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多年生黑麥草上三種腥黑粉菌近似種的檢測(cè)方法

文檔序號(hào):564263閱讀:432來(lái)源:國(guó)知局

專利名稱::多年生黑麥草上三種腥黑粉菌近似種的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明涉及使用PCR技術(shù)檢測(cè)寄生于禾本科草種多年生黑麥草(Z^'畫(huà)網(wǎng)re朋eL.)上小麥矮腥黑穗菌(37〃油'aco"的w^aKtihn,TCK)、黑麥草腥黑粉菌(T./。〃,')和r.v朋y^'的方法,屬于禾本科草種腥黑粉菌檢測(cè)領(lǐng)域。技術(shù)背景多年生黑麥草(ZoZ/wm/^rem^L.)是世界上最重要的禾本科栽培牧草之一,原產(chǎn)于歐洲,1972年開(kāi)始引入我國(guó),已成為我國(guó)春秋季節(jié)主要的栽培牧草,廣泛栽培于我國(guó)各地。多年生黑麥草屬冷季型叢生禾草,具有旺盛的幼苗活力,生活力強(qiáng);抗病抗逆性強(qiáng),能夠抵抗多種病蟲(chóng)害,耐旱,耐高溫;營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期長(zhǎng),分蘗多,形成茂盛的草叢,伺料質(zhì)量佳。該牧草成功地解決了我國(guó)畜牧業(yè)冬春季節(jié)青綠飼料不足的弊端,生長(zhǎng)快、成熟早、效益高且穩(wěn)定。多年生黑麥草也是一種優(yōu)良的草坪草,葉色深綠,生長(zhǎng)低矮,具快速的草坪建植特性,耐低修剪,耐踐踏,適于草坪建植。草坪建植過(guò)程中,常與旱地早熟禾、高羊茅等草種混合栽培,用作綠化材料。同時(shí)多年生黑麥草能抗二氧化硫等有害氣體,起到凈化空氣的作用(王棟原著,任繼周等修訂.牧草學(xué)各論,新一版,江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,1989,153-154.)。腥黑粉菌是黑麥草上非常重要的真菌病害,巳經(jīng)成為黑麥草生產(chǎn)的嚴(yán)重威脅,致使草坪景觀受到破壞,產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重降低甚至死亡(趙美琦,孫明,王慧敏,王琦主編.草坪病害,中國(guó)林業(yè)出版社,1999,230-232.)。根據(jù)Lindeberg(LindebergB.1959.UstilaginalesofSweden.t^wa/.16:67-75.)、Duran&Fischer(DuranR,FischerGW.1961.TheGenus7)7/e"<x/W/腿w船流"gtow5>她L/w'vem'(y尸潛&)、Vlnky(Vdnky.1994.Europeansmutfungi.GustavFisherVerlag;Stuttgart.)禾口Mordue(MordueJE.1984.D'〃e"fl/o/z)'.CM/Destr/;^o形/,*"m/6""m'",804.)的研究,寄生于黑麥草的腥黑粉菌有兩種,即小麥矮腥黑穗菌TCK和黑麥草腥黑粉菌7:/o///。1999年Castlebury和Carris從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)多方面進(jìn)行研究,將從多年生黑麥草中發(fā)現(xiàn)的一種與小麥印腥黑粉菌(T^miia)相似的腥黑粉菌定名為新種黑麥草粒腥黑粉菌(r.而/fe")(Castlebury,LA&CarrisLM.1999.77〃e/iaHY/Aer/,anewspecieson丄o/z'w附mw/ny/orwmand丄.Afyco/og/a,91:121-131.)。2002年、2003年、2005年天津出入境檢驗(yàn)檢疫局在來(lái)自澳大利亞和德國(guó)的多年生黑麥草中發(fā)現(xiàn)一種擔(dān)孢子無(wú)"H"結(jié)合的腥黑粉菌,冬孢子形態(tài)與TCK及r6raw/非常相似,于2007年和美國(guó)黑粉菌專家LoriCarris、LisaCastlebury共同發(fā)表新種r.v朋A^'(CarrisLM,CastleburyLA,GuomingHuang,a/.Tif//eriava"^y/,anewspeciesofreticulate-sporedbuntfunguswithnon-conjugatingbasidiosporesinfectingspeciesofFeWwcaand丄o/Zww.A^>co/og/ca/iesearc/z2007,111(12):1386-1398.)