專利名稱：：一種ba46重組腺相關病毒載體及其構建方法與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及載體及其應用，特別是涉及一種重組腺相關病毒載體及其構建方法與其在制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
：腺相關病毒(AAV)的基因結構已經被鑒定。1983年，Samulski等人描述了AAV的末端重復片段(上游5，端片段，下游3，端片段)(SamulskiRJ，SrivastavaA，BernsKI,MuzyczkaN.Rescueofadeno—associatedvirusfromrecombinantplasmids:genecorrectionwithintheterminalrepeatsofAAV.Cell.33:135-143.)。1984年，Hermonat等人描述了AAV的低感染顆粒(lip)基因和包膜(cap)基因(HermonatPL,LabowMA，WrightR，BernsKI，MuzyczkaN.Geneticsofadeno-associatedvirus:isolationandpreliminarycharacterizationofadeno-associatedvirustype2mutants.J"Virol.51:329—339.Hermonat,P丄，andMuzyczka,N.Useofadeno-associatedvirusasamammalianDNAcloningvector:transductionofneomycinresistanceintomammaliantissueculturecells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466-6470.)。1986年，Labow等人鑒定了位于上游5'端片段和r印基因之間的p5啟動子(LabowMA,HermonatPL，BernsKI.Positiveandnegativeautoregulationoftheadeno-associatedvirustype2genome.JVirol.160:251—258.)。1984年，美國博沃基因國際有限公司的主要技術技術負責人之一PaulL.Hermonat教授率先證明AAV載體可用于人類疾病的基因治療(Hermonat,P.L.，andMuzyczka,N.Useofadeno—associatedvirusasamammalianDNAcloningvector:transductionofneomycinresistanceintomammaliantissueculturecells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466-6470.)。目前，主要是歐美國家在進行以AAV為基礎的基因治療人類疾病的臨床試驗。據美國糧食和藥品管理局統計，現有十余項以AAV為基礎的基因治療臨床試驗正在進行，主要是將攜帶治療基因的AAV病毒注入患者體內，使其在體內表達治療基因，從而達到治療疾病的目的。主要針對治療的疾病有帕金森氏綜合癥、風濕性關節炎、血友病、心力衰竭、進行性肌萎縮和奧茲海默綜合癥等非腫瘤性疾病。但是，應用于臨床治療的AAV病毒仍存在一些問題，例如攜帶治療基因大小受到明顯限制，病毒本身不穩定，導致治療基因表達不穩定，以及造成療效不一致。雖然AAV病毒本身的免疫原性很弱，但所表達的治療基因容易在患者體內誘發自身免疫反應，甚至導致嚴重的毒副作用。AAV是一種非致病性的缺陷性病毒，需要其它病毒(如腺病毒)的基因產物輔助，才能裝配成為具有感染性的病毒顆粒。AAV基因組全長約4700堿基對(bp)，兩端為重復末端片段(TR)，中間為病毒的結構基因，包括與病毒復制有關的Wep基因和病毒衣殼&p基因。由于存在AAV病毒自身的不穩定性及其攜帶外源性基因(治療基因)長度有限等方面缺陷，因此有必要對其進行基因重組形成重組腺相關病毒(recombinantadeno-associatedvirus,rAAV)。現有大量研究表明，將AAV基因組中的結構基因刪除，可明顯增加外源性基因的容量。此外，將具有治療作用的外源性基因插入rAAV中，制備成具有感染性的rAAV病毒顆粒，注射入患者體內，使其感染體內細胞，進而表達治療基因，從而達到治療疾病的作用。目前，主要是將rAAV應用于帕金森氏綜合癥、風濕性關節炎、血友病、心力衰竭、進行性肌萎縮和奧茲海默綜合癥等非腫瘤性疾病的治療。但rAAV仍然存在一些不足，如重組病毒不穩定，病毒滴度低，接納治療基因的容量仍然有限(一般僅能插入的外源性基因片段最大約2000堿基對(bp)，否則rAAV的穩定性將被破壞)。因此，需要設計更為合理的重組腺相關病毒(rAAV)載體，以滿足實際應用的需要。
