液穩定劑可以為糖類，包括還原性糖和非還原性糖，氨基酸類包括谷氨酸單鈉或組氨酸，醇類包括三元醇、高級糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其組合，溶液穩定劑的加入量應該使最后形成的制劑在本領域的技術人員認為達到穩定的時間內保持穩定狀態，等滲調節劑可以為氯化鈉、甘露醇之一，緩沖液可以為TRIS、組氨酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液之一。上述制劑為包含抗CD20四價抗體的組合物，在對包括人在內的動物給藥后，抗腫瘤效果明顯。具體來講，對腫瘤的預防和/或治療有效，可以作為預防和/或治療腫瘤的藥物使用。本發明中抗CD20四價抗體及其組合物在對包括人在內的動物給藥時，給藥劑量因病人的年齡和體重，疾病特性和嚴重性，以及給藥途徑而異，可以參考動物實驗的結果和種種情況，總給藥量不能超過一定范圍。具體講靜脈注射的劑量是0.13000mg/天。本發明公開的抗CD20四價抗體及其組合物還可以和其他的抗腫瘤藥聯合給藥，用于腫瘤的治療，這些抗腫瘤藥包括l、細胞毒類藥物(1)作用于DNA化學結構的藥物烷化劑如氮芥類、亞硝尿類、甲基磺酸酯類；鉑類化合物如順鉑、卡鉑和草酸鉬等；絲裂霉素(MMC);(2)影響核酸合成的藥物二氫葉酸還原酶抑制劑如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制劑如氟尿嘧啶類(5FU、FT—207、卡培他濱)等；嘌呤核苷合成酶抑制劑如6—巰基嘌呤(6—MP)和6—TG等；核苷酸還原酶抑制劑如羥基脲(HU)等；DNA多聚酶抑制劑如阿糖胞苷(Ara-C)和健擇(Gemz)等；(3)作用于核酸轉錄的藥物選擇性作用于DNA模板，抑制DNA依賴RNA聚合酶，從而抑制RNA合成的藥物如放線菌素D、柔紅霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光輝霉素等；(4)主要作用于微管蛋白合成的藥物紫杉醇、泰索帝、長春花堿、長春瑞濱、鬼臼鹼類、高三尖杉酯堿；(5)其他細胞毒藥門冬酰胺酶主要抑制蛋白質的合成；2、激素類抗雌激素三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制劑氨魯米特、蘭特隆、來曲唑、瑞寧德等；抗雄激素:氟它氨RH-LH激動劑/拮抗劑諾雷德、依那通等；3、生物反應調節劑主要通過機體免疫功能抑制腫瘤干擾素；白細胞介素一2;胸腺肽類；4、單克隆抗體Cetuximab(C225);赤赤賽汀(Trastuzumab)Bevacizumab(Avastin);5、其他括一些目前機制不明和有待進一步研究的藥物；細胞分化誘導劑如維甲類；細胞凋亡誘導劑。本發明公開的抗CD20四價抗體及其組合物可以和上述的抗腫瘤藥物之一或其組合聯合用藥。本發明所指的B細胞淋巴瘤，包括B細胞慢性淋巴細胞白血病，B細胞原淋巴細胞淋巴瘤，濾泡淋巴瘤，毛細胞白血病，Burkitt淋巴瘤，淋巴漿細胞淋巴瘤等，這里不再一一列舉。本發明所稱的抗腫瘤藥物，指具有預防和/或治療腫瘤的藥物，可以包括伴隨腫瘤生長相關癥狀發展的延遲和/或這些癥狀嚴重程度的降低，它進一步還包括已存在的腫瘤生長伴隨癥狀的減輕并防止其他癥狀的出現，還也減少或防止-圖1.pDRl表達載體結構示意圖；hCMVpro表示人巨細胞病毒MajorImmediate早期啟動子，.BGHpA表示Bovinegrowthhormone多腺苷化信號；SV40ori表示SV40病毒早期復制起點；DHFR表示二氫葉酸還原酶基因；PUCorigin為質粒復制起點；AMP為氨芐青霉素抗性基因；圖2.C2B8(ScFvHL)2Fc或2F2(ScFvHL)2Fc的基因結構圖3.抗CD20四價抗體C2B8(ScFvHL)4-Fc禾B2F2(ScFvHL)4-Fc結構圖；圖4.四價抗體與原二價抗體的SDS-PAGE電泳圖譜。道1，分子量蛋白Maiker;道2，C2B8;道3，2F2;道4，C2B8(ScFvHL)4-Fc;道5，2F2(ScFvIIL)4-Fc。圖5四價抗體與原二價抗體的蛋白質印跡免疫分析。道1，分子量蛋白Marlor;道2，C2B8;道3，2F2;道4，C2B8(ScFvHL)4-Fc;道5，2F2(ScFvHL)4-Fc。圖6抗CD20四價抗體的活性鑒定結果。