專利名稱：PCR-mtDNA檢測總禽源性成分的擴增引物及其檢測試劑盒和使用方法
技術領域：
本發明主要涉及禽類源性成分的檢測，主要涉及使用PCR-mtDNA檢測總禽源性成分。
背景技術：
瘋牛病、禽流感、羊搔癢病在世界各地的蔓延和傳染給人類的事例，引起了各國政 府和消費者對肉食品、詞料安全性的高度關注。目前畜禽肉食品的動物源性成分的鑒別 檢測已涉及到肉食品的工業、進出口貿易、市場及餐飲業等領域。同時，國內外肉食品 及詞料貿易市場中的檢驗檢疫工作對高新技術的需求也越來越迫切。因此，研究出一種 準確、快速、可靠的鑒別總禽源性成分的方法，就非常有必要。目前，為了確定食物及飼料的真實性，已經開發了很多對動物源性成分鑒別的方法， 有物理、化學、免疫學和分子生物學等方法。在分子生物學方法中，分子標記技術以其快速、準確、穩定、高效等優點顯示出巨 大的開發潛力和廣闊的應用前景。目前在動植物源性成分鑒別檢測中應用的分子標記主 要包括核DNA 、 RNA、線粒體DNA (mtDNA)、和蛋白質分子標記等。PCR分子標記 鑒別檢測技術，具有特異性高、針對性強、靈敏度高、簡便快速、對檢測樣品要求低(幾 乎所有的樣本都可以作為PCR的材料，它只要求樣本中有完整的靶序列核酸)，因此， 無論是經過遠途運輸或低溫保存多年的陳舊樣本，都可以用于PCR擴增。哺乳動物和禽類mtDNA在遺傳上相對獨立，是雙鏈的超螺旋環狀分子，具有基因 組小(約16kb)、沒有重復序列、生物個體內無組織特異性、每個細胞中含有大量線粒 體基因組(哺乳動物約1000 2300個拷貝)等特點。因此，用mtDNA分子標記鑒別畜 禽肉食品及詞料動物源性成分與核DNA分子標記相比，具有靈敏度高、精確度好、快 速、降解小(加工過程中mtDNA保持較完整)、穩定易操作等優勢。基于動物mtDNA 的PCR分子標記技術的上述特點，因此在動物源性成分鑒別檢測中的應用具有廣闊的 前景。國外已對牛、綿羊、豬、雞的源性成分進行了研究報道，國內對牛、綿羊、豬、雞、 驢、馬、鹿屬進行了研究報道。在用分子生物學方法鑒定檢測動物源性成分的研究上， 國內外尚未見到對總禽源性成分鑒別檢測的研究報道。發明內容-本發明的目的在于避免現有技術的不足之處而提供一種PCR-mtDNA檢測總禽源性成分的擴增引物及其特異性引物的擴增條件。本發明的另一目的是提供一種PCR-mtDNA檢測總禽源性成分的檢測試劑盒。 本發明的還有一個目的是提供一種PCR-mtDNA檢測總禽源性成分的檢測試劑盒的使用方法。以準確、快速、可靠的用PCR-mtDNA技術鑒別總禽源性成分。 本發明的目的可以通過采用以下技術方案來實現 一種用于檢測總禽源性成分的 特異性PCR-mtDNA擴增引物，其主要特點是上下游長度分別為18bp和19bp的核苷酸，序列如下上游引物 PF(18bp): 5'-AGAACTACGAGCACAAAC陽3'; 下游引物 PR(19bp): 5'-GCTATACCTTGACCTGTCT-3'。所述的用于檢測總禽源性成分的特異性PCR-mtDNA擴增引物，還包括有所述的特 異性引物的擴增條件為用聚合酶鏈反應進行擴增，94"C預變性5min， 1個循環，然后進 入PCR循環94。C變性30sec， 54'C退火30sec， 72'C延伸20sec，設計35個循環，最后 72'C延伸3min。所述的用于檢測總禽源性成分的特異性的PCR-mtDNA檢測的試劑盒，包括有① 10XPCR緩沖液，其中含Mg2+20 ,L/L;②dNTP ,其中2. 5畫L/L ;③上游引物PF， 其中25pmoL/L;④下游引物PR，其中25pmoL/L;⑤Taq酶，2U/l^L;⑥滅菌超純水；⑦ DNA模板。所述的用于檢測總禽源性成分的特異性的PCR-mtDNA檢測的試劑盒的使用方法， 其主要特點是包括有如下步驟.-(1) 待檢物DNA的提取；(2) 將試劑盒中各組分與待檢物DNA混合，按權利要求2的條件進行PCR擴增；(3) PCR產物經1.5。/。瓊脂糖凝膠電泳檢測。含有總禽源性成分的檢測物被引物PF+PR 擴增出DNA特異性片段,呈陽性。