。至此,寄生在黑麥草上的腥黑粉菌共發(fā)現(xiàn)四種,它們是TCK、r.亂r.wfl/teh和r.wmAy/,其中r.而/fen'冬孢子具疣狀突起,與其他三種黑粉菌易于區(qū)分,tck、r./0///、r.ra"w冬孢子胞壁紋飾均為網(wǎng)狀,從形態(tài)上難以鑒定區(qū)分[章正.關(guān)于小麥矮腥病菌某些近似種的探討.植物病理學(xué)報(bào),1980,10:89-94;章正,章桂明,朱連.黑麥草粒腥黑粉病菌與黑麥草的檢疫問(wèn)題.植物檢疫,2005,19(6):362-367;IngoldCT.Thebasidiumof77〃幼》andit,sevolution.A^co/og/W,1997,11(3》98-100.]。腥黑粉菌屬主要依據(jù)形態(tài)學(xué)、萌發(fā)生理、細(xì)胞學(xué)諸方面的特性以及寄主專一性這些傳統(tǒng)方法進(jìn)行分類。腥黑粉菌冬孢子萌發(fā)生理差異可以作為區(qū)分鑒定的依據(jù)之一(羅加鳳,黃國(guó)明,崔鐵軍,劉躍庭,廖芳.中華人民共和國(guó)國(guó)家出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)一禾草腥黑穗病菌、剪股穎腥黑穗病菌、黑麥草腥黑穗病菌檢疫鑒定方法,SN/T1812-2006.),但萌發(fā)是否成功受材料保存時(shí)間、材料來(lái)源、培養(yǎng)條件等諸多因素的制約,而且TCK培養(yǎng)時(shí)間最長(zhǎng)達(dá)三個(gè)月,不適宜于口岸的快速檢疫,TCK作為我國(guó)對(duì)外頒布的重要檢疫性有害生物,一直是我國(guó)進(jìn)境麥類和禾本科草種病害檢疫的中心問(wèn)題,r./0//z、r.ww^r主要在美洲、歐洲和大洋洲發(fā)生,目前在我國(guó)尚無(wú)發(fā)生,快速準(zhǔn)確地區(qū)分這三種腥黑粉菌對(duì)口岸進(jìn)境草種檢疫具有十分重要的意義。目前尚未有黑麥草上TCK、r./0///、r.wm^y/分子檢測(cè)方法的報(bào)道。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,分子生物學(xué)方法在腥黑粉菌的檢測(cè)鑒定上得到了廣泛的應(yīng)用,諸如PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR、RAPD、RFLP、AFLP,以及基因序列分析方法等,用到的基因序列包括ITS、IGS、mtDNA、延長(zhǎng)因子基因、微管蛋白基因、肌動(dòng)蛋白基因、細(xì)胞色素氧化酶基因、黑色素合成酶基因、交配型基因和磷酸甘油酸合成酶基因等[高強(qiáng),吳品珊,朱水芳等.實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對(duì)小麥矮腥黑穗病菌的檢測(cè).微生物學(xué)通報(bào),2005,32(6):74-77]。尤其是在印度腥黑粉菌和近似種T.w"/fen'的檢測(cè)鑒定上,許多人作了大量研究,確立了新種r.w"/fen',解決了困擾小麥和草種的國(guó)際貿(mào)易難題[程穎惠,章桂明,王穎等.小麥印度腥黑穗病PCR檢測(cè).植物檢疫,2001,15(6):321-325;CastleburyLA,CardsLM.7H/"/a麗/fe"—,anewspecieson丄0//"附附"^;/70^附肌(1£.;^^朋£.顯:^0/(^/",1999,91(1):121-131;易建平,陶庭典,沈禹飛等.進(jìn)境黑麥草種子中黑麥草腥黑粉菌的鑒定.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,25(2):52-56.]。近年來(lái),隨著我國(guó)農(nóng)牧業(yè)以及城市擴(kuò)大草坪綠地美化環(huán)境的需要,境外的草種大量引入,作為優(yōu)良的牧草和草坪草,多年生黑麥草作為重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的栽培品種被大量引進(jìn),并在各地廣泛栽培。隨著草業(yè)國(guó)際化引種頻繁,tck、r./o肌、;r.v""^,'通過(guò)口岸傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)越來(lái)越大。