圖6-1抗體與Raji細胞的結合力；圖6-2，C2B8(ScFvHL)4-Fc與原親本二價抗體C2B8競爭與Raji細胞的結合；圖6-3，2F2(ScFVHL)4-FC與原親本二價抗體2F2競爭與Raji細胞的結合；圖6-4，抗CD20抗體與人補體成分Clq的結合；圖6-5，抗CD20抗體與FcR(U937細胞)的結合；圖6-6，抗CD20抗體解離率的檢測。圖7抗CD20抗體誘導的CDC和ADCC作用結果，各圖中橫坐標為抗體濃度，單位ug/ml。.圖8抗CD20抗體誘導的凋亡作用結果。圖8-1抗CD20抗體誘導Daudi細胞凋亡作用結果，圖8-2抗CD20抗體誘導Raji細胞凋亡作用結果。'圖9抗CD20抗體對腫瘤細胞的生長抑制作用。Daudi(圖9-1)和Raji(圖9-2)細胞分別與不同濃度的抗CD20抗體于C0J咅養箱孵育，臺盼藍拒染法每日計數細胞，共計數五日。Daudi(圖9-3)和Raji(圖9-4)細胞分別與不同濃度的抗CD20抗體于C02培養箱孵育，第五日用MTT染色法測定細胞生長抑制率。圖10抗CD20抗體對荷瘤小鼠中治療作用。PBS();Anti-her2();C2B8(參);2F2(□);C2B8(ScFvHL)4-Fc(▲);2F2(ScFvHL)4-Fc(■),其中橫坐標為天數，縱坐標為存活率(百分比)。具體實施方式以下實施例、實驗例僅對本發明進行進一步的說明，不應理解為對本發明的限制。實施例不包括對傳統方法的詳細描述，如那些用于構建載體和質拉的萬法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質粒的方法或將質粒引入宿主細胞的方法.這樣的方法對于本領域中具有普通技術的人員是眾所周知的，并且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiais，T.(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndedition，ColdspringHarborLaboratoryPress.實施例1.抗CD20單鏈抗體的基因構建'參照美國專利6，399,061公開的抗人CD20單抗資料及序列，委托上海生工生物工程有限公司全基因合成抗人CD20單克隆抗體C2B8的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(V,.)基因。SEQIDN0:1和SEQIDNO:2分別顯示了C2B8單抗的重鏈可變區的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQIDNO:3和SEQIDNO:4分別顯示了2B8單抗的輕鏈可變區的核苷酸序列和氨基酸序列。采用OverlappingPCR的方法將2B8重鏈可變區的3'-端通過(Gl^Ser)3接頭與其輕鏈可變區的5'-端融合，構成單鏈抗體基因C2B8(ScFvHL)。SEQIDN0:5和SEQIDNO:6分別顯示了(Gly4Ser)3接頭的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQIDNO:7和SEQIDNO:8分別顯示了C2B8(ScFvHL)的核苷酸序列和氨基酸序列。將PCR產物克隆到pGEM-T載體(Promega公司產品)，測序驗證后確認獲得了正確的克隆。本例中的正確克隆記作pGEM-T/C2B8(ScFvHL)。參照PCT專利WO2004/035607A2公開的抗人CD20單抗資料及序列，委托上海生工生物工程有限公司全基因合成抗人CD20單克隆抗體2F2的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(V,)基因。2F2單鏈抗體基因2F2(ScFvHL)的構建方法同C2B8單鏈抗體基因C2B8(ScFvHL)的構建方法。SEQIDNO:9和SEQIDN0:10分別顯示了2F2(ScFvHL)的核苷酸序列和氨基酸序列。最后將構建好的2F2(ScFvHL)基因克隆到pGEM-T載體(Promega公司產品)，測序驗證后確認獲得了正確的克隆。本例中的正確克隆記作pGEM-T/2F2(ScFvHL)。實施例2.