所述的用于檢測總禽源性成分的特異性的PCR-mtDNA檢領啲試劑盒的使用方法，所述的DNA的提取有如下步驟① 稱取0.03g研碎的待檢測物樣品于高壓滅菌后的1.5ml離心管中，加入500^1 細胞裂解液消化；② 加入蛋白酶Kl(Hd，濃度為20mg/ml慢速攪拌使之溶解并混勻，如需要可再次 加入蛋白酶K，置于50'C水浴中消化過夜，適時混勻多次；③ 將細胞裂解液冷卻至室溫，加入等體積的Tris飽和酚，溫和地轉動離心管混勻 兩相，使水相與酚形成乳狀液； 4°C13000rpm/min離心10min，從離心機中取出離心管，禁止晃動，有清晰的 分層，上層為水相，提取的DNA便在這上層水相中，下層為酚相， 一般為黃色， 中間有白色的絮狀物為蛋白質。用大口的tip頭(用剪刀將lml Tip頭口剪成 大于3mm的口，使孔徑變大，以免核酸通過吸頭時發生機械剪切)小心吸出上 層水相，移至另一干凈離心管中，盡量不要吸出兩相的交界面；⑤加入RNase3ul ，濃度為1.5ul /ml，輕輕混勻37。C水浴lh; 降至室溫后，再加入等體積酚氯仿:異戊醇，其比例為25:24:1，溫和的混 勻兩相，振蕩2min，形成均勻乳濁液；(Z)重復步驟④；⑧ 加入等體積的氯仿異戊醇，其比例為24:1，使兩相充分混勻繼續抽提；⑨ 重復步驟④；⑩ 在水相中加入1/10體積的3MNaAc混勻后，再加入兩倍體積的預冷的無水乙 醇，棄上清液；0)用70%乙醇漂洗1次，13000rpm離心5min，棄上清液，將離心管倒置于滅菌 的濾紙上10 15min使乙醇揮發，干燥10 15min; 加入3(^1 TE緩沖液，室溫放置24h，然后4'C保存備用。 CZ)重復步驟④；本發明的有益效果是，近年來隨著數個國家高致病性禽流感的相繼發生，除雞以外 己波及到人、天鵝、貓等的死亡，因感染禽流感而致死的人數不斷增加，禽類食品和飼 料的安全性已關系到人類的安危。因此，研究出準確、快速、可靠的鑒別禽類動物源性 成分的方法和技術，對有效抵御禽流感及其它禽類疫病的傳播和蔓延，具有重要的現實 意義。本研究以滅菌超純水對禽類DNA模板進行稀釋，使其濃度分別降低到12ng/ul、 1.2ng/ul 、 120pg/ul、 12pg/ul、 1.2pg/ul、 120fg/ul、 12fg/ul、 1.2fg/ul，然后進行PCR擴增。由PCR產物電泳結果可知，能檢測到的最低濃度為120pg/ul,即該引物的靈敏度 是120pg/ul。


圖1為鵪鴉、鴿、雞、鴨、鵝、鴕鳥、鷓聘、牛、羊、馬、驢、魚動物的基因組DNA的電泳檢測結果圖；圖2為含鵪鶉、鴿、雞、鴨、鵝、鴕鳥、鷓鴣、牛、羊、馬、驢、魚飼料基因組 DNA的電泳檢測結果圖；圖3總禽的特異性弓l物驗證圖；圖中2kb Marker; DNA:1:鵪鶴；2:鵒3:雞；4鴨；5:鵝；6:鴕鳥；7: 鷓鴣；8:牛；9 :羊；10:馬；11:驢；12:魚；13:空白對照。 圖4含動物源性成分飼料的特異性引物驗證圖；圖中2kb Marker; DNA:1:鵪享鳥；2:鵒3:雞；4鴨；5:鵝；6:鴕鳥；7: 鷓鴣；8:牛；9 :羊；10:馬；11:驢；12:魚；13:空白對照。圖5總禽特異性PCR靈敏度驗證結果檢測電泳圖。
具體實施例方式以下對所示之最佳實施例作進一步詳述 實施例l:對鵪鶉、鴿、雞、鴨、鵝、鴕鳥、鷓鴣、牛、羊、馬、驢、魚動物和含鵪 鶉、鴿、雞、鴨、鵝、鴕鳥、鷓鴣、牛、羊、馬、驢、魚源性成分飼料檢測驗證實驗。(1) 總DNA的提取采用酚氯仿抽提法，提取鵪鶉、鴿、雞、鴨、鵝、鴕鳥、鷓鴣、牛、羊、馬、驢、 魚動物的基因組DNA和含鵪鶉、鴿、雞、鴨、鵝、鴕鳥、鷓鴣、牛、羊、馬、驢、 魚源性成分飼料DNA，電泳檢測結果(如圖l、 2)。提取基因組DNA均經紫外分光光 度計測定其純度和濃度。測定OD260/OD280值均為1.8左右，說明DNA純度較高符合 PCR擴增要求。(2) PCR-mtDNA特異性引物的設計比較GenBank中公布的各種動物線粒體基因序列，依據其物種保守序列設計出鑒別 檢測總禽源性成分的PCR特異性引物(只能擴增出總禽DNA限制性片段，而擴增不出 其它哺乳動物DNA限制性片段)，引物如下上游引物 PF(18bp): 5'-AGAACTACGAGCACAAAC-3';下游弓l物 PR(19bp): 5'-GCTATACCTTGACCTGTCT-3';擴增序列長度為208—215bp。 (3)總禽引物的特異性驗證利用所設計的總禽特異性引物PF和PR，分別對鵪鶉、鴿、雞、鴨、鵝、鴕鳥、鷓 鴣、牛、羊、馬、驢、魚等動物組織DNA和含鵪鶉、鴿、雞、鴨、鵝、鴕鳥、鷓鴣、牛、 羊、馬、驢、魚源性成分飼料DNA為模板進行PCR擴增。(3.1) 10XPCR緩沖液(含Mg"20 mmoL/L) 2. 5|4; dNTP (2.5國L/L) , 0.5|4; 上游引物PF (25pmoL/L) 1. 0W; 下游弓I物PR (25pmoL/L) LOW; T叫酶(2U/MU 0.5^1; DNA模板 1.014; 加滅菌超純水至25Pl。(3.2) PCR反應條件94。C預變性5min， 1個循環，然后進入PCR循環94。C變性30sec， 54。C退火30sec， 72'C延伸20sec，設計35個循環，最后72'C延伸3min。 原理1) 模板DNA的變性模板DNA經力B熱至94。C5min后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴 增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做準備；2) 模板DNA與引物的復性模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至57。C，弓|物 模板DNA單鏈的互補序列配對結合；3) 引物的延伸DNA模板-引物結合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反 應原料，耙序列DNA序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板 DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環變性-復性-延伸三個過程，就可獲得更多的"半 保留復制鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。從擴增產物電泳結果圖(圖3、 4)可以看出，只能從鵪鶉、鴿、雞、鴨、鵝、鴕鳥、 鷓鴣的DNA模板和含鵪鵓、鴿、雞、ff鵝、鴕鳥、鷓鴣源性成分飼料DNA中擴增出 大小約為210bp的片段，與預期目的片段大小基本一致，而哺乳動物和魚擴增結果均無 擴增條帶出現。 (4)引物的準確性驗證用總禽引物分別擴增雞、鴨、鴿、鵝、鵪鶉、鴕鳥、鷓鴣DNA，其PCR-mtDNA產物測序結果如下(4. 1)擴增雞DNA產物測序序列agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60 gaggagcctg ttctataatcgataatccac gattcaccca accacccctt gccagcacag 120 cctacataccgccgtcgcca gcccacctct aatgaaagaa caacagtgag ctcaatagcc 180cctcgctaat aagacaggtc aaaggtatag c 211 該序列長度為211bp，與GenBank中序列比較分析表明，與雞線粒體DNA的12sRNA 基因區段序列完全一致，符合率達到99%。(4.2) 擴增鴨DNA產物測序序列agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccta aacccaccta 60gaggagcctg ttctgtaatc gatgatccac gatcaaccca accgcccctt gccaagcaca120gcctacatac cgccgtcgcc agcccacctc gaatgagagc gcaacagtgg gcgcaacagc180 accccgctaa taagacaggt caaggtatag c 211 該序列長度為211bp，與GenBank中序列比較分析表明，與鴨線粒體DNA的12sRNA 基因區序列完全一致，符合率達到100%。