腥黑粉菌的檢疫鑒定是該草種真菌檢疫的重要工作之一,為了保護(hù)我國(guó)的牧草生產(chǎn)和城市綠化,有必要在口岸建立小麥矮腥黑粉菌tck、r./o///和r.v朋^/的快速準(zhǔn)確的分子檢測(cè)方法。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述情況,本發(fā)明建立了快速簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠的黑麥草上小麥矮腥黑粉菌(77〃W"c朋加vera"Ktihn,簡(jiǎn)稱TCK)、黑麥草腥黑粉菌(7:/o〃/)禾卩7:ra"^,'的三重PCR分子檢測(cè)方法,并能將這這三種黑粉菌區(qū)別開(kāi)來(lái)。該方法不僅能夠檢測(cè)菌絲基因組DNA,而且可以利用冬孢子三重套式擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)對(duì)三種腥黑粉菌冬孢子的檢測(cè),節(jié)約了試劑和時(shí)間,檢測(cè)快速、可靠,整個(gè)過(guò)程在一個(gè)工作日內(nèi)完成,可在口岸檢測(cè)中推廣應(yīng)用。本發(fā)明中收集了7〃^a屬的3種近似種共計(jì)ll個(gè)菌株(表l,菌絲和冬孢子),來(lái)源于天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心植檢實(shí)驗(yàn)室,LMC353、V767、LMC94、V21-711-l等為交流的冬孢子,其它的實(shí)驗(yàn)材料為本室近年所收集的冬孢子。其中LMC353、LMC94、Xia5、Lpl、Lp2、LpG、V21-711-l使用培養(yǎng)的菌絲體,不能培養(yǎng)出菌絲的V767和TCK2、TCK4、TCK7以及LMC353、LMC94、Lpl、Lp2、LpG、V21-711-1等作為套式三重PCR檢測(cè)方法中的冬孢子材料。供試材料的相關(guān)信息見(jiàn)表l。具體技術(shù)方案如下本發(fā)明目的是提供一種利用PCR引物對(duì)多年生黑麥草上的TCK、7:和7:iw^y/進(jìn)行檢測(cè)的方法,這些引物既可以對(duì)這三種腥黑粉菌進(jìn)行檢測(cè),又可以將它們區(qū)分開(kāi)來(lái),引物的序列和用途如下(1)腥黑粉菌屬(77//幼'a)通用引物,引物序列如下通用外套引物IGSUF1:GGATGCATTCTGGGGACGTIGSUR1:GTAGCCTTGTTGCTACGATCTG通用內(nèi)套引物NIGSUF1:CACCGCCCAAGCACGTACNIGSUR1:GACCTTTTGGGGTCAAACTTCTC通用外套引物用于菌絲基因組DNA或冬孢子套式擴(kuò)增,擴(kuò)增片段約為900bp,通用內(nèi)套引物用于冬孢子的套式擴(kuò)增,擴(kuò)增片段約為700bp,這兩套引物用于TCK、I和Iv朋一的檢測(cè);(2)TCK、7:/o仿、rv朋^'各自的特異引物和7>朋一的外套引物,引物序列如下TCK的外套引物IGSUF1/IGSUR1TCK的特異引物L(fēng)SKF:GAAGTTTCCTTCGCCLSKR:ACTTCTCTCGGAACATCACTGT特異引物的擴(kuò)增片段約為800bp,這兩套引物用于TCK的菌絲基因組DNA特異PCR擴(kuò)增和冬孢子套式PCR的擴(kuò)增,7:/o〃/的外套引物IGSUF1/IGSUR17:/o〃/的特異引物L(fēng)SLF:GGTGGACTGACATTCGTCLSLR:CGCATGTCCGTCGGACCG特異引物的擴(kuò)增片段約為250bp,這兩套引物用于7:/0///的菌絲基因組DNA特異PCR擴(kuò)增和冬孢子套式PCR的擴(kuò)增,Iv""^y/外套引物unF:AACTGTATGGATCATCCAGAGCunR:GTAATGCCAGAGGATTGTCCT7:wmAyi特異引物L(fēng)SNF:CTCTGTGAGGATATGCCALSNR:GAGAATAACTGTTGTATGATGCCA特異引物的擴(kuò)增片段約為550bp,這兩套引物用于Iraw^/的菌絲基因組DNA特異PCR擴(kuò)增和冬孢子套式PCR的擴(kuò)增;TCK、Z/o///、rv""一三者的特異引物,用于菌絲基因組DNA三重特異性PCR擴(kuò)增,特異性檢測(cè)這三種菌絲體,各自的外套引物與特異引物的三重套式PCR擴(kuò)增,用于特異性檢測(cè)這三種真菌的冬孢子。