專利名稱：：肺吸蟲排泄分泌蛋白的重組表達(dá)載體、工程菌、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及肺吸蟲排泄分泌蛋白的重組表達(dá)載體、工程菌、制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：肺吸蟲病(Paragonimiasis)是一種常見(jiàn)和重要的人獸共患寄生蟲病，散在流行于我國(guó)10多個(gè)省、市、自治區(qū)，致病蟲種主要為衛(wèi)氏并殖吸蟲(Paragonimuswestermani)和斯氏貍殖吸蟲(Pagumogonimusskrjabini)，尤其斯氏貍殖吸蟲作為僅在我國(guó)流行的一種吸蟲，其在人體內(nèi)不能發(fā)育成無(wú)，而以幼蟲在人體內(nèi)移行、竄擾，常常引起游走性皮下包塊或結(jié)節(jié)，腦占位性病變和內(nèi)臟損傷等肺外型寄生蟲表現(xiàn)，造成多器官、組織的損害。肺吸蟲病由于臨床癥狀不典型，易與其他疾病混淆，病原學(xué)檢查又難以發(fā)現(xiàn)蟲卵、蟲體，目前主要采用免疫學(xué)方法進(jìn)行確診，但現(xiàn)有的免疫學(xué)方法存在一些缺陷，如診斷抗原主要為蟲體粗抗原，易與其它吸蟲出現(xiàn)交叉反應(yīng)；無(wú)療效考核作用；各實(shí)驗(yàn)室采用的診斷抗原標(biāo)準(zhǔn)不一致，無(wú)法對(duì)各實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較；天然抗原的獲得日益困難等，因此，迫切需要研制新的肺吸蟲病免疫診斷抗原。半胱氨酸蛋白酶(Cysteineprotease)是多種寄生蟲分泌、排泄的一種蛋白水解酶，也是免疫優(yōu)勢(shì)抗原，并具有明顯的種、屬特異性。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，斯氏貍殖吸蟲的半胱氨酸蛋白酶對(duì)宿主具有免疫原性和反應(yīng)性，能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，可作為肺吸蟲病的免疫"^斷抗原；因該蛋白酶的免疫組化反應(yīng)呈現(xiàn)蟲體的腸道、排泄嚢內(nèi)，其編碼基因雜交定位在成蟲的腸壁、體壁，故將該蛋白'酶又稱為肺吸蟲排泄分泌蛋白(Excretory-secretoryprotein,ESP)。由于天然肺吸蟲ESP蛋白來(lái)源有限，難以大規(guī)模生產(chǎn)，不能滿足臨床免疫診斷的需要，而利用分子生物學(xué)手段、技術(shù)對(duì)肺吸蟲ESP蛋白進(jìn)行cDM克隆、構(gòu)建重組表達(dá)載體并誘導(dǎo)表達(dá)是解決此問(wèn)題的一個(gè)重要方法，因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)能夠高效表達(dá)肺吸蟲ESP蛋白的重組表達(dá)載體、工程菌和制備方法。
發(fā)明內(nèi)容有鑒于此，為了能夠高效表達(dá)肺吸蟲ESP蛋白，并且表達(dá)穩(wěn)定、表達(dá)盧物免疫反應(yīng)性高，本發(fā)明的目的之一在于提供一種肺吸蟲ESP蛋白的重組表達(dá)載體，含有肺吸蟲ESP蛋白的編碼基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.l所示，表達(dá)載體為pQE-80L。本發(fā)明的目的之二在于提供一種肺吸蟲ESP蛋白的工程菌，含有所述肺吸蟲ESP蛋白的重組表達(dá)載體，宿主菌為大腸桿菌。進(jìn)一步，所述宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)菌^f朱。本發(fā)明的目的之三在于提供利用所述重組表達(dá)載體制備肺吸蟲ESP蛋白的方法，包括以下步驟a.工程菌的構(gòu)建將所述肺吸蟲ESP蛋白的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入宿主菌感受態(tài)細(xì)胞，用含氨芐青霉素的LB平板進(jìn)行篩選培養(yǎng)，獲得陽(yáng)性克隆菌，即工程菌；b.工程菌的培養(yǎng)將步驟a所得工程菌接種于含氨千青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于溫度37'C振搖過(guò)夜；c.工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)取步驟b過(guò)夜培養(yǎng)菌液，按1:100的比例接種于含氨千青霉素的液體'LB培養(yǎng)基中，于溫度37。C振搖培養(yǎng)1小時(shí)，加入異丙基石克代半乳糖苷即IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度為200pmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)5-6小時(shí)，收集菌液，離心，去除上清液，細(xì)菌沉淀用磷酸鹽緩沖液即PBS洗滌3次后，用5倍體積的細(xì)菌裂解液重懸，于水浴下超聲，取超聲后的勻漿物離心，收集上清液；d.表達(dá)產(chǎn)物的純化取步驟c收集的上清液，利用重組表達(dá)載體在表達(dá)蛋白氨基端引入的6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，以Ni2+-NTA樹脂親和層析法進(jìn)行純化，即得肺吸蟲ESP蛋白，置4"C保存。進(jìn)一步，所述步驟a使用的宿主菌為大腸桿菌；進(jìn)一步，所述步驟a使用的宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)菌抹。