(4.3) 擴增鵒DNA產物測序序列agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aatccaccta 60gaggagcctg ttctgtaatc gatactccac gatacacccg accacttctt gccatggaca120gcctacatac cgccgtcgcc agctcacctc ctctgagagc actacagtga gcacaaccgc 180 cctaaccccg ctaacaagac aggtcaaggt atagc 215 該序列長度為215bp，與GenBank中序列比較分析表明，與鴿線粒體DNA的12sRNA 基因區段序列完全一致，符合率達到94%。(4.4) 擴增鵝DNA產物測序序列agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60gaggagcctg ttctacaatc gataatcccc gattaacccg accacccctt gccagcacag 120cctacatacc gccgtcgcca gcccacctcg aatgagagaa caacagtgga cacaatagca 180 ccccgctaat aagacaggtc aaggtatagc 210該序列長度為210bp，與GenBank中序列比較分析表明，與鵝線粒體DNA的12sRNA 基因區段序列完全一致，符合率為100%。(4.5) 擴增鵪鶉DNA產纟勿測序序列agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60gaggagcctg ttctataacc gataatccac gatctaccca accacccctt gccaacacag 120cctacatacc gccgtcgcca gcccacctta atgaaagaac aacagtgagc tcaatagccg 180ccactaataa gacaggtcaa ggtatagc 208 該序列長度為208bp，與GenBank中序列比較分析表明，與鵪鶉線粒體DNA的 12sRNA基因區段序列完全一致，符合率為100%。(4.6) 擴增鴕鳥DNA產物測序序列agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60gaggagcctg ttctataatc gataatccac gattcaccca accacccctt gccatgcagc 120ctacataccg ccgtcgccag cccgcctcat gagagaacaa tagcgagcac aatagcccac 180ccgctaacaa gacaggtcaa ggtatagc 208 該序列長度為208bp，與GenBank中序列比較分析表明，與鵪鶉線粒體DNA的 12sRNA基因區段序列完全一致，符合率達到99%。(4.7) 擴增鷓鴣DNA產物測序序列agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60gaggagcctg ttctataatcgataatccacgattcaccca accatccttt gccaacacag 120cctacatacc gccgtcgcca gctcacctcc aatgaaagag caacagtgag cccaacagtc 180tccactaata agacaggcaa aggtatagc 209該序列長度為209bp，與GenBank中序列比較分析表明，與鷓鴣，藍孔雀等33條 鳥類線粒體DNA的12sRNA基因區段序列完全一致，符合率達到93%。以上測序結果的分析表明所建立的禽類源性成分PCR-mtDNA檢測技術具有準確 性、特異性、可靠性。 (6)特異性PCR的靈敏度驗證以滅菌超純水對目標禽類的DNA模板進行稀釋，使其濃度分別降低到12ng/ul、 1.2ng/ul 、 120pg/ul、 12pg/ul、 1.2pg/ul、 120fg/ul、 12fg/ul、 1.2fg/ul，然后用總禽特 異性引物PF和PR進行PCR擴增。由PCR產物電泳結果圖(圖3)可知，能檢測到的 最低線為120pgM,即該引物的靈敏度是120pg/ul。實施例2:對含有禽類源性成分的飼料的PCR檢測方法。分別對含有含鵪鶉、鴿、雞、鴨、鵝、鴕鳥、鷓鴣、牛、羊、馬、驢、魚源性成 分飼料進行檢測。 (一)提取跳采用酚氯仿抽提法(參照"分子克隆試驗指南(第二版).北京科學出版 社，1995:34 60")① 稱取0.03g研碎的待檢測物樣品于高壓滅菌后的L5ml離心管中，加入50(^1 細胞裂解液消化；② 加入蛋白酶K(20mg/ml)l(Vl，慢速攪拌使之溶解并混勻，如需要可再次加入蛋 白酶K，置于50'C水浴中消化過夜，適時混勻多次；③ 將細胞裂解液冷卻至室溫，加入等體積的Tris飽和酚，溫和地轉動離心管混勻 兩相，使水相與酚形成乳狀液；④4。C13000rpm/min離心10min;小心從離心機中取出離心管，禁止晃動，可見 有清晰的分層，上層為水相，提取的DNA便在這上層水相中，下層為酚相，一 般為黃色，中間可見有白色的絮狀物為蛋白質。用大口的tip頭(用剪刀將lml Tip頭口剪成大于3mra的口，使孔徑變大，以免核酸通過吸頭時發生機械剪切) 小心吸出上層水相，移至另一干凈離心管中，盡量不要吸出兩相的交界面； 加入RNase (1%) 3 u 1 (1. 5 u 1 /ml)，輕輕混勻37。C水浴lh; 降至室溫后，再加入等體積酚氯仿異戊醇(25:24:1)溫和的混勻兩相，振 蕩2min，形成均勻乳濁液；⑦ 重復步驟④；⑧ 加入等體積的氯仿異戊醇(24:1)，使兩相充分混勻繼續抽提； 重復步驟 ;⑩在水相中加入1/10體積的3M醋酸鈉混勻后，再加入兩倍體積的預冷的無水 乙醇，棄上清液；@用70%乙醇漂洗1次，13000rpm離心5min，棄上清液，將離心管倒置于滅菌 的濾紙上10 15min使乙醇揮發，干燥10 15min;⑩加入30ri TE緩沖液，室溫放置24h，然后4"C保存備用。(二) 引物合成將上游引物PF(18bp): 5'-AGAACTACGAGCACAAAC-3';下游引物PR(19bp): 5'-GCTATACCTTGACCTGTCT-3'送往生物公司合成，每條引物各20D ，用時稀釋到 25pmol/L。(三) PCR擴增PCR反應試劑盒10XPCR緩沖液(含Mg"20 mmoL/L)2. 5W;d證(2. 5 ,L/L)0.PF (25pmoL/L)PR (25praoL/L)1. 014Taq酶(2U/叱)0.514DNA模板加滅菌超純水至25W。將試劑盒中各組分與待檢物DNA混合。 PCR反應條件94'C預變性5min， 1個循環，然后進入PCR循環94'C變性30sec， 54。C退火30sec, 72'C延伸20sec，設計35個循環，最后72'C延伸3min。(四) 電泳檢測 ' PCR產物經1.5y。瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增產物電泳結果圖(見圖4)(五) 檢測結果含有禽類源性成分的檢測物會被引物PF+PR擴增出DNA特異性片段，呈陽性。 實施例3:基因組DNA的提取試劑的制備(1)細胞裂解液的制備① 1M Tris-HC1 250mL:稱30.285gTris，加水定容至250mL，加HC1調解pH至8. 0，高壓滅菌，4'C保存。② 0. 5mol/L EDTA:在lOOmL雙蒸水中加入37. 22g EDTA-Na2. 2H20,劇烈攪拌，用Na0H調節pH至8. 0 (約需4gNaOH)，定容至200 raL，分裝后高壓滅菌，4'C保存。③ 10% (m/v) SDS:將10g SDS溶于90mL雙蒸水中，加熱至68°C (助溶幾滴濃HC1， pH=7. 2)，加水定 容至100mL，分裝備用，室溫保存，無須滅菌。取lmol/L的Tris-HCl (pH8. 0) 2mL、0. 5mol/L的EDTA (pH8. 0)40mL、10% (m/v) 的SDS 10mL，加滅菌雙蒸水定容至200mL。(2) 20mg/ml蛋白酶K的制備100mg蛋白酶K溶于5ml滅菌雙蒸水，-20 。C保存。(3) 氯仿異戊醇(24:1):按24: 1的體積將氯仿、異戊醇混合，置棕色瓶中4'C 保存。(4) 苯酚氯仿異戊醇(25: 24: 1)的制備:按25: 24: 1的體積將苯酚、氯仿、 異戊醇混合，置棕色瓶中保存于4'C。(5) 3麗aAc的制備稱取40. 8gNaAc. 3H20，溶解，加水至100mL。高壓滅菌15min ， 4。C保存。