本發(fā)明的另一個(gè)目的是檢測(cè)多年生黑麥草上小麥矮腥黑穗菌和黑麥草腥黑粉菌的方法以及12條引物在檢測(cè)這三種腥黑粉菌近似種方面提供應(yīng)用。具體操作歩驟如下(1)實(shí)驗(yàn)材料冬孢子的萌發(fā)和菌絲的培養(yǎng);(2)菌絲基因組DNA的提取;(3)冬孢子的挑取與破碎;(4)菌絲基因組DNA三重PCR檢測(cè)方法的建立;(5)冬孢子三重套式PCR檢測(cè)方法的建立。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明建立了快速簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠的黑麥草上TCK、r./o肌、T.ra^^三重PCR分子檢測(cè)方法,能將黑麥草上腥黑粉菌近似種TCK、r.to肌、r.wmAyZ區(qū)別開(kāi)來(lái)。采用通用引物實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的檢測(cè),避免了假陰性。該方法不僅能夠檢測(cè)菌絲基因組DNA,而且可以利用冬孢子三重套式擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)對(duì)三種腥黑粉菌冬孢子的同時(shí)檢測(cè),節(jié)約了試劑和時(shí)間,檢測(cè)快速、可靠,整個(gè)過(guò)程在一個(gè)工作R內(nèi)完成,可有效在口岸檢測(cè)中推廣應(yīng)用,特別是冬孢子三重套式擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)對(duì)TCK、r./o/"、r.wm^y/冬孢子的同時(shí)檢測(cè),為直接應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外對(duì)黑麥草傳帶TCK、r./0///、r.v朋^y/的檢測(cè)創(chuàng)造了技術(shù)條件。下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。圖1:菌絲基因組DNA通用外套引物擴(kuò)增和特異引物的三重?cái)U(kuò)增圖2:冬孢子通用引物套式PCR擴(kuò)增圖3:冬孢子特異弓I物三重套式PCR擴(kuò)增具體實(shí)施方式實(shí)施例l:實(shí)驗(yàn)材料冬孢子的萌發(fā)和菌絲的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)涉及的材料包括"7/^"屬的3種近似種共計(jì)11個(gè)菌株(為菌絲和冬孢子)來(lái)源于天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心植檢實(shí)驗(yàn)室,LMC353、V767、LMC94、V21-711-l等為交流的冬孢子,其它的實(shí)驗(yàn)材料為本室近年所收集的冬孢子,其中LMC353、LMC94、Xia5、Lpl、Lp2、LpG、V21-711-l使用培養(yǎng)的菌絲體,不能培養(yǎng)出菌絲的V767和TCK2、TCK4、TCK7以及LMC353、LMC94、Lpl、Lp2、LpG、V21-711-1等作為套式三重PCR檢測(cè)方法中的冬孢子材料。相關(guān)信息見(jiàn)表l。_表l供試材料_序號(hào)真菌名稱#1H備注0.5mLEppendorf離心管中加入適量0.25%的次氯酸鈉溶液,挑取一定數(shù)量的冬孢子放入,用渦旋振蕩器混和,消毒50秒后,以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心l分鐘,立即用微量加樣器吸去上清液,混和與離心處理時(shí)間不超過(guò)3分鐘,加無(wú)菌水離心清洗兩次,將冬孢子沉淀物轉(zhuǎn)至3%瓊脂平板上,在各自的最適溫度下光照培養(yǎng)。培養(yǎng)20天的菌落,用無(wú)菌水沖洗至PDA(馬鈴薯培養(yǎng)基)上,繼續(xù)培養(yǎng)30-45天后,收集大量菌絲供DNA提取。實(shí)施例2:菌絲基因組DNA的提取采用上海生工基因組DNA純化試劑盒(編號(hào)SK1252)提取菌絲DNA。提取的基因組DNA溶于70pLlxTE中,其余菌絲置-70。C下備用。