本發(fā)明的目的之四在于提供利用所述重組表達(dá)載體制得的肺吸蟲ESP蛋白在制備肺吸蟲病檢測(cè)試劑或檢測(cè)裝置中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明構(gòu)建的肺吸蟲ESP蛋白的重組表達(dá)載體和工程菌，具有表達(dá)量高，表達(dá)穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)；利用本發(fā)明的重組表達(dá)載體制備肺吸蟲ESP蛋白的方法，蛋白收率高且免疫反應(yīng)性高；用制得的肺吸蟲ESP蛋白免疫動(dòng)物，可制備特異性抗體，還可進(jìn)一步制備肺吸蟲病檢測(cè)試劑或檢測(cè)裝置；采用肺吸蟲ESP蛋白和其多克隆抗體制得的肺吸蟲病檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)裝置，具有高度特異、敏感性，并具有療效考核作用，可以準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便地進(jìn)行肺吸蟲病的診斷與鑒別診斷、以及療效考核，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)，和特征在某種程度上將在隨后的說(shuō)明書中進(jìn)行闡述，并且在某種程度上，基于對(duì)下文的考察研究對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見(jiàn)的，或者可以從本發(fā)明的實(shí)踐中得到教導(dǎo)。本發(fā)明的目標(biāo)和其他優(yōu)點(diǎn)可以通過(guò)下面的說(shuō)明書和權(quán)利要求書來(lái)實(shí)現(xiàn)和獲得。為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖和優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中圖1為肺吸蟲ESP蛋白編碼基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖2為雙酶切陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳圖3為重組表達(dá)載體pQE-80L/ESP的定向構(gòu)建流程圖4為大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明采用分子生物學(xué)方法，從斯氏貍殖吸蟲成蟲中提取蟲體總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)獲得肺吸蟲ESP蛋白的編碼DNA序列，將此DNA序列克隆入原核表達(dá)載體中，構(gòu)建重組表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化入宿主菌中，經(jīng)過(guò)反復(fù)篩選和表達(dá)量檢測(cè)，獲得高效穩(wěn)定表達(dá)肺吸蟲ESP蛋白的工程菌，為肺吸蟲ESP蛋白的高效大規(guī)模生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。許多表達(dá)載體可用于肺吸蟲ESP蛋白的原核表達(dá)，如pET22b(+)、PinPointXa-1T、pQE-80L等。本發(fā)明通過(guò)比較研究發(fā)現(xiàn)，pQE-80L是一種特別優(yōu)選的載體。pQE-80L屬于pDS質(zhì)粒家族，來(lái)源于pDS56/RBSII和pDS781/RBSII-DHFRS質(zhì)粒，是基于噬菌體T5啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)，帶有兩個(gè)乳糖操縱子識(shí)別序列，可以增加乳糖阻滯蛋白的結(jié)合從而保證功能強(qiáng)大的T5啟動(dòng)子受阻滯調(diào)控,.避免菌體生長(zhǎng)前期高表達(dá)對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，同時(shí)減少菌體蛋白酶對(duì)目的蛋白的降解，從而大大提高目的蛋白的表達(dá)量，特別適宜于對(duì)宿主菌有毒性的目的蛋白的表達(dá)；pQE-80L還可使表達(dá)蛋白的氨基端帶上6個(gè)組氨酸標(biāo)簽(His-tag),利用6xHis-tag與N廣的高度親和力，方便采用Ni2+-NAT樹脂親和層析法對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，使其純度達(dá)90%以上，同時(shí)也利于用抗His的抗體進(jìn)行鑒定。可用于構(gòu)建本發(fā)明工程菌的宿主菌沒(méi)有特別限制，4戈表性例子包括DH5ct、JM109、M15、BL21等多種大腸桿菌。本發(fā)明通過(guò)比較研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌BL21(DE3)菌林是特別優(yōu)選的宿主菌。BL21(DE3)大腸桿菌為L(zhǎng)on蛋白酶和PmpT蛋白酶缺陷型，在進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物的純化時(shí)可以保持目的蛋白的穩(wěn)定，使其不被降解。利用本發(fā)明的重組表達(dá)載體構(gòu)建工程菌，所得工程菌可用常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)，制備肺吸蟲ESP蛋白。本發(fā)明通過(guò)系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)條件下，誘導(dǎo)溫度和時(shí)間對(duì)肺吸蟲ESP蛋白的表達(dá)影響最大，特別優(yōu)選的誘導(dǎo)表達(dá)方法為采用含氨爺青霉素的液體LB培養(yǎng)基，于溫度37。C振搖培養(yǎng)1小時(shí)后，再加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度為200nniol/L，并繼續(xù)培養(yǎng)5-6小時(shí)。采用此方法制備肺吸蟲ESP蛋白，蛋白表達(dá)量可由常規(guī)培養(yǎng)條件下的4%提高到20%(P<0.05),在擴(kuò)大培養(yǎng)的條件下，產(chǎn)量將進(jìn)一步提高。以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。應(yīng)當(dāng)理解，優(yōu)選實(shí)施例僅為了說(shuō)明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。