(6) 10mg/ml RNase A的制備稱取RNase A lOmg溶于10ramol/L Tris-HC1 (pH7. 5)、 15mmol/L NaCl中于IOO'C加熱煮沸15min滅活DNase，緩慢冷卻至室溫，分 裝成小份保存于一2(TC。如為Sigma公司產品， 一般則不需加熱煮沸。序列表〈110〉張利平 張慧霞〈120〉 PCR-mtDNA檢測總禽源性成分的擴增引物及其檢測試劑盒和使用方法 〈160〉 7〈210〉 1 〈211〉 211 〈212〉 DNA〈213〉擴增雞DNA產物測序序列 〈400〉agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60 gaggagcctg ttctataatcgataatccac gattcaccca accacccctt gccagcacag 120 cctacataccgccgtcgcca gcccacctct aatgaaagaa caacagtgag ctcaatagcc 180 cctcgctaat aagacaggtc aaaggtatagc 211〈210〉 2 〈211〉 211 〈212〉腿〈213〉擴增鴨DNA產物測序序列 〈400〉agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccta aacccaccta 60gaggagcctg ttctgtaatc gatgatccac gatcaaccca accgcccctt gccaagcaca 120gcctacatac cgccgtcgcc agcccacctc gaatgagagc gcaacagtgg gcgcaacagc 180accccgctaa taagacaggt caaggtatagc 211〈210〉 3 〈211〉 215 〈212〉 DNA〈213〉擴增鵒DNA產物測序序列 〈400〉agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aatccaccta '60gaggagcctg ttctgtaatc gatactccac gatacacccg accacttctt gccatggaca 120 gcctacatac cgccgtcgcc agctcacctc ctctgagagc actacagtga gcacaaccgc 180 cctaaccccg ctaacaagac aggtcaaggt' atagc 215〈210〉 4 〈211〉 210 〈212〉隨〈213〉擴增鵝DNA產物測序序列 〈400〉agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60gaggagcctg ttctacaate gataatcccc gattaacccg accacccctt gccagcacag 120cctacatacc gccgtcgcca gcccacctcg aatgagagaa caacagtgga cacaatagca 180ccccgctaat aagacaggtc aaggtatagc, 210〈210〉 5 〈211〉 208 〈212〉 DNA〈213〉擴增鵪鶉DNA產物測序序列 〈400〉agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60 gaggagcctg ttctataacc gataatccac gatctaccca accacccctt gccaacacag 120 cctacatacc gccgtcgcca gcccacctta atgaaagaac aacagtgagc tcaatagccg 180 ccactaataa gacaggtcaa ggtatagc 208〈210〉 6 〈211〉 208 〈212〉 DNA〈213〉擴增鴕鳥DNA產物測序序列 〈400〉agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60<formula>formula see original document page 16</formula>
權利要求