人抗體重鏈恒定區基因的克隆用淋巴細胞分離液(鼎國生物技術發展公司產品)分離健康人淋巴細胞，用Trizol試劑(Invitrogen公司產品)提取總RNA，根據文獻(NucleicAcidsResearch,1982，10:4071-4079)報道的序列分別設計引物CH有義GCTTCCACCAAGGGCCCATC和引物CH反義TTTACCGGGAGACAG采用PCR反應擴增抗體重鏈恒定區基因。PCR反應采用熱啟動，反應條件94"C5分鐘；94nC45秒，60°C45秒，72°C1分10秒，30個循環；72nC10分鐘。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳純化回收并克隆到PGEM-T載體中，測序驗證后確認獲得了正確的克隆。SEQIDNO:ll和SEQIDNO:12分別顯示了重鏈恒定區(CH)的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正確克隆記作pGEM-T/CH。實施例4.構建抗CD20四價抗體以pGEM-T/CH為模板，設計引物Fc有義GAATTCGCCGCTGCAGAGCCCAAA1CT(XCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA和Fc反義TCTAGATCATTTACCGGGAGACAGGGA通過PCR反應擴增獲得人抗體IgGl的Fc基因，使其5'含有限制酶位點EcoRI，3'端含有限制酶位點Xbal，并將Fc基因中的Hinge區改為HingeM。SEQIDNO:13和SEQIDNO:14分別顯示了Fc的核苷酸序列和氨基酸序列。經瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產物并克隆到pGEM-T載體中，記作pGEM-T(Fc)，篩選陽性克隆測序。將測序正確的Fc基因用EcoRI和XbaI雙酶消化從pGEMT載體中切下，克隆到pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司產品)中，構建成pcDNA3.1(Fc)載體。將質粒pcDNA3.l(Fc)用HindIII和EcoRI雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳后純化回收酶切片斷pcDNA3.lFc。以pGEM-T/C2B8(ScFvHL)為模板，設計引物C2B8(ScFvHL)1有義AAGCTTCTACAGCAGCCTGGGGCTGAG和C2B8(ScFvHL)1反義GCTAGCTCGTTTGATCTCCAGCTTGGTC通過PCR擴增獲得抗CD20單鏈抗體基因并使其5'含有限制酶位點HindIII，3'端含有限制酶位點Nhel。經瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產物并克隆到pGEM-T載體中，記作pGEM-TC2B8(ScFvHL)1，篩選陽性克隆測序。將測序正確的克隆用HindII工和Nhel雙酶消化，回收酶切片斷C2B8(ScFvHL)1。以pGEM-T/C2B8(ScFvHL)為模板，設計引物C2B8(ScFvHL)2有義GCTAGCACTGGTAGTCAGGTACAACTACAGCAGCCTGGGGCTGAGCTG和C2B8(ScFvHL)2反義GAATTCTCGTTTGATCTCCAGCTTG通過PCR擴增獲得抗CD20單鏈抗體基因并使其5'含有限制酶位點Nhel，3'端含有限制酶位點EcoRI。經瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產物并克隆到pGEM-T載體中，記作pGEM-TC2B8(ScFvHL)2，篩選陽性克隆測序。將測序正確的克隆用Nhel和EcoRI雙酶消化，回收酶切片斷C2B8(ScFvHL)2。'將上述獲得的三個酶切片斷C2B8(ScFvHL)1、C2B8(ScFvHL)2以及pcDNA3.1Fc用T4DM連接酶(Invitrogen公司產品)進行連接，構建成真核表達載體pcDNA3.1(C2B8(ScFvHL)2Fc)。附圖2為C2B8(ScFvHL)2Fc的基因結構圖。兩個單鏈抗體之間有一個長度為15氨基酸的接頭，SEQIDNO:15和SEQIDNO:16分別顯示了接頭的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQIDNO:17和SEQIDNO:18分別顯示了C2B8(ScFvHL)2Fc的核苷酸序列和氨基酸序列。