發明內容本發明的目的是提供一種穩定性高、攜帶外源性基因(BA46)的容量大的重組腺相關病毒(rAAV)載體。本發明所提供的BA46重組腺相關病毒載體，是將腺相關病毒(AAV)載體中的腺相關病毒結構基因替換為乳汁蛋白BA46基因或其突變型基因得到的重組腺相關病毒載體。本發明的BA46重組腺相關病毒載體是在已知的腺相關病毒載體的基礎上進行改造得到的，所述腺相關病毒結構基因為^ep和Cap/h》基因，BA46基因為一種腫瘤相關抗原基因，其突變型基因是具有相同功能的BA46基因片段。已知的腺相關病毒載體具有p5啟動子，為提高目的基因的轉錄水平，還可進一步將所述重組腺相關病毒載體中的p5啟動子替換為巨噬細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)啟動子、beta肌動蛋白啟動子和SV40病毒啟動子中的一個或幾個啟動子。本發明的第二個目的是提供上述BA46重組腺相關病毒載體的構建方法。本發明所提供的構建方法，是使用常規的基因重組的方法，先將腺相關病毒載體中的腺相關病毒結構基因剔除，再用乳汁蛋白BA46基因或其突變型基因取代該剔除基因，得到重組腺相關病毒載體。在上述BA46重組腺相關病毒載體的構建方法中，為提高目的基因的轉錄水平，還可進一步將所述重組腺相關病毒載體中的p5啟動子替換為巨噬細胞病毒啟動子、beta肌動蛋白啟動子和SV40病毒啟動子中的一個或幾個啟動子。與本發明BA46重組腺相關病毒載體相關的產品，包括重組腺相關病毒質粒、重組腺相關病毒顆粒和被本發明重組腺相關病毒載體感染或轉染的細胞系，如單核細胞-巨噬細胞-樹突狀細胞系、T淋巴細胞系等(所述重組腺相關病毒載體中的相關基因一BA46基因或其突變型基因可在單核細胞-巨噬細胞-樹突狀細胞系或T淋巴細胞系等細胞系中在轉錄啟動子的作用下獲得表達)等均屬于本發明的保護范圍。醫藥用途方面，本發明的另一個目的是提供一種抗腫瘤藥物。本發明所提供的抗腫瘤藥物的活性成分為上述BA46重組腺相關病毒載體或與本發明BA46重組腺相關病毒載體相關的產品。如以本發明的BA46重組腺相關病毒為載體，將腫瘤抗原-野生型和/或突變型BA46導入單核細胞-巨噬細胞-樹突狀細胞系，并誘導產生樹突狀細胞，以達到患者體外和體內免疫刺激的目的，用以治療某些腫瘤，或以該樹突狀細胞刺激產生的細胞毒性T淋巴細胞(例如但不僅局限于T淋巴細胞和B淋巴細胞)治療某些腫瘤。所述抗腫瘤藥物可用于治療乳腺癌等BA46抗原陽性惡性腫瘤。本發明所提供的藥物可采用溶劑或粉劑等劑型。所述溶劑的選擇是多種多樣的，如細胞培養液(基)、生理鹽水或磷酸鹽緩沖液等均可。需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述載體包括藥學領域常規的稀釋劑、吸收促進劑和表面活性劑等。用藥方式可為先分離出腫瘤患者體內的單核細胞，再將此藥感染或轉染患者的單核細胞。或將轉化有野生型和/或突變型BA46基因的成熟的樹突狀細胞所刺激產生的細胞毒性T淋巴細胞回輸腫瘤患者。上述藥物的用量一般為100nl/5X107每次，每月2次，療程通常為6個月。劑量和療程都可根據實際情況調整。為提高療效，本發明的藥物還可以與抗生素、免疫刺激劑和腫瘤靶向藥物等進行組合治療。本發明還提供了一種體外殺滅腫瘤的方法。本發明所提供的殺滅腫瘤的方法，可包括以下步驟l)將腫瘤所在體系(該體系可通過人工模擬的方式產生)中自然產生的單核細胞-巨噬細胞-樹突狀細胞或T淋巴細胞被本發明攜帶野生型BA46基因的重組腺相關病毒載體和/或攜帶突變型BA46基因的重組腺相關病毒載體感染或轉染，或被與本發明BA46重組腺相關病毒載體相關的產品處理，各自得到處理后的細胞；2)將步驟l)中處理后的單核細胞-巨噬細胞-樹突狀細胞加入腫瘤所在體系中殺滅腫瘤；或將未被處理的T淋巴細胞與所述處理后的單核細胞-巨噬細胞-樹突狀細胞混合培養形成抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞，再將該抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞加入腫瘤所在體系中殺滅腫瘤；或將被處理的T淋巴細胞和未被處理的單核細胞-巨噬細胞-樹突狀細胞加入腫瘤所在體系中殺滅腫瘤。本發明所述殺滅腫瘤的方法可具體應用到腫瘤治療中，包括給予一個腫瘤患者回輸抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞，該細胞由來源于患者的自然產生的T淋巴細胞與來源于該患者的單核細胞-巨噬細胞-樹突狀細胞混合培養產生的。在混合培養之前，這些在單核細胞-巨噬細胞-樹突狀細胞已經被本發明攜帶野生型BA46基因的重組腺相關病毒和/或攜帶突變型BA46基因的重組腺相關病毒載體感染或者轉染，或被與本發明BA46重組腺相關病毒載體相關的產品處理；或者，給予一個腫瘤患者回輸來源于患者的單核細胞-巨噬細胞-樹突狀細胞。在回輸之前，這些在單核細胞-巨噬細胞-樹突狀細胞已經被本發明攜帶野生型BA46基因的重組腺相關病毒和/或攜帶突變型BA46基因的重組腺相關病毒載體感染或者轉染，或被與本發明BA46重組腺相關病毒載體相關的產品處理；再或者，給予一個腫瘤患者回輸上述來源于患者的T淋巴細胞和來源于該患者的自然產生的單核細胞-巨噬細胞-樹突狀細胞。