(一)肺吸蟲ESP蛋白的重組表達(dá)載體的構(gòu)建1、引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)衛(wèi)氏并殖吸蟲以及其它寄生蟲半胱氨酸蛋白酶的保守氨基酸序列，設(shè)計(jì)并合成如下兼并引物(兼并引物是代表編碼單個(gè)氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物)Pl:5'-tea(ag)gg(agct)ca(ag)tg(ct)gg(agct)tc(agct)tg(ct)tgg-3'(SEQIDNo.3);P2:5'_cca(ag)ct(ag)tt(ct)tt(agct)ac(ag)ateca(ag)ta-3'(SEQIDNo.4);上述引物序列括號(hào)內(nèi)為該位點(diǎn)不同的堿基序列；2、肺吸蟲ESP蛋白編碼基因的RT-PCR擴(kuò)增取2條斯氏貍殖吸蟲成蟲(共60mg),經(jīng)體積百分濃度為0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液洗凈后，置勻漿器內(nèi)，立即加入Tripure試劑(美國(guó)Roche公司)2ml于水浴下勻漿，按照Tripure試劑說(shuō)明提取蟲體總RNA;采用RT-PCR試劑盒(北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及cDNA擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，以提取的蟲體總RNA為才莫板，以O(shè)ligo(dT)"為逆轉(zhuǎn)錄引物，反應(yīng)體系為濃度為0.1的總RNA10pl、濃度為0.5ixg/pl的01igo(dT)161pl、5x畫LV酶反應(yīng)緩沖液4pl、濃度為10mmol/L的dNTPs1Hl、醒LV逆轉(zhuǎn)錄酶200U、Rnasin20U、雙蒸水補(bǔ)充至總體積為20jil;反應(yīng)條件為37。C水浴2小時(shí)，95。C變性5分鐘終止反應(yīng)；PCR擴(kuò)增雙鏈cDNA,以逆轉(zhuǎn)錄制備的cDNA為才莫板，以步驟1所述兼并引物Pl、P2為上下游引物，反應(yīng)體系為10xPCR反應(yīng)緩沖液5pl、濃度為10mmol/L的dNTPs1>1、10倍稀釋的模板4pl、濃度為10nmol/L的上、下游引物各2pl、TaqDNA聚合酶3U、濃度為25mmol/L的MgCl2溶液2pl、雙蒸水補(bǔ)充至總體積為50反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5分鐘，然后94'C變性1分鐘、43t:退火2分鐘、72。C延伸2分鐘，共45個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸5分鐘；PCR結(jié)束后，采用質(zhì)量百分濃度為1°/。的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖1所示，其中1泳道為PCR分子量標(biāo)準(zhǔn)，2泳道為PCR產(chǎn)物，從圖可知，在約50Gbp的位置出現(xiàn)一條特異性DNA條帶，與理論預(yù)測(cè)值相符；采用SilverBeadsDNA膠回收試劑盒(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，按照試劑盒說(shuō)明操作，選擇約500bp的目的片段進(jìn)行切膠回收純化；3、肺吸蟲ESP蛋白編碼基因的克隆和陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的篩選將步驟2所得純化的目的片段與pMD18-T載體(寶生物工程(大連)有限公司)進(jìn)行TA連接，連接方法為濃度為10ng/Vl的目的片段5pl、濃度為50ng/pl的pQE-80L載體1pl、10x緩沖液1^1、T4DM連接酶200U、雙蒸水補(bǔ)充至總體積為10置溫度16。C孵育8小時(shí)，構(gòu)建重組克隆載體pMD18-T/ESP;將重組克隆載體pMD18-T/ESP轉(zhuǎn)化入CaClr法制備的DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化方法為將濃度為10ng/pl的重組克隆載體5pl加入到細(xì)胞密度為2x109的感受態(tài)細(xì)胞100pl中，冰浴30分鐘，42。C水浴熱^f木克90秒，立即冰浴2分鐘，再加入液體LB培養(yǎng)基，于溫度37。C，150r/min振搖l小時(shí)，制得轉(zhuǎn)化細(xì)胞；取轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布于藍(lán)白斑篩選培養(yǎng)基平板上，于溫度37。C倒置過(guò)夜，從平板上隨機(jī)挑取數(shù)個(gè)白斑，接種到含氨節(jié)青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于溫度37。C、150r/min振搖過(guò)夜，堿裂解法小量提取質(zhì)粒，用EcoRI、HindIII雙酶切和PCR法鑒定陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，酶切方法為濃度為300ng/^il的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒lO[il、濃度為20U/pl的EcoRI和HindIII內(nèi)切酶各lnl、10x緩沖液3pl、雙蒸水補(bǔ)充至總體積為30pl，置溫度37。C孵育4小時(shí)，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示兩條DNA帶，其中一條約500bp,與目的片段大小一致；以經(jīng)雙酶切鑒定為陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒為模^1，釆用兼并引物P1、P2為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，獲得一條約500bp的條帶，與步驟2所得PCR產(chǎn)物產(chǎn)生的條帶大小一致；4、肺吸蟲ESP蛋白編碼基因的序列測(cè)定取步驟3所得陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，委托上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)定插入片段的序列，獲得495bp的cDNA序列(如SEQIDNo.1所示)，在Genbank中進(jìn)行注冊(cè)，登錄號(hào)為AY083923;根據(jù)所得cDNA序列，用DNASIS程序推導(dǎo)出其編碼的氨基