實(shí)施例3:冬孢子的挑取<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>菌菌菌冬冬冬菌菌菌菌冬載玻片上放置lmm見(jiàn)方的蓋玻片,其上滴約0.5^L10xPCR緩沖液(10mmol/LTris-HCl,50mmol/LKCl,1.5mmol/LMgCl2,pH8.3),用解剖針剌破菌癭,挑取3-10個(gè)左右冬孢子置10xPCR緩沖液中,蓋上近似大小的蓋玻片,用鑷子輕輕摩擦蓋玻片,顯微鏡下確認(rèn)孢子破裂后將疊合的兩片蓋玻片一起放入含4.5pL10xPCR緩沖液的PCR管底部,蓋上管蓋,以不添加冬孢子僅含PCR緩沖液作為陰性對(duì)照。實(shí)施例4:菌絲基因組DNA三重PCR檢測(cè)方法的建立PCR擴(kuò)增試劑為大連寶生物(TaKaRa)工程公司產(chǎn)品。4.1菌絲基因組DNA通用引物的PCR擴(kuò)增4丄1反應(yīng)混合液的配制反應(yīng)體系為20)aL:10x緩沖液2.0^L(其中含有終濃度為1.5mmol/L的MgCl2),濃度各為2.5mmol/L的四種dNTP共0.化L,濃度為20pmol/L的引物(IGSUF1/IGSUR1)各為0.2pL,0.2pLTaqDNA聚合酶(5U/pL),0.5pL模板DNA(約為40ng),加無(wú)菌水至20pL,以陽(yáng)性質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照,以添加無(wú)菌水為模板作為陰性對(duì)照。4丄2PCR反應(yīng)程序94'C預(yù)變性5分鐘;94'C變性30秒,63"C復(fù)性30秒,72'C延伸1分鐘,35個(gè)循環(huán);72。C延伸7分鐘。4丄3結(jié)果分析對(duì)7個(gè)菌株的菌絲基因組DNA進(jìn)行屬通用引物IGSUF1/IGSUR1的擴(kuò)增,以陽(yáng)性質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照,以添加無(wú)菌水為模板作為陰性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色后均能觀察到特定大小的目的帶,外套通用引物擴(kuò)增的片段應(yīng)為900bp,陽(yáng)性質(zhì)控和所有的菌絲基因組DNA均能得到特定大小的目的片段,表明該通用引物可以用于三種腥黑粉菌菌絲體的檢測(cè)。見(jiàn)圖1。圖1中的18個(gè)泳道從左到右分別用1、2、3、4、5、6、7、8、9、M、10、11、12、13、14、15、16、17表示。陰性對(duì)照無(wú)相應(yīng)產(chǎn)物,見(jiàn)泳道18,其中1為陽(yáng)性質(zhì)粒,28分別為L(zhǎng)MC353、LMC94、Xia5、Lpl、Lp2、LpG、V21-711-1,9為陰性對(duì)照,M為2000bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。4.2菌絲基因組DNA特異引物的三重PCR擴(kuò)增4.2.1反應(yīng)混合液的配制多重PCR反應(yīng)體系為20^L:10x緩沖液2.0i^L(其中含有終濃度為1.5mmol/L的MgCl2),濃度各為2.5mmol/L的四種dNTP共0.5^L,濃度為20mmol/L的6條引物(LSKF/LSKR、LSLF/LSLR和LSNF/LSNR)各為0.2pL,0.2pLTaqDNA聚合酶(5U/pL),0.5pL模板DNA(約為40ng),加無(wú)菌水至2(VL,不設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照。94.2.2PCR反應(yīng)程序94。C預(yù)變性5分鐘;94t:變性20秒,6rC復(fù)性20秒,72。C延伸50秒,35個(gè)循環(huán);72'C延伸7分鐘。4.2.3結(jié)果分析對(duì)7個(gè)菌株的菌絲基因組DNA進(jìn)行三對(duì)特異引物(LSKF/LSKR、LSLF/LSLR禾口LSNF/LSNR)的三重PCR擴(kuò)增,以添加無(wú)菌水為模板作為陰性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色后均能觀察到特定大小的目的帶。TCK特異引物擴(kuò)增的片段應(yīng)為800bp,只有LMC353、Xia5和LMC94顯示800bp的帶(圖1中10~12)。