在回輸之前，這些T淋巴細胞已經被本發明攜帶野生型BA46基因的重組腺相關病毒和/或攜帶突變型BA46基因的重組腺相關病毒載體感染或者轉染，或被與本發明BA46重組腺相關病毒載體相關的產品處理。本發明提供了一種穩定性較高、外源性基因(BA46)容量大的重組腺相關病毒(rAAV)載體。在本發明的rMV載體中，AAV的結構基因y印和6Ht/h'p基因被野生型或突變型的BA46基因取代。本發明的重組腺相關病毒載體可將其攜帶的野生型或突變型的乳汁蛋白BA46基因輸送入單核細胞-巨噬細胞-樹突狀細胞系中，攜帶有這些特異性抗原基因的細胞被用于刺激免疫系統的效應細胞(不局限于T淋巴細胞和B淋巴細胞)。實驗證明，被本發明的rAAV感染的樹突狀細胞和所誘導的細胞毒性T淋巴細胞在患者體內可有效地抑制惡性腫瘤細胞的生長或者殺滅腫瘤細胞，因而，本發明的BA46重組腺相關病毒載體或與本發明BA46重組腺相關病毒載體相關的產品可被用于制備抗腫瘤藥物。本發明在乳腺癌等BA46抗原陽性惡性腫瘤的臨床應用中具有6重要的理論和實際意義，應用前景廣闊。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。圖1為重組腺相關病毒載體的結構示意圖圖2A為重組腺相關病毒載體rAAV/BA46的酶切檢測結果圖2B為重組腺相關病毒載體rAAV/BA46的PCR檢測結果圖3為重組腺相關病毒rAAV的制備流程圖圖4為重組腺相關病毒rAAV/BA46的病毒滴度檢測結果圖5為一種或多種攜帶腫瘤抗原基因的rAAV病毒感染腫瘤患者單核細胞為基礎的殺滅腫瘤實驗流程圖6為重組腺相關病毒rAAV/BA46感染外周血單個核細胞的效率檢測結果圖7為被重組腺相關病毒rAAV/BA46感染的DC表達CD80、CD83以及CD86水平的檢測結果圖8為rAAV/BA46感染的DC所誘導的CTL的IFN-y表達水平檢測結果圖9為rAAV/BA46感染的DC所誘導的CTL殺傷腫瘤細胞試驗以及殺傷特異性檢測結果圖10為一例乳腺癌患者經rAAV/BA46感染的DC所誘導的CTL治療前后轉移病灶變化情況的影像學觀測結果圖11為四例乳腺癌患者經rAAV/BA46感染的DC所誘導的CTL治療前后患者血清中CA27.29腫瘤抗原水平的變化情況具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，具體步驟可參見《MolecularCloning:ALaboratoryManual》(Sambrook，J.，Russell,DavidW.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdedition,2001，NY，ColdSpringHarbor)。所述百分比濃度如無特別說明均為質量/體積(w/v)百分比濃度或體積/體積(v/v)百分比濃度。所用引物、DNA序列合成及DNA序列測定均由美國Invitrogen公司完成。實施例1、重組腺相關病毒載體rAAV/BA46和rAAV/mBA46的構建及檢測材料及其來源A.攜帶AAV2型全基因組DNA的pBR322質粒(命名為pBR-AAV2):由美國博沃基因國際有限公司的主要技術技術負責人之一PaulL.Hermonat教授制備(Hermonat，P.L.,andMuzyczka，N.Useofadeno-associatedvirusasamammalianDNAcloningvector:transductionofneomycinresistanceintomammaliantissueculturecells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466—6470.)。B.人乳腺癌細胞從乳腺癌患者的癌組織中分離獲得或從商業渠道購買，免疫組化證實BA46陽性。C.攜帶CMV啟動子的pCI-neo質粒購于美國Promega公司，攜帶SV40早期啟動子的質粒pSG424購于美國Clonitic公司。D.基因擴增核苷酸引物根據美國基因庫中公開發表的人BA45mRNA序列(美國NCI基因庫U58516)設計。用下述方法構建本發明攜帶BA46基因或其突變型基因的重組腺相關病毒載體(如圖l所示)，具體過程包括以下步驟一、重組腺相關病毒載體的構建A.pBR-AAV2質粒的改建，具體方法為先用限制性內切酶萬W卵I和^al(購自美國Promega公司)將pBR-AAV2質粒中的腺相關病毒AAV基因組的結構基因/印和Zip/C邵基因完全切除，反應體系為lygpBR-AAV2，10U^sfM9I，10UI，2.5ul10X緩沖液D以及19.5ul去離子水；反應條件為在37"C下水浴4小時。然后，將含有限制性內切酶I和V酶切位點的核苷酸序列(CGAATTCATGCGATATCGTT)插入質粒中，反應體系為500ng質粒，300ngfcoiI和fcovV的核苷酸序列，10IUT4DNA連接酶(購自美國Promega公司)，1.5ul10XT4DNA連接緩沖液以及11.5ul去離子水；反應條件為在4'C下水浴8小時。