酸序列(如SEQIDNo.2所示)，并與相關(guān)蟲種的半胱氨酸蛋白酶進(jìn)行氨基酸序列同源性比較分析，分析結(jié)果顯示，該序列與相關(guān)蟲種的半胱氨酸蛋白酶存在較高同源性，組成半胱氨酸催化三聯(lián)體的半胱氨酸、組氨酸和天冬酰胺殘基高度保守；5、肺吸蟲ESP蛋白編碼基因的PCR擴(kuò)增才艮據(jù)步驟4所得cDNA序列，結(jié)合pQE-80L表達(dá)載體上的內(nèi)切酶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)如下特異性引物P3:5，-cgggatcccaaggtxaatgtggctc-3，(SEQIDNo.5)，下劃線部分為BamHI酶切位點(diǎn)；P4:5，-ccaagcttgattgttaaaaatagUgg-3，(SEQIDNo.6),下劃線部分為HindIII酶切位點(diǎn)；以步驟3所得陽(yáng)性克隆質(zhì)粒為模板，以特異性引物P3、P4為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后進(jìn)行切膠回收純化，再按照步驟3所述方法進(jìn)行克隆和陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的篩選，陽(yáng)性克隆質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序-驗(yàn)證克隆序列的順序正確性；6、肺吸蟲ESP蛋白的重組表達(dá)載體的構(gòu)建將步驟5經(jīng)測(cè)序鑒定的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示，其中1泳道為酶切產(chǎn)物，2泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，從圖可見(jiàn)兩條DNA帶，其中一條約500bp,與目的片段大小一致；將此DNA片段進(jìn)行切膠回收純化，并與按相同方法經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切消化后的pQE-80L載體進(jìn)行TA連接，定向構(gòu)建重組表達(dá)載體pQE-80L/ESP，其構(gòu)建流程如圖3所示。(二)肺吸蟲ESP蛋白的工程菌的構(gòu)建取(一)構(gòu)建的肺吸蟲ESP蛋白的重組表達(dá)載體pQE-80L/ESP，轉(zhuǎn)化入CaCl2法制備的BL21(DE3)大腸桿菌(美國(guó)Novagen公司)感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于含氨千青霉素的LB平板上，于溫度37。C正置1小時(shí)，倒置過(guò)夜，從LB平板上隨機(jī)挑取3個(gè)白色菌落，接種于液體LB培養(yǎng)基中，于溫度37°C、150r/min振搖過(guò)夜，提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板，采用特異性引物P3、P4為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定有無(wú)插入片4爻后，再通過(guò)序列測(cè)定確保插入方向正確，測(cè)序結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)獲得的質(zhì)粒為含有肺吸蟲ESP蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體pQE-80L/ESP,則實(shí)驗(yàn)獲得的含有該重組表達(dá)載體的陽(yáng)性克隆菌，即為成功構(gòu)建的工程菌pQE-80L/ESP-BL21。(三)利用重組表達(dá)載體pQE-80L/ESP制備肺吸蟲ESP蛋白1、工程菌的構(gòu)建利用(一)構(gòu)建的肺吸蟲ESP蛋白的重組表達(dá)載體pQE-80L/ESP，按照(二)所述方法構(gòu)建工程菌pQE-80L/ESP-BL21;2、工程菌的培養(yǎng)取步驟1所得工程菌菌落，同時(shí)設(shè)pQE-80L空載體轉(zhuǎn)化菌落和BL21(DE3)空菌株菌落為對(duì)照，接種于3ml含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于溫度37。C、150r/min振搖過(guò)夜；3、工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)取300pl步驟2過(guò)夜培養(yǎng)菌液，接種于30ml含氨千青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于溫度37°C、200r/min振搖培養(yǎng)1小時(shí)，加入濃度為200mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑300pi,繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)，收集菌液，9000g離心5分鐘，去除上清液，細(xì)菌沉淀用等體積的濃度為0.01mol/L、pH值為7.2的PBS洗滌3次后，用5倍體積的細(xì)菌裂解液重懸，再于水浴下超聲，條件為超聲5秒間隔5秒，重復(fù)50次，功率200W,取超聲后的勻漿物離心，收集上清液；4、表達(dá)產(chǎn)物的純化取步驟3收集的上清液，利用重組表達(dá)載體在表達(dá)蛋白氨基端引入的6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，以N廣-NTA樹脂(德國(guó)Qiagen公司)親和層析法進(jìn)行純化，按照說(shuō)明書中所述步驟操作，即得肺吸蟲ESP蛋白，置4。C保存。(四)鑒定1、重組表達(dá)載體的遺傳穩(wěn)定性方法挑取本發(fā)明工程菌pQE-80L/ESP-BL21的原代及第10、25、50代菌抹單菌落，分別接種于含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于溫度37。C培養(yǎng)過(guò)夜，菌液經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂布于含氨千青霉素的LB平板上，置溫度37。