71.va"y^的擴(kuò)增片段應(yīng)為550bp,只有Lpl、Lp2、LpG、V21-711-l顯示550bp的目的帶(圖1中13~16),陰性對(duì)照無(wú)相應(yīng)產(chǎn)物(圖1中17),M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(2000bp,1000bp,750bp,500bp)。這一結(jié)果表明通過(guò)三重PCR擴(kuò)增可以把TCK、Z/o"/和r.ra"/^/的菌絲體區(qū)別開(kāi)來(lái)。實(shí)施例5:冬孢子三重套式PCR檢測(cè)方法的建立5.1反應(yīng)混合液的配制第一輪的反應(yīng)體系為50pL:濃度各為2.5mmol/L的四種dNTPs共0.5pL,濃度為20pmol/L的引物(IGSUFl/IGSURl和unF/unR)每條各為0.5pL,0.5pLTaqDNA聚合酶(5U/pL),模板和PCR緩沖液共5pL,加無(wú)菌水至50pL,采用陽(yáng)性質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照,只添加PCR緩沖液為陰性對(duì)照。第二輪的反應(yīng)體系為20(iL:弓1物NIGSUF1/NIGSUR1的擴(kuò)增反應(yīng)體系同實(shí)施例4中的4丄1,模板為lpL第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物,設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照;引物L(fēng)SKF/LSKR、LSLF/LSLR和LSNF/LSNR三重?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系同實(shí)施例4中的4丄1,模板為1pL第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物,不設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照,設(shè)置陰性對(duì)照。5.2PCR反應(yīng)程序第一輪PCR的反應(yīng)程序?yàn)?4。C預(yù)變性5分鐘;94。C變性30秒,56'C復(fù)性30秒,72。C延伸l分鐘,25個(gè)循環(huán);72。C延伸7分鐘。第二輪NIGSUF1/NIGSUR1引物的反應(yīng)程序?yàn)?4'C預(yù)變性5分鐘;94"變性15秒,60'C復(fù)性15秒,72"延伸1分鐘,35個(gè)循環(huán);72匸延伸7分鐘。第二輪的三重PCR反應(yīng)程序?yàn)?4'C預(yù)變性4分鐘;94'C變性5秒,6rC復(fù)性2秒,72'C延伸50秒,35個(gè)循環(huán);72"C延伸7分鐘。5.3結(jié)果分析挑取10個(gè)菌株的3到數(shù)個(gè)冬孢子進(jìn)行兩對(duì)外套通用引物的第一輪擴(kuò)增,然后進(jìn)行內(nèi)套通用引物和TCK、7Wo///、r.raw^y/特異引物三重套式第二輪擴(kuò)增,采用陽(yáng)性質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照,以不添加冬孢子僅含PCR緩沖液作為陰性對(duì)照,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳和EB染色后均能觀察到特定目的大小帶。內(nèi)套通用引物擴(kuò)增的片段應(yīng)為700bp,陽(yáng)性質(zhì)控和所有菌株冬孢子經(jīng)兩輪套式擴(kuò)增均能得到特定大小的目的片段(見(jiàn)圖2)。圖2中的13個(gè)泳道從左到右分別用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、M表示。陰性對(duì)照無(wú)相應(yīng)產(chǎn)物(圖2,其中l(wèi)為陽(yáng)性質(zhì)粒,211分別為L(zhǎng)MC353、LMC94、TCK2、TCK4、TCK7、Lpl、Lp2、LpG、V21-711-l、V767,12為陰性對(duì)照),M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp)。這一結(jié)果表明兩輪套式PCR擴(kuò)增可以用于三種腥黑粉菌冬孢子的檢測(cè)。TCK特異引物擴(kuò)增的片段應(yīng)為800bp,只有LMC353、LMC94和TCK2、TCK4、TCK7顯示800bp的目的帶(見(jiàn)圖3)。