采用與C2B8(ScFvHL)2FC融合基因構建方式相同的方法構建2F2四價抗體的^達載體pcDNA3.1(2F2(ScFvHL)2Fc)。附圖2為2F2(ScFvHL)2Fc的基因結構圖。SEQIDN0:19和SEQIDN0:20分別顯示了2F2(ScFvHL)2Fc基因的核苷酸序列和氨基酸序列。于3.5cm組織培養皿中接種3.5X107孔的CHO細胞，培養至90-95%融合時進行轉染取10ugpcDNA3.1(C2B8(ScFvHL)2Fc)或rcDN3.1(2F2(ScFvHL)2Fc)質粒分別禾卩20w1Lipofectamine2000試劑[Invitrogen公司產品]分別溶于500u1無血清DMEM培養基，室溫靜置5分鐘，將以上2種液體混合，室溫孵育20分鐘以使函A-脂質體復合物形成，其間用3ml無血清的匿EM培養基替換培養皿中的含血清培養基，然后將形成的DNA-脂質體復合物加入到板中，C02孵箱培養4小時后補加3ml含10%血清的DMEM完全培養基，置于C02孵箱中繼續培養。轉染進行24小時后將細胞按0.8X107皿傳到10cm培養皿中，加入500ug/ml的G418篩選陽性細胞克隆。將篩選得到的高表達克隆用無血清培養基(JRHBiosciences公司產品)擴大培養，用ProteinA親和柱(GE公司產品)分離純化CD20四價抗體C2B8(ScFvHL)4-Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc。將純化抗體用PBS進行透析，最后以紫外吸收法定量。附圖3為四價抗體C2B8(ScFvHL)4-Fc或2F2(ScFvHL)4-Fc的結構圖。實驗例實驗例1抗體的標記實驗用透析標記法標記抗體用0.025MPH9.5的碳酸鹽緩沖液將預標記的抗體(C2B8、2F2、C2B8(ScFvHL)4-Fc、2F2(ScFVHL)Fc或抗人her2的人源化抗體Trastuzumab(Anti-her2))稀釋成1%濃度，裝入透析袋中。用同一緩沖液將FITC配成0.lmg/ml的溶液盛于小燒杯中，使透析袋浸沒于FITC溶液中，在4。C避光攪拌24h。取出透析袋中標記液，用SephadexG-50過柱，去除游離熒光素，收集熒光抗體備用。C2B8和Trastuzumab購自羅氏(中國)有限公司。2F2抗體由我們按照文獻[LiBH，WangH，DaiJX，JiJJ，QianWZ，ZhangDP,HouS，GuoYJ.Constructionandcharacterizationofahum.anizedanti-humaiiL.D3monoclonalantibody12F6witheffectiveimmunoregulationfunctions.Immunology.2005，116(4):487-98]中制備抗人CD3人源化抗體hul2F6的方法自行構建制備獲得。實驗例2SDS-PAGE和Western-blot檢測四價抗體純化后的四價抗體分別在非還原(6%)和還原(12%)條件下用聚丙烯酰氨授膠電泳檢測其純度和分子量大小(圖4)，同時通過Western-blot進一步鑒定其性質和分子量(圖5)。Western-blot方法如下將電泳后的膠通過電轉移的方法轉移至PVDF膜上，封閉后加入HRP標記的羊抗人IgG(H+L)，PBST洗兩遍，最后DAB法顯色。聚丙烯酰氨凝膠電泳和Western-blot的結果顯示在還原條件下，C2B8抗體和2F2抗體均呈現為分子量大小約55KDa和25KDa的重鏈和輕鏈，而四價抗體C2B8(ScFvHL)4-Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc則被還原為一條帶，其分子量大小約為93KDa。在非還原條件下，所有抗體均呈現一條帶，它們的大小分別為150KDa(C2B8抗體)，162KDa(2F2抗體)，175KDa(C2B8(ScFvHL)4-Fc抗體)禾卩186KDa(2F2(ScFvHL)4-Fc)'。這些結果表明，我們所構建的四價抗體雖然具有四個抗原結合位點，其分子量卻只比原來親本抗體大25KDa。實驗例3抗CD20四價抗體的活性測定流式細胞術檢測四價抗體與Raji細胞的結合力實驗lxl06/ml的Raji細胞與不同濃度FITC標記的四價抗體在4°C共孵育1小時后，流式細胞儀檢測熒光強度。