C培養(yǎng)12-16小時(shí)，再隨機(jī)挑選100個(gè)菌落接種到含氨千青霉素的LB平板上，置溫度37°C培養(yǎng)12-16小時(shí)，統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)出的菌落數(shù)，計(jì)算質(zhì)粒丟失率。結(jié)果見(jiàn)表l。結(jié)論本發(fā)明工程菌pQE-80L/ESP-BL21在LB平板傳代過(guò)程中，具有i好的遺傳穩(wěn)定性，重組表達(dá)載體pQE-80L/ESP可以穩(wěn)定保留。表1、本發(fā)明工程菌pQE-80L/ESP-BL21傳代時(shí)的遺傳穩(wěn)定性代次質(zhì)粒丟失率(°/。)1002515022、肺吸蟲ESP蛋白的表達(dá)量方法取(三)肺吸蟲ESP蛋白制備步驟3收集的上清液，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)肺吸蟲ESP蛋白的表達(dá)情況；并用凝膠薄層掃描儀(Bio-Rad公司)和Quantity-one軟件測(cè)定肺吸蟲ESP蛋白的表達(dá)量，同時(shí)與采用相同方法構(gòu)建的其它工程菌pET22b(+)/ESP-BL21、PinPointXa-1T/ESP-JM109的肺吸蟲ESP蛋白表達(dá)量進(jìn)行比較。結(jié)果表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE圖見(jiàn)圖4，其中1泳道為pQE-80L/ESP-BL21菌林，2泳道為BL21(DE3)空菌林，3泳道為pQE-80L空載體轉(zhuǎn)化菌林，4泳道為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，從圖可知，肺吸蟲ESP蛋白被BL21(DE3)大腸桿菌在IPTG誘導(dǎo)下高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物分子量大小為22kDa，與預(yù)計(jì)大小相一致。肺吸蟲ESP蛋白的表達(dá)量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2,本發(fā)明工程菌pQE-80L/ESP-BL21表達(dá)的肺吸蟲ESP蛋白在菌體總蛋白中所占比例為27.4%，而工程菌pET22b(+)/ESP-BL21、PinPointXa-lT/ESP-頂109的肺吸蟲ESP蛋白表達(dá)量分別為20.1%、12.4%。結(jié)論本發(fā)明構(gòu)建的重組表達(dá)載體pQE-80L/ESP和工程菌pQE-80L/E^P-BL21能夠高效表達(dá)肺吸蟲ESP蛋白。表2、幾種工程菌的肺吸蟲ESP蛋白表達(dá)量比較工程菌肺吸蟲ESP蛋白表達(dá)量(％)pQE-80L/ESP-BL2127.4pET22b(+)/ESP-BU120.1PinPointXa-lT/ESP-JM10912.43、肺吸蟲ESP蛋白的免疫反應(yīng)性方法采用半胱氨酸蛋白酶抑制劑捕獲酶聯(lián)免疫吸附法(CystatinCaptureEnzymeLinkedImmunosorbentAssay)測(cè)定肺p及蟲ESP蛋白的效j介。取樣史量反應(yīng)板，每孔加入濃度為0.1mol/L、pH值為9.6、含有濃度為lpg/ml的半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)的碳酸鹽緩沖液100pi,置溫度4。C過(guò)夜，用PBST(含有Tween-20的PBS)洗滌3次，加入質(zhì)量百分濃度為1%的脫脂奶粉溶液lOOpl,置溫度37'C封閉2小時(shí)，用PBST洗滌2次；將肺吸蟲ESP蛋白分別按i:io、i:20、i:40、i:80、i:160、i:320和i:640作倍比稀釋，再加至反應(yīng)孔中，每孔100ni，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(標(biāo)準(zhǔn)斯氏貍殖吸蟲排泄分泌抗原)和陰性對(duì)照，置溫度4。c過(guò)夜，加入i:ioo稀釋的斯氏貍殖吸蟲感染者血清100置溫度37。C孵育2小時(shí)，加入1:5000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的第二抗體100jil，置溫度37。C孵育2小時(shí)，加入新制底物緩沖液100jil，置溫度37。C孵育30分鐘，加入濃度為2mol/L的硫酸0.05ml終止反應(yīng)，反應(yīng)液用PBS稀釋后，用酶標(biāo)儀于490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度；同時(shí)與釆用相同方法構(gòu)建的其它工程菌pET22b(+)/ESP-BL21、PinPointXa-lT/ESP-JM109表達(dá)的肺吸蟲ESP蛋白的效價(jià)進(jìn)行比較。結(jié)果見(jiàn)表3，本發(fā)明工程菌pQE-80L/ESP-BL21表達(dá)的肺吸蟲ESP蛋白的效價(jià)為1:640，而工程菌pET22b(+)/ESP-BL21、PinPointTMXa-lT/ESP-JM109表達(dá)的肺吸蟲ESP蛋白的效價(jià)分別為1:320、1:160。結(jié)論本發(fā)明工程菌pQE-80L/ESP-BL21表達(dá)的肺吸蟲ESP蛋白免疫反應(yīng)性高。表3、幾種工程菌表達(dá)的肺吸蟲ESP蛋白的免疫反應(yīng)性比較工程菌肺吸蟲ESP蛋白的效價(jià)pQE-80L/ESP-BL211:640pET22b(+)/ESP-BL211:320PinPointXa-1T/ESP-JM109i:160(五)肺吸蟲ESP蛋白的應(yīng)用免疫印跡(Westernblotting)實(shí)驗(yàn)顯示，肺吸蟲ESP蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性，可作為肺吸蟲病特異診斷抗原。采用本發(fā)明的重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主菌，誘導(dǎo)表達(dá)肺吸蟲ESP蛋白，再用所得肺吸蟲ESP蛋白免疫動(dòng)物，可制備特異性抗體，還可進(jìn)一步制得肺吸蟲病檢測(cè)試劑或檢測(cè)裝置。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，采用肺吸蟲ESP蛋白和其多克隆抗體制得的肺吸蟲病檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)裝置，具有高度特異、敏感性，與肝吸蟲病、血吸蟲病的交叉反應(yīng)干擾小，假陽(yáng)性率低于ELISA法，并具有療效考核作用，在肺吸蟲病經(jīng)有效藥物治療后3-6月.