然后，保留兩端完整的TR序列或將AAV基因組的兩端TR的第75位核苷酸序列處均插入由9個核苷酸組成的片段CTGCGCTGG，目的是提高rAAV病毒的穩定性以及提高病毒的復制效率，方法為首先用限制性內切酶^朋I(購自美國Promega公司)切割兩端的TR，反應體系為lug上述制備的質粒，10UI，1.5^1IOX緩沖液G以及11.5iU去離子水；反應條件為在37'C下水浴4小時，再將9個核苷酸片段插入質粒中，反應體系為500ng質粒，300ng9個核苷酸序列，10IUT4DNA連接酶(購自美國Promega公司)，1.5ul10XT4DNA連接緩沖液以及11.5u1去離子水；反應條件為在4'C下水浴8小時。B.采用基因擴增技術(多聚酶鏈反應，PCR)擴增CMV啟動子，SV40早期啟動子。具體方法為先以pCI-neo質粒(購自美國Promega公司)為模板，在引物1:AGATCTTCAATATTGGCCAT和引物2:TGTCAGAAGCACTGACTGC的引導下PCR擴增CMV啟動子，PCR擴增條件為先94。C4分鐘；再94。C30秒，60°C35秒，72°C1分鐘，共30個循環；最后72"C8分鐘，反應結束后，對PCR產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在740bp處出現一條預期的特異性條帶，將該目的條帶回收并純化后得到CMV啟動子。再以PSG424質粒(購自美國Clonitic公司)為模板，在引物3:GAACCAGCTGTGGAATGTGTC和引物4:TCAGGAAGCTTAGATCTAGC的引導下PCR擴增SV40早期啟動子，PCR擴增條件為先94。C4分鐘；再94。C30秒，60°C35秒，72°C40，秒，共30個循環；最后72'C8分鐘，反應結束后，對PCR產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在359bp處出現一條預期的特異性條帶，將該目的條帶回收并純化后得到SV40早期啟動子。C.PCR擴增beta肌動蛋白啟動子、全長BA46cDNA和部分BA46cDNA片段(分別命名為A(自5，端第54-393位堿基)、B(自5，端第394-771位堿基)、C(自5'端第772-1224位堿基)，本實施例以上述片段為例但不限于上述片段，其它與BA46cDNA具有相同功能的BA46cDNA片段均可用于構建本發明的重組腺相關病毒載體)，具體方法為采用核酸分離技術，從人乳腺癌細胞中分離總DNA和mRNA(也可人工合成或從商業渠道獲得)，然后以總DNA為模板，在引物5:CCCGGGCCCAGCACCCCAAG和引物6:CATCCATGGTGAGCTGCG的引導下PCR擴增beta肌動蛋白啟動子，PCR擴增條件為先94。C4分鐘；再94。C30秒，58°C35秒，72°Cl分鐘20秒，共30個循環；最后72°C8分鐘，反應結束后，對PCR產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢領1』，在1176bp處出現一條預期的特異性條帶，將該目的條帶回收并純化后得到beta肌動蛋白啟動子。再將mRNA反轉錄合成其cDNA并以此為模板，在引物7:CCGCAGCATGCCGCGCCC和引物8:CACTAACAGCCCAGCAGC的引導下PCR擴增全長BA46cDNA，PCR擴增條件為先94。C4分鐘；再94。C30秒，60°C35秒，72°C1分鐘30秒，共30個循環；最后72"C8分鐘，反應結束后，對PCR產物進行1.2X瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1173bp處出現一條預期的特異性條帶，將該目的條帶回收并純化后得到全長BA46cDNA，用上述相同方法得到BA46cDNA片段A(引物7和引物9:TGCGCGGTTCAGGCGGTTC)、BA46cDNA片段B(引物10:GGCATGGTCAATGCCTGGAC和引物11:CTTCAGGCCCAGGGGATT)、BA46cDNA片段C(引物12:AATAACAGCATCCCTGACAAGC和引物8)。D.采用DNA連接技術，將上述擴增的C匿啟動子、SV40早期啟動子、beta肌動蛋白啟動子、全長BA46cDNA或部分BA46cDNA片段依次插入步驟A經改建的pBR-AAV2載體中，為插入啟動子，首先進行酶切反應，然后進行連接反應，其中，酶切反應體系為hg質粒；10U限制性內切酶萬朋WI和I(購自美國Promega公司)，2.5iU10X緩沖液C以及19.5ul去離子水；反應條件為在37t:下水浴4小時，連接反應體系為500ng酶切后的質粒，300ng啟動子DNA，10IUT4DNA連接酶(購自美國Promega公司)，1.5ul10XT4DNA連接緩沖液以及11,5y1去離子水；反應條件為在4。C下水浴8小時。