1.一種用于檢測總禽源性成分的特異性PCR-mtDNA擴增引物，其特征是上下游長度分別為18bp和19bp的核苷酸，序列如下上游引物PF5′-AGAACTACGAGCACAAAC-3′；下游引物PR5′-GCTATACCTTGACCTGTCT-3′。
2. 如權利要求1所述的用于檢測總禽源性成分的特異性PCR-mtDNA擴增引物，其特 征是還包括有所述的特異性引物的擴增條件為9fC預變性5min， 1個循環，然后進 入PCR循環94。C變性30sec， 54。C退火30sec， 72'C延伸20sec，設計35個循環， 最后72'C延伸3min。
3. 如權利要求1所述的用于檢測總禽源性成分的特異性的PCR-mtDNA檢測的試劑盒，其特征是包括有①10XPCR緩沖液，其中含Mg2+20 mmoL/L;②dNTP ，其中2. 5 腿oL/L;③上游引物PF，其中25pmoL/L;④下游引物PR，其中25pmoL/L;⑤Taq 酶，2U/PL;⑥滅菌超純水；⑦DNA模板。
4. 如權利要求3所述的用于檢測總禽源性成分的特異性的PCR-mtDNA檢測的試劑盒的使用方法，其特征是包括有如下步驟(1) 待檢物DNA的提取；(2) 將試劑盒中各組分與待檢物DNA混合，按權利要求2的條件進行PCR擴增；(3) PCR產物經1.5y。瓊脂糖凝膠電泳檢測，含有總禽源性成分的檢測物被引物PF+PR 擴增出DNA特異性片段,呈陽性。
5. 如權利要求4所述的用于檢測總禽源性成分的特異性的PCR-mtDNA檢測的試劑盒的 使用方法，其特征是所述的DNA的提取有如下步驟① 稱取0.03g研碎的待檢測物樣品于高壓滅菌后的1.5ml離心管中，加入50(^1 細胞裂解液消化；② 加入蛋白酶K10^U，濃度為2amg/ml慢速攪拌使之溶解并混勻，如需要可再次 加入蛋白酶K，置于50'C水浴中消化過夜，適時混勻多次；③ 將細胞裂解液冷卻至室溫，加入等體積的Tris飽和酚，溫和地轉動離心管混勻 兩相，使水相與酚形成乳狀液；④4ri3000卬m/min離心10min，從離心機中取出離心管，禁止晃動，有清晰的 分層，上層為水相，提取的DNA便在這上層水相中，下層為酚相， 一般為黃色，中間有白色的絮狀物為蛋白質，用大口的tip頭吸出上層水相，移至另一干凈離心管中，盡量不要吸出兩相的交界面； 加入RNase3u 1 ，濃度為1. 5u 1 /ml，輕輕混勻37。C水浴lh; 降至室溫后，再加入等體積酚氯仿異戊醇，其比例為25:24:1，溫和的混勻兩相，振蕩2min，形成均勻乳濁液； 重復步驟 ; 加入等體積的氯仿異戊醇，其比例為24:1，使兩相充分混勻繼續抽提； 重復步驟④；⑩在水相中加入1/10體積的3麗aAc混勻后，再加入兩倍體積的預冷的無水乙 醇，棄上清液；(0)用70%乙醇漂洗1次，13000rpm離心5min，棄上清液，將離心管倒置于滅菌 的濾紙上10 15min使乙醇揮發，干燥10 15min;⑩加入30W TE緩沖液，室溫放置24h，然后4。C保存備用。
全文摘要
本發明主要涉及禽類源性成分的檢測，主要涉及使用PCR-mtDNA檢測總禽源性成分。一種用于檢測總禽源性成分的特異性PCR-mtDNA擴增引物，其主要特點是上下游長度分別為18bp和19bp的核苷酸，序列為上游引物PF(18bp)5’-AGAACTACGAGCACAAAC-3’；下游引物PR(19bp)5’-GCTATACCTTGACCTGTCT-3’。本發明的優點是，準確、快速、可靠的鑒別禽類動物源性成分的方法和技術，對有效抵御禽流感及其它禽類疫病的傳播和蔓延，具有重要的現實意義。本研究以滅菌超純水對禽類DNA模板進行稀釋，使其濃度分別降低到12ng/ul、1.2ng/ul、120pg/ul、12pg/ul、1.2pg/ul、120fg/ul、12fg/ul、1.2fg/ul，然后進行PCR擴增。由PCR產物電泳結果可知，能檢測到的最低濃度為120pg/ul，即該引物的靈敏度是120pg/ul。
文檔編號C12N15/11GK101270392SQ20081008240
公開日2008年9月24日 申請日期2008年3月3日 優先權日2008年3月3日
發明者吳建平, 卉 宗, 張利平, 張慧霞, 李麗娟, 阮周曦 申請人:張利平;張慧霞