，檢測(cè)結(jié)果將轉(zhuǎn)陰，轉(zhuǎn)陰率高于ELISA法，可以準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便地進(jìn)行肺吸蟲病的診斷與鑒別診斷、以及療效考核，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。1、制備肺吸蟲病檢測(cè)試劑盒一種肺吸蟲病檢測(cè)試劑盒，包括檢測(cè)條、樣品稀釋液，檢測(cè)條由樣品墊和吸收墊順序貼附于帶背襯的檢測(cè)層上構(gòu)成；檢測(cè)層上包被有抗人IgG抗體形成的檢測(cè)線和抗肺吸蟲ESP蛋白的多克隆抗體形成的質(zhì)控線；樣品稀釋液為濃度為0.01-0.05mol/L、pH值為7.0-7.2的PBS，內(nèi)含濃度為5-8pg/ml的膠體金標(biāo)記的肺吸蟲ESP蛋白、質(zhì)量百分濃度為1。/。的牛血清白蛋白即BSA;試劑盒內(nèi)還可設(shè)置樣品稀釋孔。所述檢測(cè)試劑盒的具體制備方法見(jiàn)中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)"肺吸蟲病檢測(cè)試劑盒及其制備方法"，申請(qǐng)?zhí)?008100695857,申請(qǐng)日2008.4.25。2、制備肺吸蟲病檢測(cè)裝置一種肺吸蟲病才全測(cè)裝置，包括標(biāo)記墊、檢測(cè)層，標(biāo)記墊中含有膠體金標(biāo)記的肺吸蟲ESP蛋白；檢測(cè)層上包被有抗人IgG抗體形成的才企測(cè)線和抗肺吸蟲ESP蛋白的多克隆抗體形成的質(zhì)控線；包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線的檢測(cè)層貼附于背板上，樣品墊、標(biāo)記墊及吸收墊順序貼附于檢測(cè)層上，蓋板扣蓋在貼附有樣品墊、標(biāo)記墊及吸收墊的檢測(cè)層上；蓋板上設(shè)有加樣孔和觀察孔。所述4企測(cè)裝置的具體制備方法見(jiàn)中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)"肺吸蟲病檢測(cè)裝置及其制備方法"，申請(qǐng)?zhí)?008100695842，申請(qǐng)日2008.4.25。3、肺吸蟲病檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)裝置的檢測(cè)方法與結(jié)果判定檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法取待測(cè)血清15-20(xl置樣品稀釋孔內(nèi)，用樣品稀釋液稀釋至50取出檢測(cè)條，將檢測(cè)條的樣品墊端浸入制備好的樣品中，放置約5-10分鐘，觀察結(jié)果。-檢測(cè)裝置的檢測(cè)方法取出檢測(cè)裝置，在加樣孔內(nèi)加入待測(cè)血清15-20放置約5-10分鐘，觀察結(jié)杲。結(jié)果判定當(dāng)檢測(cè)條(或檢測(cè)裝置)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紫紅色質(zhì)控線，同時(shí)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紫紅色檢測(cè)線，結(jié)果判為陽(yáng)性，記為"+";檢測(cè)線顏色越深，說(shuō)明被檢測(cè)樣品的抗體水平越高；當(dāng)檢測(cè)條(或檢測(cè)裝置)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紫紅色質(zhì)控線，沒(méi)有出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紫紅色4企測(cè)線，結(jié)果判為陰性，記為當(dāng)檢測(cè)條(或檢測(cè)裝置)沒(méi)有出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紫紅色質(zhì)控線，不管是否出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紫紅色檢測(cè)線，結(jié)果都判為檢測(cè)條(或檢測(cè)裝置)失效，應(yīng)廢棄。4、肺吸蟲病檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)裝置的鑒定(l)特異性方法采用本發(fā)明所述檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)裝置對(duì)肺吸蟲病患者、肝吸蟲病患者、血吸蟲病患者和健康者血清進(jìn)行檢測(cè)，并與ELISA法進(jìn)行比較；ELISA法為常規(guī)方法，即將抗原包被于PVC條板，取待測(cè)血清10pl，加入PBS90pl，置溫度37。C孵育30分鐘，洗滌3次，加入辣才艮過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的第二抗體，置溫度37。C孵育30分鐘，洗滌3次，3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色，酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，待檢孔OD值大于陰性對(duì)照2.1倍者為陽(yáng)性。結(jié)杲見(jiàn)表4。本發(fā)明所述檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)裝置和ELISA法檢測(cè)肺吸蟲病患者血清抗體的陽(yáng)性率分別為96.5%(55/57)和100.0%(57/57),兩法間差異無(wú)顯著性(0.05);采用本發(fā)明所述檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)裝置檢測(cè)肝吸蟲病患者血清、血吸蟲病患者血清和健康者血清，除血吸蟲病患者血清的交叉反應(yīng)率為5.0%外，其余兩者均為陰性，假陽(yáng)性率低于ELISA法。