與Raji細胞的結合力實驗結果顯示(圖6-l)，四價抗體C2B8(ScFvHL)4-Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc與它們各自對應的C2B8抗體和2F2抗體具有相似的結合曲線，均呈濃度梯度依賴性，表明它們具有與C2B8和2F2抗體相同的與CD20抗原的結合能力。熒光競爭結合實驗.將亞飽和濃度FITC標記的C2B8或2F2抗體(C2B8-FITC或2F2-FITC)與不同濃度的抗CD20抗體混合后與lxl06/ml的Raji細胞孵育(4°C，1小時)，流式細胞術檢測熒光強度。實驗結果表明四價抗體具有與原二價抗體相似的親和力和特異性(圖6-2，圖6隱3)。四價抗體與人補體成分Clq的結合實驗lxl06/ml的Raji細胞與2pg/ml抗CD20抗體于37°C孵育15分鐘，PBS洗過后按1。/。體積比加入人血清(37°C，15分鐘)，PBS洗兩遍后，加入FITC標記的棉羊抗人Clq單抗(Serotec公司產品)于4°C孵育30分鐘，最后用流式細胞術檢測熒光強度。抗體與補體成分Clq的結合實驗結果顯示(圖6-4)，2F2結合Clq的數量明顯多于C2B8，而四價抗體C2B8(ScFvHL)4-Fc禾Q2F2(ScFvHL)4-Fc結合Clq的數量與它們各自的親本抗體C2B8和2F2相似。四價抗體與FcR(U937細胞)的結合實驗人細胞系U937是大量表達FcRI和FcRI!I的細胞系，故檢測四價抗體與FcR的結合可通過流式細胞術檢測四價抗體與U937細胞的結合來實現。方法如下U937細胞預先用500U/mlINF-y誘導FcR的表達((302培養箱作用24h)，PBS洗過后將亞飽和濃度的Anti-her2-FITC與不同濃度的抗CD20抗體一起加入共孵育(4°C，l小時)，通過流式細胞術檢測熒光強度來測定四價抗體與抗her2抗休競爭結合FcR的能力。圖6-5的結果顯示，2F2，C2B8，C2B8(ScFvHL)4-Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc具有相同的結合FcR的能力，提示我們構建的四價抗體可能具有ADCC作用。四價抗體解離率的檢測實驗將Raji細胞與飽和濃度FITC標記的抗CD20抗體(10fag/ml)于37°C孵育1小時，洗細胞兩遍后用完全培養基重懸細胞，然后在不同時間點用流式細胞術進行檢測，計算仍結合于細胞上抗體占初始結合抗體的百分率。從圖6-6顯示的解離率實驗的結果中，我們可以看到，C2B8抗體解離的速率明顯快于2F2抗體，而四價抗體的解離則明顯慢于其對應的二價抗體，表明四價抗體具有多于兩個的抗原結合位點，因此能夠在細胞上停留更長的時間。實驗例4抗CD20抗體誘導的CDC和ADCC作用實驗細胞殺傷實驗的檢測補體介導的細胞殺傷(CDC)實驗和抗體依賴細胞介導的殺傷(ADCC)實驗是通過LDH非放射性試劑盒(Promega公司產品)來檢測的。方法如下細胞和抗體于無酚紅DMEM培養基中在C02培養箱孵育1小時后，按10%體積比加入人血清(用于測定CDC)或按效靶比50:1加入新鮮分離的人外周血單個核細胞(用于測定ADCC)，于C02培養箱孵育4小時后，LDH非放射性試劑盒顯色。0.2%TritonX-100作用作為100%殺傷的對照。CDC結果如圖7所示2F2抗體和2F2(ScFvHL)4-Fc抗體殺傷Daudi細胞的能力明顯強于C2B8抗體和它的四價抗體C2B8(ScFvHL)4-Fc，同樣的結果也在Raji細胞中得到證實。圖7亦顯示了不同濃度下不同抗體介導的ADCC作用，由結果可以看出，四種抗體的ADCC作用基本相同。實驗列5抗CD20抗體誘導凋亡實驗細胞與不同濃度的抗CD20抗體于C02培養箱作用18小時后，用FITC標記的AnnexinV(AnnexinV-FITC)染色，流式細胞術檢測早期凋亡細胞的比例。實驗結果(圖8)表明，在Daudi(圖8-1)禾nRaji(圖8-2)兩組細胞中，在不同抗體濃度的條件下，二價抗體C2B8和2F2誘導產生的凋亡作用均很弱(<)0。/。、，而四價抗體可誘導比二價抗體明顯增強的凋亡作用。有趣的似，雖然C2B8抗體和2F2抗體誘導凋亡的能力相似，而它們所對應的四價抗體卻具有明顯不同的誘導凋亡的能力。