然后，將攜帶有啟動子的質粒和全長的BA46cDNA分別用限制性內切酶Me1禾卩#"I酶切。酶切反應以及進行連接反應的體系和條件與上述相同。最后分別得到攜帶有CMV啟動子、SV40早期啟動子、beta肌動蛋白啟動子和全長BA46cDNA的重組腺相關病毒載體(命名為rAAV/BA46)，以及攜帶有CMV啟動子、SV40啟動子、beta肌動蛋白啟動子和A或B或C不同BA46cDNA片段(突變型)的重組腺相關病毒載體(分別命名為rAAV/AmBA46、rAAV/BmBA46和rAAV/CraBA46，統一命名為rAAV/mBA46)。E.將連接后的DNA—rAAV/BA46和rAAV/mBA46分別導入基因工程大腸桿菌DH5a感受態細胞(美國Invitrogen公司)，用含100Pg/mL氨芐青霉素的LB平板進行抗性篩選，挑取白色單菌落，提取質粒并純化，得到rAAV/BA46質粒和rAAV/mBA46質粒。二、重組腺相關病毒載體的檢測先對步驟一獲得的經純化的rAAV/BA46質粒和rAAV/mBA46質粒用限制性內切酶(依次為尸WI、順eI&7fcfI、順eI&尸WI、順eI&AcoVV)進行酶切，所用限制性內切酶均購自美國Promega公司。反應結束后，對酶切產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其中rAAV/BA46質粒的檢測結果如圖2A所示(1.DNA分子量標準。2.rAAV/BA46(~I內切酶)。3.rAAV/BA46(順eI和淑I內切酶)。4.rAAV/BA46OV力eI和尸WI內切酶)。5.rAAV/BA46(MeI禾卩V內切酶)。)，經尸WI酶切獲得了361bp和789bp的特異性條帶，經順eI和I酶切獲得了1179bp的特異性條帶，經順eI和尸WI酶切獲得了1457bp的特異性條帶，經順eI和Ac^V酶切獲得了1790bp的特異性條帶，與預期結果相符。rAAV/mBA46質粒的酶切檢測結果也與預期結果相符。再對rAAV/BA46質粒和rAAV/mBA46質粒用基因擴增(PCR)的方法做進一步的檢測，其中rAAV/BA46質粒的檢測結果如圖2B所示(l.DNA分子量標準。2-3.陽性對照。4.BA46cDNA。)，經擴增獲得了1173bp的預期的特異性條帶。rAAV/mBA46質粒的PCR檢測結果也與預期結果相符(擴增產物的大小依次為rAAV/AmBA46:340bp、rAAV/BmBA46:378bp、rAAV/CmBA46:453bp)。上述檢測結果表明獲得了插入位置及序列均正確的攜帶BA46基因的重組腺相關病毒載體rAAV/BA46和以及攜帶BA46突變型基因的重組腺相關病毒載體rAAV/mBA46。實施例2、重組腺相關病毒(rAAV)的制備及病毒滴度測定材料及其來源A.實施例1構建的攜帶BA46基因的重組腺相關病毒載體rAAV/BA46和以及攜帶BA46突變型基因的重組腺相關病毒載體rAAV/mBA46(rAAV/AmBA46、rAAV/BmBA46和rAAV/CmBA46)。B.含AAV的R印基因和Lip/Cap基因的輔助質粒pHelper:由美國阿肯色大學醫學院附屬醫院基因治療中心劉勇教授構建(Liu，Y.，Chiriva-Internati,M.，Grizzi，F.Salati，E.，Roman,J.J.，LimS.，andHermonat,P丄RapidinductionofcytotoxicTcellresponseagainstcervicalcancercellsbyhumanpapillomavirustype16E6antigengenedeliveryintohumandendriticcellsbyanadeno-associatedvirusvector.CancerGeneTherapy8:948-957.)。C.含有整合于細胞染色體并表達的腺病毒基因(E1、E2A、E4、VAI和VAII基因)的AAV-HEK293細胞由美國阿肯色大學醫學院附屬醫院基因治療中心建立(Liu，Y.，Chiriva-Internati，M.,Grizzi，F.Salati,E.，Roman,J".J.，LimS.，andHermonat，P.LRapidinductionofcytotoxicTcellresponseagainstcervicalcancercellsbyhumanpapillomavirustype16E6antigengenedeliveryintohumandendriticcellsbyanadeno-associatedvirusvector.CancerGeneTherapy8:948-957.)。D.脂質體轉染試劑Lipofectin:購自美國Invotrogen公司。E.DMEM培養基和胎牛血清(或小牛血清)購自美國Cellgro公司。F.PCRDIG標記試劑盒和DIG雜交檢測試劑盒購自瑞士Roche公司。G.DNA拷貝數標準:分別為1012拷貝數(c叩ies)/y1至106(copies)/u1，購自美國Promega公司。