結(jié)論本發(fā)明所述檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)裝置具有高度特異性，可以用于肺吸蟲病的診斷，以及肺吸蟲病與其它吸蟲病的鑒別診斷。表4、本發(fā)明所述檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)裝置與ELISA法檢測(cè)不同血清的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(2)敏感性方法采用本發(fā)明所述4企測(cè)試劑盒或檢測(cè)裝置對(duì)28例疑似肺吸蟲病患者血清進(jìn)行檢測(cè)，并與ELISA法進(jìn)行比較；ELISA法為常^見(jiàn)方法。結(jié)果見(jiàn)表5。兩種方法檢測(cè)結(jié)果的總符合率為100%(21/28)。經(jīng)、2檢驗(yàn)，兩法間差異無(wú)顯著性(P>0.05)。檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的21例病人最終確診為肺吸蟲病患者，因此，兩種方法的敏感性均為100%。結(jié)論本發(fā)明所述檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)裝置具有高度敏感性。表5、本發(fā)明所述檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)裝置與ELISA法檢測(cè)敏感性比較<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>(3)療效考核作用方法在肺吸蟲病患者經(jīng)有效藥物治療后3個(gè)月與6個(gè)月，采用本發(fā)明所述檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)裝置對(duì)7例肺吸蟲病患者血清進(jìn)行檢測(cè)，并與ELISA法進(jìn)行比較；ELISA法為常規(guī)方法。結(jié)果采用本發(fā)明所述檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)裝置進(jìn)行檢測(cè)，7例肺吸蟲病患者經(jīng)有效藥物治療后3個(gè)月，有4例轉(zhuǎn)陰，轉(zhuǎn)陰率57.1%;治療后6個(gè)月，7例全部轉(zhuǎn)陰，轉(zhuǎn)陰率100.0%;而釆用ELISA法分別于治療后3個(gè)月、6個(gè)月檢測(cè)，無(wú)1例轉(zhuǎn)陰。結(jié)論采用本發(fā)明所述檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)裝置進(jìn)行檢測(cè)，轉(zhuǎn)陰率明顯高于ELISA法，可用于肺吸蟲病的療效考核。盡管通過(guò)參照本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施例，已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。<110〉中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)<120〉肺吸蟲排泄分泌蛋白的重組表達(dá)載體、工程菌、制備方法及其應(yīng)用<160>2<210>1<211>495<212>RNA<213>斯氏貍殖吸蟲(Pagumogoninmsskrjabini)<220><221><222>CDS(1).(495)<400>caaggtGinGly11caaGlntgtCysggcGly5tccSertgcCystggTrpgcgAlatttPhe10tcgSergtaValgtaValggaGlyaatAsn1545"tgaalieGluggtGlycaaGintggTrp20tttPheetcLeuaagLysaccThrggtGly25cagGincttLeuatelieagtSerctgLeu3090ageaaaSerLyscagGincaaGinttgLeu35gtcValgatAspCysgacAspaagLys40gtgValgacAspcacHisggaGlytgcCys45135aatggtAsnGlyggaGlytggTrpccaPro50ccaProtacTyracaThrtacTyrggcGly55gagGluatelieaaaLyseggArgttgLeu60180ggtggcGlyGlyttaLeugagGluacgThr65GinCMGingacAspUtTyrcccPro70tatTyrattlieggaGlyagaArgcagGin75225ceiaacgtgtagaatggataagtcgaagttgttgacgaaaategac270GinThrCysArgMetAspLysSerLysLeuLeuThrLyslieAsp808590gggteaattgttctggagagagatgagtataaacaggcagettgg315GlySerlieValLeuGluArgAspGluTyrLysGinAlaAlaTrp95100105etcgcagaacacggaccaatggetteaactetcaatgecaattat360LeuAlaGluHisGlyProMetAlaSerThrLeuAsnAlaAsnTyr110115120cttcagtactaccgatecggaateagtcatccgtecaggtatgag405LeuGinTyrTyrArgSerGlylieSerHisProSerArgTyrGlu125130135tgtaatcctgetagactgaaccacggcgtactgactgtgggctat450CysAsnProAlaArgLeuAsnHisGlyValLeuThrValGlyTyr140145150ggcacggaaaatggtattccctactggattgttaaaaatagttgg495GlyThrGluAsnGlylieProTyrTrplieValLysAsnSerTrp155160165<210>2<211>165<212>PRT<213>斯氏貍殖吸蟲(Pagumogonimusskrjabini)<400>2GinGlyGinCysGlySerCysTrpAlaPheSerValValGlyAsn151015lieGluGlyGinTrpPheLeuLysThrGlyGinLeulieSerLeu202530SerLysGinGinLeuValAspCysAspLysValAspHisGlyCys354045AsnGlyGlyTrpProProTyrThrTyrGlyGlulieLysArgLeu505560GlyGlyLeuGluThrGinGinAspTyrProTyrlieGlyArgGin657075GinThrCysArgMetAspLysSerLysLeuLeuThrLys丁leAsp808590GlySerlieValLeuGluArgAspGluTyrLysGinAlaAlaTrp95100105LeuAlaGluHisGlyProMetAlaSerThrLeuAsnAlaAsnTyr110115120LeuGinTyrTyrArgSerGlylieSerHisProSerArgTyrGlu125130135CysAsnProAlaArgLeuAsnHisGlyValLeuThrValGlyTyr140145150GlyThrGluAsnGlylieProTyrTrplieValLysAsnSerTrp155160165<210>3<211>18<212〉DM<213>人工序列<220><223>人工序列的描述兼并引物P1，括號(hào)內(nèi)為該位點(diǎn)不同的tt序列。<400>3tea(ag)gg(agct)ca(ag)tg(ct)gg(agct)tc(agct)tg(ct)tgg18<210>4<211>18<212>腿<213〉人工序列<220><223>人工序列的描述兼并引物P2，括號(hào)內(nèi)為該位點(diǎn)不同的石威基序列。<400〉4cca(ag)ct(ag)U(ct)U(agct)ac(ag)atcca(ag)ta18<210>5<211〉25<212>DNA<213>人工序列<220><223〉人工序列的描述特異性引物P3<400>5cgggatcccaaggtcaatgtggctc25<210〉6<211>27<212>薩<213>人工序列<220><223>人工序列的描述特異性引物P4<400>6ccaagcttgattgttaaaaatagttgg2權(quán)利要求1、肺吸蟲排泄分泌蛋白的重組表達(dá)載體，其特征在于含有肺吸蟲排泄分泌蛋白的編碼基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；表達(dá)載體為pQE-80L。2、肺吸蟲排泄分泌蛋白的工程菌，其特征在于含有權(quán)利要求l所述的肺吸蟲排泄分泌蛋白的重組表達(dá)載體，宿主菌為大腸桿菌。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的肺吸蟲排泄分泌蛋白的工程菌，其特征在于所述宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)菌抹。4、利用權(quán)利要求1所述重組表達(dá)載體制備肺吸蟲排泄分泌蛋白的方法，包括以下步驟a.工程菌的構(gòu)建將權(quán)利要求1所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入宿主菌感受態(tài)細(xì)胞，用含氨芐青霉素的LB平板進(jìn)行篩選培養(yǎng)，獲得陽(yáng)性克隆菌，即工程菌；b.工程菌的培養(yǎng)將步驟a所得工程菌接種于含氨節(jié)青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于溫度37'C振搖過(guò)夜；c.工程菌的i秀導(dǎo)表達(dá)取步驟b過(guò)夜培養(yǎng)菌液，按1:100的比例接種于含氨千青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于溫度37。C振搖培養(yǎng)1小時(shí)，加入異丙基好b代半乳糖苷即IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度為200pol/L,繼續(xù)培養(yǎng)5-6小時(shí)，收集菌液，離心，去除上清液，細(xì)菌沉淀用磷酸鹽緩沖液即PBS洗滌3次后，用5倍體積的細(xì)菌裂解液重懸，于冰浴下超聲，取超聲后的勻漿物離心，收集上清液；d.表達(dá)產(chǎn)物的純化取步驟c收集的上清液，利用重組表達(dá)載體在表達(dá)蛋白氨基端引入的6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，以Ni2+-NTA樹脂親和層析法進(jìn)行純化，即得肺吸蟲排泄分泌蛋白，置4'C保存。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備肺吸蟲排泄分泌蛋白的方法，其特征在亍所述步驟a使用的宿主菌為大腸桿菌。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備肺吸蟲排泄分泌蛋白的方法，其特征在于所述步驟a使用的宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)菌>^朱。7、利用權(quán)利要求1所述重組表達(dá)載體制得的肺吸蟲排泄分泌蛋白在制備肺吸蟲病檢測(cè)試劑或檢測(cè)裝置中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了肺吸蟲排泄分泌蛋白的重組表達(dá)載體、工程菌、制備方法及其應(yīng)用；本發(fā)明的重組表達(dá)載體含有肺吸蟲排泄分泌蛋白的編碼基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，表達(dá)載體為pQE-80L；本發(fā)明的工程菌含有本發(fā)明的重組表達(dá)載體，宿主菌為大腸桿菌；利用本發(fā)明的重組表達(dá)載體制備肺吸蟲排泄分泌蛋白的方法，包括工程菌的構(gòu)建、培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的純化4個(gè)步驟；所制得的肺吸蟲排泄分泌蛋白可用于制備肺吸蟲病檢測(cè)試劑或檢測(cè)裝置；本發(fā)明構(gòu)建的重組表達(dá)載體和工程菌，具有表達(dá)量高，表達(dá)穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)；通過(guò)本發(fā)明方法制備肺吸蟲排泄分泌蛋白，蛋白收率高且免疫反應(yīng)性高。文檔編號(hào)C12N1/21GK101319224SQ20081006991公開(kāi)日2008年12月10日申請(qǐng)日期2008年7月1日優(yōu)先權(quán)日2008年7月1日發(fā)明者張錫林申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)