圖3中的12個(gè)泳道從左到右分別用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、M表示。圖3中15泳道分別為L(zhǎng)MC353、LMC94、TCK2、TCK4、TCK7,7:v"""'/的擴(kuò)增片段約為550bp,只有Lpl、Lp2、LpG、V21-711-l顯示出特定大小的目的帶(見(jiàn)圖3中69泳道,69泳道分別為L(zhǎng)pl、Lp2、LpG、V21-711-l),V767的擴(kuò)增片段約為250bp,只有V767顯示出特定大小的目的帶(見(jiàn)圖3中10泳道),以及陰性對(duì)照無(wú)相應(yīng)產(chǎn)物(見(jiàn)圖3中11泳道),M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(2000bp,1000bp,750bp,500bp)。這一結(jié)果表明通過(guò)外套通用引物和三重套式PCR擴(kuò)增可以把TCK、r.wm^y/和7:/0///的冬孢子區(qū)別丌來(lái)。序列列表SEQUENCELISTING<110〉天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心<120>多年生黑麥草上三種腥黑粉菌近似種的檢測(cè)方法<130>20080528<160>12<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>1ggatgcattctggggacgt<210>2<211〉22<212>DNA<213>人工合成<400>2gtagccttgttgctacgatctg<210>3<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>3caccgcccaagcscgtac<210>4<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>4gaccttttggggtcaaacttetc<210>5<211>15<212>DNA19221823<213>人工合成<400>5gaagtttccttcgcc<210>6<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>6acttctctcggaacatcactgt<210>7<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>7ggtggactgacattcgtc<210〉8<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>8cgcatgtccgtcggaccg<210>9<211>22<212>DNA<213〉人工合成<400>9aactgtatggatcatccagagc<210>10<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>10gtaatgccagaggattgtcct<210>11<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>11說(shuō)明書(shū)第10/11頁(yè)1522181822ctctgtgaggatatgcca18<210〉12<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>12gagaataactgttgtatgatgcca2權(quán)利要求1.一種利用PCR引物對(duì)多年生黑麥草(LoliumperenneL.)上的小麥矮腥黑穗菌(TilletiacontroversaKühn,簡(jiǎn)稱TCK)、黑麥草腥黑粉菌(T.lolli)和T.vankyi進(jìn)行檢測(cè)的方法,這些引物既可以對(duì)這三種腥黑粉菌進(jìn)行檢測(cè),又可以將它們區(qū)分開(kāi)來(lái),其特征在于,引物的序列和用途如下(1)腥黑粉菌屬(Tilletia)通用引物,引物序列如下通用外套引物IGSUF1GGATGCATTCTGGGGACGTIGSUR1GTAGCCTTGTTGCTACGATCTG通用內(nèi)套引物NIGSUF1CACCGCCCAAGCACGTACNIGSUR1GACCTTTTGGGGTCAAACTTCTC通用外套引物用于菌絲基因組DNA或冬孢子套式擴(kuò)增,擴(kuò)增片段約為900bp,通用內(nèi)套引物用于冬孢子的套式擴(kuò)增,擴(kuò)增片段約為700bp,這兩套引物用于TCK、T.lolli和T.vankyi的檢測(cè);(2)TCK、T.lolli、T.vankyi各自的特異引物和T.vankyi的外套引物,引物序列如下TCK的外套引物IGSUF1/IGSUR1TCK的特異引物L(fēng)SKFGAAGTTTCCTTCGCCLSKRACTTCTCTCGGAACATCACTGT特異引物的擴(kuò)增片段約為800bp,這兩套引物用于TCK的菌絲基因組DNA特異PCR擴(kuò)增和冬孢子套式PCR的擴(kuò)增,T.lolli的外套引物IGSUF1/IGSUR1T.lolli的特異引物L(fēng)SLFGGTGGACTGACATTCGTCLSLRCGCATGTCCGTCGGACCG特異引物的擴(kuò)增片段約為250bp,這兩套引物用于T.lolli的菌絲基因組DNA特異PCR擴(kuò)增和冬孢子套式PCR的擴(kuò)增,T.vankyi外套引物unFAACTGTATGGATCATCCAGAGCunRGTAATGCCAGAGGATTGTCCTT.vankyi特異引物L(fēng)SNFCTCTGTGAGGATATGCCALSNRGAGAATAACTGTTGTATGATGCCA特異引物的擴(kuò)增片段約為550bp,這兩套引物用于T.vankyi的菌絲基因組DNA特異PCR擴(kuò)增和冬孢子套式PCR的擴(kuò)增;TCK、T.lolli、T.vankyi三者的特異引物,用于菌絲基因組DNA三重特異性PCR擴(kuò)增,特異性檢測(cè)這三種菌絲體,各自的外套引物與特異引物的三重套式PCR擴(kuò)增,用于特異性檢測(cè)這三種真菌的冬孢子。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用PCR引物對(duì)多年生黑麥草ao/Z謂網(wǎng)re朋eL.)上的小麥矮腥黑穗菌(7H/etocoWraw"aKiihn,簡(jiǎn)稱TCK)、黑麥草腥黑粉菌(7!和Ira"^y/進(jìn)行檢測(cè)的方法,其特征在于,該方法包括以下步驟(1)實(shí)驗(yàn)材料冬孢子的萌發(fā)和菌絲的培養(yǎng);(2)菌絲基因組DNA的提取;(3)冬孢子的挑取與破碎;(4)菌絲基因組DNA三重PCR檢測(cè)方法的建立;(5)冬孢子三重套式PCR檢測(cè)方法的建立。3.權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)多年生黑麥草上小麥矮腥黑穗菌、黑麥草腥黑粉菌和Z的方法以及12條引物在檢測(cè)這三種腥黑粉菌近似種方面的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及使用PCR引物檢測(cè)禾本科草種多年生黑麥草(LoliumperenneL.)上小麥矮腥黑穗菌(TilletiacontroversaKühn,簡(jiǎn)稱TCK)、黑麥草腥黑粉菌(T.lolli)和T.vankyi的方法,屬于禾本科草種腥黑粉菌檢測(cè)領(lǐng)域。本發(fā)明自行設(shè)計(jì)了6套PCR引物,包括通用外套引物、內(nèi)套引物、TCK和T.lolli特異引物以及T.vankyi的外套引物和特異引物。通用外套和內(nèi)套引物用于TCK、T.lolli和T.vankyi基因組DNA或冬孢子套式擴(kuò)增,進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè),避免假陰性結(jié)果。TCK、T.lolli、T.vankyi各自的特異引物用于菌絲基因組DNA三重特異PCR擴(kuò)增,可以將三者區(qū)別開(kāi)來(lái)。TCK、T.lolli和T.vankyi各自的外套引物與特異引物三重套式PCR,可以特異性檢測(cè)這三種冬孢子。本方法檢測(cè)快速,結(jié)果可靠,整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在一個(gè)工作日內(nèi)完成。文檔編號(hào)C12N15/11GK101328496SQ20081005381公開(kāi)日2008年12月24日申請(qǐng)日期2008年7月11日優(yōu)先權(quán)日2008年7月11日發(fā)明者勇劉,劉躍庭,崔鐵軍,芳廖,羅加鳳,黃國(guó)明申請(qǐng)人:天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心
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