一、重組腺相關病毒(rAAV)的制備參照圖3，用下述方法制備重組腺相關病毒(rAAV)，以制備一盤10.0cm細胞培養皿的病毒為例，當AAV-HEK293細胞在二氧化碳細胞培養箱中生長至約占培養皿面積70。^時，進行如下操作A.按照Lipofectin的使用說明進行操作將l.OugrAAV載體(rAAV/BA46或rAAV/mBA46)，1.0ixgpHelper質粒，4.0u1Lipofectin和50.0y1含5%胎牛血清(或小牛血清)的DMEM培養基混勻，室溫靜置20分鐘。B.將混合液加入細胞培養皿中，繼續置于二氧化碳細胞培養箱中培養。C.72小時后，收獲培養皿中的所有細胞和培養液。D.劇烈振蕩l分鐘后，離心，保留上清，即rAAV病毒液。E.將收集的rAAV病毒液過濾除菌。將獲得的攜帶腫瘤抗原基因二BA46基因全長BA46cDNA或部分BA46cDNA片段(A、B、C，突變型基因)的rAAV病毒分別命名為rAAV/BA46、rAAV/AmBA46、rAAV/BmBA46、rAAV/CmBA46。二、重組腺相關病毒(rAAV)的病毒滴度測定采用常規的斑點雜交法，對步驟一獲得的各種rAAV病毒(rMV/BA46、rAAV/AmBA46、rAAV/BmBA46、rAAV/CmBA46)進行病毒滴度測定，具體方法包括以下步驟僅所用的DNA探針為針對腫瘤抗原基因的特異性探針。A.采用常規的DNA苯酚/氯仿提取法，提取rAAV病毒顆粒DNA。B.將尼龍膜置于斑點印跡儀中，加入經堿變性的rAAV病毒顆粒DNA，并加入DNA拷貝數標準，抽真空。C.取出尼龍膜干燥后，紫外線固定。D.用PCRDIG標記試劑盒并參照試劑盒說明書制備DIG標記的特異性探針，探針為"實施例1步驟C中所獲得的BA46cDNA。PCR擴增結束后，對PCR擴增產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外線下檢測PCR擴增產物，結果出現陽性條帶，表明探針標記成功。E.用DIG雜交檢測試劑盒并參照試劑盒說明書，在雜交爐中對各種rAAV病毒顆粒DNA進行DNA雜交。其中，rAAV/BA46的檢測結果如圖4所示，rAAV/BA46的病毒滴度為10"-1012拷貝/mL，三種rAAV/mBA46的病毒滴度均為為1()U-l(^拷貝/mL。實施例3、腫瘤抗原導入單核細胞-巨噬細胞-樹突狀細胞系的殺滅腫瘤實驗材料及其來源A.rAAV病毒rAAV/BA46和rAAV/mBA46(rAAV/AmBA46、rAAV/BmBA46、rAAV/CmBA46)。B.AIM-V細胞培養基購自美國Invitrogen公司。C.細胞因子集落細胞刺激因子(GM-CSF)，白細胞介素2，4，7(IL-2，4，7)以及腫瘤壞死因子(TNF-a)購自美國R&D公司。一、殺滅腫瘤實驗如圖5所示，將本發明一種或多種攜帶腫瘤抗原基因(BA46基因及其突變型基因)的rAAV病毒感染腫瘤患者單核細胞為基礎的殺滅腫瘤實驗的整個過程包括以下步驟:A.取腫瘤患者50-150毫升外周血，用血細胞分離儀(或淋巴細胞分離液)按常規方法獲取外周血單個核細胞(PBMC)，與AIM-V培養基混勻后，加入細胞培養瓶，置于恒溫二氧化碳培養箱中培養2小時。B.除去懸浮細胞，保留貼壁細胞(單核細胞，monocyte,Mo)。懸浮細胞即外周血淋巴細胞，將其與AIM-V培養基混勻后，繼續培養備用。C.加入一種(或多種，效果更佳)本發明實施例2獲得的rAAV病毒，加入量約為100-1000M0I,同時再加入GM-CSF(800IU/mL)，繼續培養4小時。D.除去舊培養基，補充含GM-CSF，IL-4(800IU/mL)以及TNF-a(20IU/raL)的AIM-V培養基，繼續培養。E.培養5天后，收獲成熟的樹突狀細胞(DC)，并與所培養的外周血淋巴細胞混合，在AIM-V培養基中加入IL-2(20IU/mL)以及IL-7(500IU/mL)，繼續培養。F.培養至7-9天后，收獲激活的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)進行檢測。二、樹突狀細胞(DC)和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的檢測A.rAAV感染外周血單個核細胞的效率檢測采用常規的熒光抗體標記染色法，用針對腫瘤抗原-BA46的特異性熒光抗體(購自美國BD公司)標記步驟一獲得的被本發明rAAV感染的單核細胞或未成熟的DC，再進行流式細胞儀檢測陽性細胞的數量。其中，重組腺相關病毒rAAV/BA46感染外周血單個核細胞的效率檢測結果如圖6所示，rAAV/BA46感染外周血單個核細胞的效率約91%，所構建和制備的各種攜帶腫瘤抗原基因的rAAV(rAAV/AmBA46、rAAV/BmBA46、rAAV/CmBA46)感染外周血單核細胞的效率均約為90%左右，即約百分之九十的外周血單個核細胞可被rAAV病毒感染，證明本發明的rAAV具有較高的感染效率。B.樹突狀細胞(DC)的CD分子水平的檢測DC表達CD80、CD83以及CD86的水平與DC的功能呈正相關。