四價抗體2F2(ScFvHL)4-Fc的作用最強，它在2pg/ml和10|jg/ml時誘導了約30%左右Daudi細胞和23%左右Raji細胞的凋亡，而四價抗體C2B8(ScFvHL)4-Fc的作用較弱，在實驗所使用的濃度范圍內，它最多可使19%左右的Daudi細胞和16%左右的Raji細胞發生凋亡。實驗例6抗CD20抗體對腫瘤細胞的細胞生長抑制實驗2xl0Vml的Raji和Daudi細胞分別與不同濃度的抗CD20抗體于002培養箱孵育，臺盼藍拒染法每日計數細胞，共計數五日，第五日再用MTT染色法染色讀數后計算生長抑制率。圖9-1和圖9-2顯示，經四價抗體C2B8(ScFvHL)4-Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc處理的Daudi和Raji細胞，其細胞增殖的速率明顯慢于經二價抗體C2B8和2F2處理的細胞，而這四種抗CD20抗體所處理細胞的增殖速率又明顯慢于未經處理和抗her2抗體處理的細胞，這說明二價抗體和四價抗體均具有抑制CD20+細胞生長的作用，而四價抗體的作用又明顯強于二價抗體的作用(尸<0.05);圖9-3和圖9-4顯示的是MTT法染色第5天細胞數量后計算出的抑制率，C2B8抗體和2F2抗體在相同濃度下具有相同的抑制作用，而四價抗體的抑制作用則有明顯增強；相比較而言，2F2(ScFvHL)4-Fc抗體在2嗎/ml以上濃度時的抑制率分別為約95%(Daudi細胞)和88%(Raji細胞)，其作用強于C2B8(ScFvHL)4-Fc抗體，后者在實驗所使用的濃度范圍內最高的抑制率分別為82%(Daudi細胞)和76%(Raji細胞)。實驗例7藥代動力學實驗8局齡雌性ICR小鼠分四組，各組分別尾靜脈注射不同的抗CD20抗體50嗎/只，隔天眼眶抗凝取血，每只小鼠只取血一次，離心收集血漿，凍于-8(TC低溫冰箱，連續取40天，按照文獻[RebelloP,HaleG.PharmacokineticsofCAMPATH-1H:assaydevelopmentandvalidation.JImmunolMethods.2002;260:285-302]中相似的方法用流式細胞術測定血漿中抗CD20抗體的濃度)xl06/ml的Raji細胞與血漿樣品在4°C共孵育1小時后，加入FITC標記的山羊抗人抗體，然后用流式細胞儀進行檢測。藥代動力學參數如表l所示，C2B8抗體和2F2抗體在ICR小鼠體內具有相同的血漿半衰期，而四價抗體C2B8(ScFvHL)4-Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc的血漿半衰期則稍長于二價抗體，其它藥代動力學參數的結果與血漿半衰期結果一致。表l.抗體的藥代動力學參數。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實驗例8抗CD20抗體的免疫治療實驗SCID小鼠分二十八組，每組10只，各組分別尾靜脈注射3.5xl(^Raji或Daudi細胞，第5天再注射不同種類和劑量的抗體，分別為5嗎/只，15嗎/只和50嗎/只，每日觀察小鼠的狀態，當出現后腿麻痹時處死動物。并依據Kaplan-Meier法則繪制生存曲線，采用log-rank檢驗法進行統計學分析比較。如圖10所示當抗體以5pg/只的劑量注射后，C2B8抗體在Daudi-SCID小鼠中的治療效果與PBS相比沒有明顯的統計學差異(尸=0.0611);而用2F2抗體，四價抗體C2B8(ScFvHL)4-Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc處理的Daudi-SCID小鼠生存時間卻有顯考延長(就每組分別與PBS或C2B8抗體處理組比較而言、PO.OOOl)，其中C2B8(ScFvHL)4-Fc抗體和2F2抗體延長Daudi-SCID小鼠生存率的能力相似(尸=0.0794)。值得注意的是，四價抗體2F2(ScFvHL)4-Fc的治療效果比C2B8抗體，2F2抗體和C2B8(ScFvHL)4-Fc抗體的治療效果均好(就2F2(ScFvHL)4-Fc治療組分別同其他三組抗CD20抗體處理組比較而言，尸O.OOOl)。同樣的，在使用同一劑量的抗CD20抗體治療Raji-SCID小鼠模型的實驗組中，各抗體治療組所獲得的治療效果與Daudi-SCID小鼠模型的結果一致。