用與步驟A相同的檢測方法，即分別采用熒光標記的針對這三種CD分子的抗體(購自美國BD公司)對步驟一獲得的DC表達CD80、CD83以及CD86的水平進行檢測，以BA46蛋白刺激的DC以及無刺激的DC為對照。其中，重組腺相關病毒rMV/BA46感染的DC表達CD80、CD83以及CD86水平的檢測結果如圖7所示，被rAAV/BA46及其它攜帶腫瘤抗原的rAAV(rAAV/AmBA46、rAAV/BmBA46、rAAV/CmBA46)感染的DC所表達的CD分子水平明顯高于對照，證明構建和制備的攜帶腫瘤抗原-BA46及其突變型基因的rAAV感染外周血單個核細胞后，所誘導的DC的功能強大。C.細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表達的y干擾素(IFN-y)水平的檢測CTL的功能及其殺傷腫瘤細胞的能力與IFN-y的表達水平呈正相關。用與步驟A類似的方法檢測被本發明rAAV感染的DC所誘導的CTL表達IFN-y的水平(以無刺激的DC所誘導的CTL為對照。)，DC與外周血淋巴細胞混合培養結束后，收獲細胞，采用傳統的胞內染色法進行細胞熒光染色標記，所用抗體為針對IFN-y的熒光標記抗體(購自美國BD公司)，最后利用流式細胞儀檢測結果。其中，被rAAV/BA46感染的dc所誘導的ctl的ifn-y表達水平如圖8所示，被rAAV/BA46及其它攜帶腫瘤抗原的rAAV(rAAV/AmBA46、rAAV/BmBA46、rAAV/CmBA46)感染的DC所誘導的CTL表達IFN-y的水平明顯高于對照，證明被本發明構建和制備的攜帶腫瘤抗原-BA46基因及其突變型基因的rAAV感染的DC所誘導的CTL功能強大。D.細胞毒性T淋巴細胞(CTL)殺傷腫瘤細胞試驗混合培養結束后，將步驟一中被rAAV(rAAV/BA46、rAAV/AmBA46、rAAV/BraBA46、rAAV/CmBA46)感染的DC所誘導的細胞毒性T淋巴細胞按20:1(淋巴細胞:腫瘤細胞)與人乳腺癌細胞混合后，采用傳統的MTT法和"Cr(鉻-51)殺傷試驗，檢測CTL殺傷腫瘤細胞的活性。其中被rAAV/BA46感染的DC所誘導的CTL的腫瘤細胞殺傷率統計結果如圖9所示，與蛋白抗原刺激DC所誘導的CTL(GST-BA46蛋白，乳腺癌細胞裂解物lysate)相比較，被本發明rAAV感染的DC誘導產生的CTL能夠更有效地裂解(殺傷)腫瘤細胞，殺傷率可近60%。將HLAI類抗原的抗體封閉乳腺癌細胞，再進行殺傷試驗，結果表明腫瘤細胞幾乎未被殺傷，故表明此殺傷腫瘤細胞的作用具有HLAI類抗原限制型。以BA46陰性的宮頸癌、結腸癌、肺腺癌細胞為對照，再用上述相同的方法檢測步驟一中被rAAV(rAAV/BA46、rAAV/AmBA46、rAAV/BmBA46、rAAV/CmBA46)感染的DC所誘導的細胞毒性T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞的特異性。其中，rAAV/BA46感染的DC所誘導的CTL的腫瘤細胞殺傷特異性檢測結果如圖9所示，被本發明構建和制備的攜帶腫瘤抗原-BA46及其突變型基因的rAAV感染的DC所誘導的CTL對BA46陰性的癌細胞無殺傷作用，證明被本發明構建和制備的攜帶腫瘤抗原-BA46基因及其突變型基因的rAAV感染的DC所誘導的CTL具有抗原特異性，即對抗原陰性的細胞無殺傷作用。上述檢測結果表明，被本發明攜帶腫瘤抗原-BA46基因及其突變型基因的rAAV感染的DC(統稱為rAAV-DC)所誘導的CTL對乳腺癌具有較好的療效，可用于制備抗腫瘤藥物。實施例4、腫瘤治療的臨床實驗一、療效及存活時間檢測應用重組腺相關病毒-樹突狀細胞技術，即將實施例3中被本發明rAAV(rAAV/BA46、rAAV/AmBA46、rAAV/BmBA46禾BrAAV/CmBA46)中的一種或兩種感染的DC(rAAV-DC)所誘導的CTL回輸10例乳腺癌患者，輸注量為1X109-5X109。治療療程通常為6個月，每月2-3次，病情改善后可減為每月1-2次，進一步可減為每l-3月治療一次。治療效果(rAAV-DC治療后的反應)統計結果如表l所示(B:血清腫瘤標志物減少或消失。Q:病人生活質量改善。如疼痛減輕或消失，食欲增加等等。C:CTorPET-CT顯示癌癥病灶或轉移病灶明顯減小或消失。)，不良反應多數病例治療后短時間內會出現輕度流感樣反應，但病人均能承受，且癥狀短期內消失，沒有觀察到嚴重不良反應及毒性反應。療程及生存時間統計結果如表2所示(治療后已存活時間病人開始接受rAAV-DC治療后的存活時間(已經死亡病例計算至死亡時)。)，死亡病例均非因rAAV-DC治療引起，本組病人大多數處于癌癥終末期，部分病人已經因過度放化療造成免疫功能、肝腎功能衰竭。上述統計結果進一步證明，被本發明的rAAV感染的DC(統稱為rAAV-DC)所誘導的CTL在患者體內能夠發揮一定的療效，可有效地抑制惡性腫瘤細胞的生長或者殺滅腫瘤細胞，且安全性較高，可用于制備抗腫瘤藥物。表1用重組腺相關病毒-樹突狀細胞技術(rAAV-DC)治療10例乳腺癌患者的療效的統計結果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>二、腫瘤患者治療前后影像學方面和血清腫瘤標志物方面的變化情況A、腫瘤患者治療前后影像學方面的變化情況對步驟一中的10例乳腺癌患者治療前后轉移病灶變化情況進行影像學觀測，其中一例IV期轉移性乳腺癌患者經rAAV/BA46感染的DC所誘導的CTL治療前后轉移病灶變化情況的影像學觀測結果如圖10所示，結果經本發明rAAV(rAAV/BA46、rAAV/AmBA46、rAAV/BmBA46禾BrAAV/CmBA46)中的一種或兩種感染的DC(rAAV-DC)所誘導的CTL治療后，患者的轉移病灶明顯消失，進一步證明，被本發明的rAAV感染的DC所誘導的CTL在患者體內可有效地抑制惡性腫瘤細胞的生長或者殺滅腫瘤細胞，可用于制備抗腫瘤藥物。B、治療前后患者血清中腫瘤相關抗原水平的變化情況采用實施例3中的熒光抗體標記染色法檢測步驟一中的10例乳腺癌患者治療前后血清中CA27.29腫瘤相關抗原的水平(數據來源于實驗醫院的檢測結果)，其中四例經rAAV/BA46感染的DC所誘導的CTL治療前后乳腺癌患者血清中CA27.29腫瘤相關抗原水平的變化情況如圖11所示，結果經本發明rAAV(rAAV/BA46、rAAV/AmBA46、rAAV/BmBA46和rAAV/CmBA46)中的一種或兩種感染的DC(rMV-DC)所誘導的CTL治療后，其血清中腫瘤抗原CA27.29水平均明顯下降，表明患者體內瘤負荷量明顯降低(腫瘤細胞明顯減少)，進一步證明，被本發明的rAAV感染的DC所誘導的CTL在患者體內可有效地抑制惡性腫瘤細胞的生長或者殺滅腫瘤細胞，可用于制備抗腫瘤藥物。1權利要求1、一種BA46重組腺相關病毒載體，是將腺相關病毒載體中的腺相關病毒結構基因替換為乳汁蛋白BA46基因或其突變型基因得到的重組腺相關病毒載體。2、根據權利要求1所述的BA46重組腺相關病毒載體，其特征在于將所述重組腺相關病毒載體中的p5啟動子替換為巨噬細胞病毒啟動子、beta肌動蛋白啟動子和SV40病毒啟動子中的一個或幾個啟動子。3、一種構建權利要求1所述BA46重組腺相關病毒載體的方法，是先將腺相關病毒載體中的腺相關病毒結構基因剔除，再用乳汁蛋白BA46基因或其突變型基因取代該剔除基因，得到重組腺相關病毒載體。4、根據權利要求3所述的構建方法，其特征在于所述方法還包括將所述重組腺相關病毒載體中的p5啟動子替換為巨噬細胞病毒啟動子、beta肌動蛋白啟動子和SV40病毒啟動子中的一個或幾個啟動子的步驟。5、與權利要求1所述BA46重組腺相關病毒載體相關的產品，包括重組腺相關病毒質粒、重組腺相關病毒顆粒和被重組腺相關病毒載體感染或轉染的細胞系。6、根據權利要求5所述的產品，其特征在于所述細胞系包括單核細胞-巨噬細胞-樹突狀細胞系和T淋巴細胞系。7、權利要求1或2所述的BA46重組腺相關病毒載體在制備抗腫瘤藥物中的應用。8、權利要求5或6所述的產品在制備抗腫瘤藥物中的應用。9、根據權利要求7或8所述的應用，其特征在于所述腫瘤為乳腺癌。10、一種體外殺滅腫瘤的方法，包括以下步驟1)將腫瘤所在體系中自然產生的單核細胞-巨噬細胞-樹突狀細胞或T淋巴細胞被權利要求1或2所述的攜帶野生型乳汁蛋白BA46基因的重組腺相關病毒載體和/或攜帶突變型乳汁蛋白BA46基因的重組腺相關病毒載體感染或轉染，或被權利要求5或6所述的產品處理，各自得到處理后的細胞；2)將步驟1)中處理后的單核細胞-巨噬細胞-樹突狀細胞加入腫瘤所在體系中殺滅腫瘤；或將未被處理的T淋巴細胞與所述處理后的單核細胞-巨噬細胞-樹突狀細胞混合培養形成抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞，再將該抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞加入腫瘤所在體系中殺滅腫瘤；或將被處理的T淋巴細胞和未被處理的單核細胞-巨噬細胞-樹突狀細胞加入腫瘤所在體系中殺滅腫瘤。全文摘要本發明公開了一種BA46重組腺相關病毒載體及其構建方法與其應用。該BA46重組腺相關病毒載體是將腺相關病毒載體中的腺相關病毒結構基因替換為BA46基因或其突變型基因得到的重組腺相關病毒載體。本發明的BA46重組腺相關病毒載體可將其攜帶的野生型或突變型的BA46基因輸送入單核細胞-巨噬細胞-樹突狀細胞系中，攜帶有這些特異性抗原基因的細胞被用于刺激免疫系統的效應細胞。實驗證明，被本發明的rAAV感染的DC所誘導的CTL在患者體內可有效地抑制惡性腫瘤細胞的生長或者殺滅腫瘤細胞，因而，本發明的BA46重組腺相關病毒載體或與本發明BA46重組腺相關病毒載體相關的產品可被用于制備乳腺癌治療藥物。文檔編號C12N15/12GK101307330SQ20081009322公開日2008年11月19日申請日期2008年4月23日優先權日2007年4月23日發明者保羅·L·赫蒙納特,勇劉申請人:廣州博沃津生物技術有限公司