在15昭/只的注射劑量組中，C2B8抗體，2F2抗體，四價抗體C2B8(ScFvHL)4-Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc均顯示了明顯的的治療效果(尸O.OOl，與PBS為對照)。相比較而言，C2B8抗體治療組與其他三種抗體治療組之間仍然存在著明顯差異(尸O.OOOl)。值得一提的是，在Raji-SCID小鼠模型中，C2B8(ScFvHL)4-Fc抗體的治療效果要強于2F2抗體(尸O.OOl)，而在Daudi-SCID小鼠模型中，C2B8(ScFvHL)4-Fc抗體與2F2抗體的治療效果則無明顯差異(尸=0.2297)。尤其值得注意的是，四價抗體2F2(ScFvHL)4-Fc的治療效果在所有抗體中是最好的(尸<0.0001，分別與其它各治療組相比)，在第100天時的小鼠死亡率僅為20%。圖10的結論還表明，通過提高抗CD20抗體的劑量可以延長荷瘤小鼠的生存時間。當治療抗體的劑量達到50嗎/只時，與C2B8抗體相比，C2B8(ScFvHL)4-Fc抗體和2F2抗體的抗腫瘤效果有顯著的提高(PO.001)，'但是在2F2抗體和C2B8(ScFvHL)4-Fc抗體治療組之間則無統計學差異(Daudi-SCID小鼠中P=0.6310，Raji-SCID小鼠中戶=0.4379)。而且，統計結果還顯示，低劑量2F2(ScFVHL)4-Fc抗體治療荷瘤小鼠的效果與高劑量C2B8(ScFvHL)4-Fc抗體或2F2抗體治療的效果相接近；而C2B8抗體即使在高劑量治療組中，其治療效果也遠沒有低劑量2F2(ScFvHL)4-Fc抗體的治療效果強。這些結果表明，四價抗體2F2(ScFvHL)4-Fc具有比其它三種抗體(C2B8，2F2和C2B8(ScFvHL)4-Fc)更強的抗腫瘤作用(2F2(ScFvHL)4-Fc治療組分別與其他三組抗體治療組比較，PO.0001)，其在高劑量(50嗎/只)時所有治療組中的Daudi-SCID和Raji-SCID荷瘤小鼠長期存活(>100天)。統計分析方法除免疫治療試驗外采用Z檢驗，P<0.05為有統計學意義。SEqUENCELISTING<110>上海中信國健藥業有限公司上海國健生物技術研究院<120>抗CD20四價抗體、其制備方法及應用<130>HomodimersbutnotmonomersofRituxan(chimericanti-CD20)induceapoptosisinhumanB-lymphomacellsandsynergizewithachemotherapeuticagentandanimmunotoxin.Blood.2001Mar1;97(5):1392-8<160>20<170>Patentlnversion3.4<210>1<211>363<212>DNA<213>人工序列<400>1caggtacaactacagcagcctggggctgagctggtgaagcctggggcctcagtgaagatg60tcctgcaaggcttctggctacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagaca120cctggtcggggcctggaatggattggagctatttatccaggaaatggtgatacttcctac180a&tcagaagttcaagggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcctac240atgcagcteagcagcctgacatctgaagactctgcggtctattactgtgcaagatcgact300tectacggcggtgsctggtac加33tgtctggggcgcsgggsccacggtC3ccgtctct360gca363<210>2<211>121<212>PRT<213>人工序列<400>2GinValGinLeuGinGinProGlyAlaGluLeuValLysProGlyAla151015SerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530—MetHisTrpValLysGinThrProGlyArgGlyLeuGluTrplie354045GlyAlalie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